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Daxx反义寡核苷酸在全脑缺血／再灌损伤中作用机制的研究目的檢测Daxx反义寡核苷酸在大鼠海马全脑缺血/再灌介导的神经元损伤中作用机制的研究。
方法采用SD大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，于缺血前连续3d脑室注射Daxx反义寡核苷酸，用免疫印迹方法研究Daxx反义寡核苷酸在大鼠海马全脑缺血/再灌介导的神经元损伤中对Daxx/Ask1信号通路的影响。
结果在海马的CA1区，Daxx反义寡核苷酸可以明显抑制脑缺血介导的Daxx的核转位以及Ask1磷酸化的升高。
结论缺血前3d连续脑室注射Daxx反义寡核苷酸可以明显抑制Daxx/Ask1介导细胞信号转导通路。
标签：脑缺血/再灌；反义寡核苷酸；Daxx；Ask1脑血管疾病是神经系统的常见病，因此研究其发病的分子机制具有极其重要的意义[1]。
死亡结构域相关蛋白（death domain associated protein，Daxx）在核内作为转录调控子发挥促凋亡作用[2]，在各种凋亡刺激下，Daxx可以从胞核转移到胞浆中，从而启动不同的细胞信号转导通路引起细胞的凋亡。
凋亡信号调节激酶1（Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）是MAPKKK家族中的一个成员，可以分别激活MKK4/7-JNK和MKK3/6- p38信号通路[3-5]而引起细胞的凋亡。
在脑缺血信号转导中ASK1信号级联反应是重要的致凋亡信号通路[6-8]。
1 资料和方法1.1一般资料雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠，250～300g，清洁级，由徐州医学院实验动物中心和中科院上海实验动物中心提供。
1.2 SD大鼠脑缺血/再灌模型的建立按本室已建立的大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，实验动物有机分为假手术组、缺血/再灌组、溶剂对照组和给药组。
动物以20%水合氯醛（300～350mg/kg）腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。
手术第2d动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血15min，然后再灌注不同时间。
Survivin反义寡核苷酸对K562细胞耐药性的研究的开题报告题目：Survivin反义寡核苷酸对K562细胞耐药性的研究一、研究背景细胞耐药性是肿瘤化疗失败的一个主要原因。
目前，针对肿瘤细胞耐药性的研究日趋成熟，其中Survivin作为一种重要的抗凋亡蛋白，在抗肿瘤过程中发挥了关键的作用。
Survivin是一种含有BIR（Baculovirus IAP Repeat）结构域的蛋白，它可以结合Caspase3、Caspase7等凋亡因子，从而抑制细胞凋亡。
Survivin在大多数癌细胞中高表达，并与肿瘤的恶性程度、患者预后相关。
因此，治疗肿瘤时抑制Survivin表达是一种被普遍研究的策略。
二、研究目的本研究旨在探讨Survivin反义寡核苷酸对K562细胞的耐药性和生长抑制作用。
三、研究方法1.细胞株和培养条件：将K562细胞分别在RPMI 1640中加入10%的胎牛血清、100 μg/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素，细胞密度为10^5/mL， culturing at 37 ℃ in 5% CO2；2. Survivin siRNA设计和合成：根据Survivin mRNA序列设计并合成Survivin siRNA，经基因测序实验室验证；3. 细胞转染：通过脂质体法将Survivin siRNA转染至K562细胞中；4. Western blot：Western blot沉淀K562细胞清液，运用Survivin，Bcl-2，Bax，Caspase3等蛋白抗体进行Western blot分析和定量；5. CELLS Counting Kit-8（CCK-8）细胞活性检测，采用K562细胞，利用CCK-8检测几个时间点（12h、24h、48h）下细胞的生长状态；6. 流式细胞术分析：采用Annexin V-FITC/PI染料，分析K562细胞在Survivin siRNA转染下的凋亡情况。
反义寡核苷酸药物在神经系统疾病治疗中的研究与应用
胡祎瑄;周子凯
【期刊名称】《中国医药导刊》
【年(卷),期】2024(26)4
【摘要】神经系统疾病的病因及病理机制复杂且研究难度大,靶点发现及相应的药物研发困难。
随着基因组及转录组测序等技术的发展,有关神经系统疾病的遗传形式、非遗传性或散发性神经系统疾病的靶点发现及分子机制取得了有效进展。
基于转录组靶点发现的小核酸药物研发为神经系统疾病的新药开发领域提供了一种新的思路。
反义寡核苷酸药物属于小核酸药物的一种,相比于以蛋白为靶点的传统小分子药或抗体药物,靶向mRNA的反义寡核苷酸具有候选靶点范围大、药物靶点筛选快、研发成功率高等优点。
目前,反义寡核苷酸药物在神经退行性疾病领域的治疗广受各药物研发企业重点关注,具有良好临床应用前景。
本研究总结反义寡核苷酸药物在多种神经系统疾病治疗中的研究与应用,回顾其作用机制、研发优势以及结构修饰方法的发展,并探讨用于治疗神经系统疾病的反义寡核苷酸药物临床用药及研发的最新进展,旨在为神经系统疾病、尤其是罕见病及难治病的新药研发提供借鉴和参考。
【总页数】8页(P345-352)
【作者】胡祎瑄;周子凯
【作者单位】中国科学院上海药物研究所;中国科学院大学;中科中山药物创新研究院
【正文语种】中文
【中图分类】R971
【相关文献】
1.反义寡核苷酸类药物治疗神经系统疾病的基础研究
2.神经系统疾病治疗药物的研究进展和合理应用——神经系统疾病合理用药专家圆桌会议纪要
3.反义寡核苷酸药物在精准治疗中的应用进展及其作用机制
4.尼古丁药理学作用机制及在神经系统疾病治疗中的应用研究进展
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反义寡核苷酸技术及其在NMDA受体亚单位研究中的应用滕大才;徐铁军;张凤真【期刊名称】《解剖科学进展》【年(卷),期】2004(10)3【摘要】反义寡核苷酸技术是利用碱基互补配对的原则 ,设计一段寡脱氧核苷酸 ,与靶序列特异结合 ,从而抑制基因表达 ,降低mRNA和 /或蛋白质水平 ,影响动物的后续生物效应。
反义寡核苷酸技术作为一种快速、特异性阻断基因表达的方法 ,近二十年来取得迅速发展 ,其潜在应用价值巨大。
特别是近年来在对NM DA受体领域的反义研究 ,越来越得到人们的重视。
本文就反义寡核苷酸技术及当前反义寡核苷酸技术在NMDA受体亚单位研究中的应用进行阐述。
【总页数】5页(P248-252)【关键词】反义寡核苷酸;NMDA受体亚单位;作用机理;实验设计;基因表达【作者】滕大才;徐铁军;张凤真【作者单位】徐州医学院人体解剖学教研室【正文语种】中文【中图分类】R394【相关文献】1.NMDA受体亚单位NR2A在凝血酶诱导的脑出血后脑损伤中的研究 [J], 吴保鑫;侯玉超;沈霞;花放;张丽;崔桂云2.C末端缺失NR2B亚单位表达载体的构建及其在NMDA受体装配研究中的应用[J], 杨巍;罗建红;高英;黄曼;郑婵颖3.NMDA受体2B亚单位反义寡核苷酸对缺血性脑损伤影响的实验研究/电针对脊髓损伤后星形胶质细胞增生的影响/微囊化兔坐骨神经组织移植对大鼠脊髓损伤后神经元凋亡的影响/微囊化异种坐骨神经组织细胞移植对大鼠脊髓损伤后生长相关蛋白-43表达的影响 [J],4.铅对钾通道亚单位和NMDA受体亚单位的影响 [J], 阮迪云5.NMDA受体2B亚单位反义寡核苷酸对缺血性脑损伤影响的实验研究 [J], 滕大才因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Morpholino的设计及使用发育生物学家们（他们所使用的模型动物在遗传学方面的研究往往还不完善，当然有的动物已经研究得很完善了）所面临的很重要的问题之一是如何在生物体发育时期抑制他们所感兴趣的基因的活动——这样一来生物学家们就可以研究这个基因的正常的生物学功能了。
一项被广泛接受的方法是反义技术——尤其是反义寡核苷酸（morpholino，简称MO）技术。
在本文中，我们将简述该药物（指MO）的使用，并举例说明它们如何应用于发育机制的研究。
我们还将讨论怎样应用MO就会导致产生错误的结果——包括没能将目的基因靶向敲除，同时我们建议研究人员使用对照实验，这样就能对MO实验作出正确的解释。
简介为了理解发育早期的分子机制，发育生物学家们长期以来一直希望能有这样一种技术，即：可以在特定的发育时期、在特定的细胞中阻断特定的基因的表达。
这一目标目前还没有实现，尽管研究人员在小鼠胚胎上已经很接近这一最终目标了——他们使用的方法是靶向突变和Cre重组酶。
即便如此，仍有很多困难没有克服：试图干扰某一个基因的功能往往会对另一个基因产生不希望发生的“副作用”，而使用Cre重组酶则需要警惕Cre基因表达时所具有的潜在的毒性作用。
其它物种又如何呢？毫无疑问，对其它脊椎动物和无脊椎动物的研究已经深入到了研究在发育早期的基本机制的地步，而且与使用哺乳动物胚胎为研究对象相比，使用这些动物具有很多明显的优势——包括可接受性、成本、时间，此外这些动物本身就很令人感兴趣。
在所有这些动物中，目前都还没有建立常规的基因打靶技术。
尽管传统的遗传筛查技术在理解某一特定的过程方面具有不可估量的价值，但它既不能保证具体到特定的目的基因，也不能保证使生物体产生一种无效突变。
总之，研究人员需要一种能阻断基因功能的方法。
显性抑制方法有一定的应用价值，但不是最佳的选择。
最佳的选择是具备较高特异性的反义RNA 技术。
反义RNA技术不但可以用于脊椎动物，还可以应用于组织细胞中，而且它们在寻找新药方面正在发挥越来越大的作用。
反义寡核苷酸在肿瘤基因治疗中的研究
刘同华;张恩娟;张昭
【期刊名称】《中国药业》
【年(卷),期】1999(008)007
【摘要】基因治疗为彻底攻克肿瘤带来了新希望．反义技术是基因治疗的一个重要内容。
本文概述了近年来肿瘤反义基因治疗方面取得的一些实验成果．包括对某些癌基因(c-myc,c-myb,bcl-2,mdm2,ras家族)、肿瘤自分泌生长因子及其受体(TGFβ，IGF-I，IGF-IR)等所开展的反义基因治疗。
【总页数】3页(P6-8)
【作者】刘同华;张恩娟;张昭
【作者单位】第三军医大学新桥医院，重庆市400037
【正文语种】中文
【中图分类】R730.54
【相关文献】
1.CRISPR-Cas9基因编辑技术在肿瘤基因治疗中的研究进展 [J], 梅雯;杨勇琴;孙美涛;丁小倩;杨泽芳;张晓娟;熊伟
2.肿瘤基因治疗学研究:血管内皮生长因子反义寡核苷酸对小鼠Lewis肺癌生长的抑制 [J], 成小松;李春艳;王颖;李曦;李景鹏
3.端粒酶研究在实体瘤诊治中的应用 : 针对端粒酶进行肿瘤基因治疗可能会引起肿瘤基因治疗的一场革命 [J], 李德志;陈正堂
4.超声靶向微泡破坏在肿瘤基因治疗中的应用现状及研究进展 [J], 张波; 王琳萍
5.化学修饰mRNA在细胞重编程、组织工程和肿瘤基因治疗中的研究进展 [J], 谢路远; 盛小伍; 周晓; 姚超灵; 许安吉
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反义寡核苷酸序列反义寡核苷酸序列指的是一种与原始DNA或RNA序列有相反碱基配对的寡核苷酸序列。
在这种反义序列中，腺嘌呤（A）被胸腺嘧啶（T）取代，而胸腺嘧啶（T）则被腺嘌呤（A）取代；鸟嘌呤（G）被胞嘧啶（C）取代，而胞嘧啶（C）则被鸟嘌呤（G）取代。
反义寡核苷酸序列对于生物学和分子生物学领域具有重要意义。
其主要作用是在实验室中研究DNA和RNA的结构和功能，以及相关的分子机制。
在以下的几个方面我们可以看到反义寡核苷酸序列的应用。
1.基因工程：反义寡核苷酸序列可以通过DNA合成技术用于基因的修饰和重组。
通过引入反义寡核苷酸序列，可以修改目标基因的序列，并改变编码的蛋白质的氨基酸序列。
这种技术可以用来研究蛋白质的结构和功能。
2.基因表达调控：反义寡核苷酸序列可以用于基因表达的调控。
通过引入与目标基因相反的序列，可以抑制目标基因的表达。
这种技术被广泛应用于基因沉默（gene silencing），研究基因功能和调控机制。
3. RNA干扰：反义寡核苷酸序列也可以用于RNA干扰（RNA interference）。
这是一种通过引入小分子RNA序列来沉默目标基因的技术。
反义寡核苷酸序列可以与目标RNA序列互补配对，并引起RNA 降解或抑制翻译过程，从而抑制目标基因的表达。
4.抗病毒治疗：反义寡核苷酸序列可以用于抗病毒治疗。
病毒的基因组是RNA，通过设计与病毒基因组相反的寡核苷酸序列，可以特异性地结合病毒RNA，并阻断病毒蛋白质的合成和病毒复制过程，从而实现抗病毒治疗的效果。
总结起来，反义寡核苷酸序列在生物学和分子生物学领域具有广泛的应用。
通过对基因序列的修饰和调控，它们可以用来研究基因功能和调控机制。
在抗病毒治疗和基因沉默等方面，反义寡核苷酸序列也有着重要的应用潜力。
在未来的研究中，我们可以期待更多关于反义寡核苷酸序列的应用和发展。
乳腺癌反义寡核苷酸治疗的研究进展反义寡核苷酸技术(ASODN)作为一种新的分子生物学工具及新型药物受到医疗界越来越多的关注。
许多反义药物作为抗肿瘤药物已进入临床试验，并取得了令人欣喜的效果。
1 反义寡核苷酸的作用机理简介1.1反义寡核苷酸是在体外人工合成的能与体内某RNA或DNA序列互补结合的短序列单链DNA。
它可以作为反义药物与细胞内特异的靶序列互补,从而抑制基因表达。
该技术的作用原理主要通过下列途径发挥作用：（1）ASODN与DNA结合，抑制DNA复制和转录，它通过在DNA结合蛋白的识别点处与DNA双螺旋结合形成三螺旋，阻止基因的转录和复制。
(2) ASODN可影响真核生物mRNA核内加工的步骤，如5’端加帽结构、3’端加polyA及剪接的过程，从而抑制了mRNA的成熟过程。
(3)ASODN与目标mRNA特异性碱基互补结合，阻断RNA加工、成熟，阻止核糖体与起始因子的结合，影响核糖体沿mRNA移动，从而阻止翻译。
1.2天然的ASODN能够很快被在细胞内存有的大量的核酸外切酶和核酸内切酶降解。
因此，ASODN必须要经过修饰才能在体内发挥作用。
研究表明，硫代修饰之后的ASODN稳定，具有良好的水溶性，并容易大批量人工合成来应用于临床的研究。
所以，目前硫代磷酸型的ASODN已应用于各个水平的研究领域中。
1.3反义寡核苷酸在乳腺癌的治疗研究中的应用主要通过抑制乳腺癌细胞生长、增殖、分化诱导凋亡，抑制乳腺癌细胞的转移和侵袭，降低乳腺癌的多药耐药性来实现。
1.4反义基因技术具有明显的优点，由于DNA序列在一般情况下是单拷贝，而mRNA是多拷贝，因此ASODN相比于反义RNA只需少量的ODN与DNA靶序列结合，就可以具有很强的抑制效果。
它治疗乳腺癌特异性高，副作用少，与化疗、放疗和靶向药物结合有协同作用，并已逐步从实验室走向临床。
2 针对主要的进入临床前试验的致乳腺癌基因的反义寡核苷酸的研究理论上认为任何致乳腺癌基因都可以成为ASODN的作用靶点，目前主要以细胞凋亡抑制基因、乳腺癌转移和血管生成基因、生长因子及受体、信号传导通路等作为常用的分子靶点。
antivirals that inh ibit cytom egalovirus,antivirals that inh ibit herpesvirus and antivirals that inh ibit influenza virus.T h is review discusses their pharm aco logical p roperties,m ain adverse drug reac2 ti ons,therapeutic use and introduces som e advances in the research of antivirals.Key words A ntiviral agents Pharm aco logical p roperties T herapeutic use(收稿:1998207220,修回:1998211209)第二代反义寡核苷酸的研究Ξ朱冬晖 魏东芝(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 生物化学研究所 上海 200237)摘 要 第一代反义核酸寡核苷酸硫代磷酸酯,是目前研究最广泛、最成熟的反义核酸药物,已进入临床试验阶段,但其具有一定的毒副作用;第二代反义核酸,包括嵌合寡核苷酸、杂合寡核苷酸等,是在硫代寡核苷酸的基础上,再引入其它的修饰基团,从而提高其生物活性,减少毒副作用。
本文着重介绍了第二代反义核酸的生物物理学性质,药动学及其与第一代反义核酸毒性的比较。
关键词 反义寡核苷酸 化学修饰 生物物理学 药物动力学 副作用 反义寡核苷酸通过序列特异地与靶m RNA结合而抑制基因表达,从而可以成为一类理想的、在基因水平调控的治疗药[1,2]。
因具有较好的抗酶解活性,寡核苷酸硫代磷酸酯(p ho spho ro th i oate o ligonucleo tides, PS2ODN s),已成为目前最广泛研究的寡核苷酸类似物之一,并已应用于临床[3]。
《反义药物的研究》专业：制药工程班级：121班姓名：陈子阳学号：20120934105摘要：反义药物又称反义寡核苷酸药物。
近年来人们通过对反义寡核苷酸药物研究，发现反义寡核苷酸在治疗重大疾病如癌症和病毒感染方面很有潜力。
但以反义寡核苷酸为基础的治疗受到很多因素的限制，如稳定性差，需要多次重复给药、细胞膜透过性差等。
本文从其含义和作用机理，研究历程，临床应用及现存问题和解决方法等诸方面对反义药物的研究进行了综述。
关键词：反义寡核苷酸反义药物一、反义药物的含义及作用机理反义核酸药物即反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，ODNs)其核苷酸序列可与靶mRNA或靶DNA互补，抑制或封闭该基因的转录和表达，或诱导RNaseH 识别并切割mRNA，使其丧失功能。
反义核酸药物是药理学的新领域或革命，即:新的药物——反义寡核苷酸；新的药物受体——mRNA；新的受体结合方式——Watson-Crick杂交；新的药物受体结合后反应：(1)RNaseH介导的靶RNA 的降解；(2)抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等众所周知，蛋白质在人体代谢过程中具有特别重要的作用。
不管是宿主性疾病（如肿瘤），还是感染性疾病（如AIDS，肝炎等），几乎所有的疾病都是由于产生了过量的或者是不适当的蛋白质所引起的。
传统药物主要直接作用手致病蛋白本身。
目前上市的药物中以受体为作用靶点的药物约占52％，以酶为作用靶点的药物约占22％，以离子通道为作用靶点的药物约占6％，以核酸为作用靶点的药物约占3％，其余尚不清楚。
可见，许多具有新药理学特性的化合物都是与蛋白质结合并使之失去功能。
例如，肾上腺素能受体阻断剂——右普萘洛尔（deXpropranolol），H2受体阻断剂——西咪香丁（cimehdine），钙通道阻滞剂——硝苯地平（nifedipine），血管紧张素转化酶抑制剂——雷米普利（ramipril）。
二、反义药物的研究历程2.1 第一代反义药物——硫代磷酸寡核苷酸（phospho－rothioate oligonucleotides，PS一ODNs）等PS－ODNs具有良好的水溶性、稳定性，易于大量合成，基本上能满足临床治疗的需要。
反义寡核苷酸（aso）实验方法反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）是一种具有反向互补碱基序列的寡聚核苷酸序列。
反义寡核苷酸通过与目标RNA 的特定区域序列互补结合，阻断RNA的转录、剪接、翻译或稳定性，从而通过抑制特定基因的表达来实现治疗目的。
在研究领域中，反义寡核苷酸也被广泛用于研究基因功能、疾病发生机制以及药物开发等方面。
实验方法：一、设计反义寡核苷酸序列设计反义寡核苷酸序列是使用反义寡核苷酸进行研究的第一步。
首先，需要选择目标基因的靶点序列。
最常见的靶点是靶向mRNA的编码区域，因为这对于阻断目标基因的蛋白质合成具有最高的效率。
接下来，需要通过一系列计算和筛选程序，选择反义寡核苷酸序列。
设计时需要考虑反义寡核苷酸的长度、GC含量、碱基组成和互补性等因素。
最有效的反义寡核苷酸序列应该具有高亲和力和特异性，同时应避免与非目标RNA序列的配对。
二、合成反义寡核苷酸合成反义寡核苷酸是实验的下一步。
反义寡核苷酸可以通过化学合成方法合成。
合成方法通常采用固相合成技术，其中核苷酸分子通过添加保护基和活性基团的方法，逐个添加到固相载体上。
合成出的反义寡核苷酸需要进行纯化和鉴定，以确保其合成质量和纯度。
三、体外细胞实验在体外细胞实验中，需要将反义寡核苷酸转染到目标细胞中。
转染方法包括化学转染、电转染和病毒载体介导转染等。
转染后，反义寡核苷酸被细胞摄取，并与目标RNA互补结合。
这种结合可以通过碱基配对识别机制实现，从而形成反义寡核苷酸与mRNA的双链结构。
双链结构的形成抑制了mRNA的翻译或通过RNA酶降解机制降解mRNA。
实验人员可以通过多种实验方法，如PCR、Western blot和细胞荧光染色等，验证目标基因的表达是否被抑制。
四、动物模型实验在动物模型中进行反义寡核苷酸的实验需要将合成的反义寡核苷酸注射到动物体内。
这可以通过不同的途径实现，如静脉注射、肌肉注射和腹腔注射等。
乳腺癌反义寡核苷酸治疗的研究进展引言乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，目前该疾病的发病率和死亡率不断上升，严重影响着女性的健康和生活质量。
目前，临床治疗乳腺癌的方法主要包括手术、化疗、放疗和内分泌治疗等，但是这些方法存在一定的缺点，如手术容易切除不充分，化疗和放疗会产生很多的副作用，而内分泌治疗则存在耐药性的问题。
因此，需要寻找一种新的治疗方法，提高乳腺癌的治愈率和生存率。
反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides）是一种新型的基因治疗方法，它通过向特定的基因或mRNA（信使RNA）的互补序列靶向结合，并干扰其翻译或剪接，从而实现基因的“沉默”或“敲除”，以达到治疗疾病的目的。
因此，乳腺癌反义寡核苷酸治疗在近年来得到了广泛关注和研究。
本文将从反义寡核苷酸的机制、研究进展和前景等方面进行探讨。
反义寡核苷酸治疗乳腺癌的原理乳腺癌发生和发展的过程中，许多基因和信使RNA的异常表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移密切相关。
反义寡核苷酸则是设计一条针对这些目标RNA的互补序列的寡核苷酸，与其靶向结合，并在结合后干扰其正常的基因表达。
在乳腺癌中，HER2基因的过度表达与肿瘤细胞的增殖和转移有关。
因此，许多研究者将反义寡核苷酸用于抑制HER2基因的表达，以达到治疗乳腺癌的目的。
具体而言，反义寡核苷酸结合HER2基因的mRNA，干扰其正常的翻译过程，从而降低HER2蛋白的表达水平，抑制癌细胞的增殖和转移。
反义寡核苷酸治疗乳腺癌的研究进展随着反义寡核苷酸技术的不断发展，越来越多的反义寡核苷酸被用于临床治疗乳腺癌。
以下将介绍一些具有代表性的研究成果：1. Trastuzumab-DM1的研究Trastuzumab-DM1是一种由抗HER2单克隆抗体Trastuzumab和细胞毒素DM1构成的复合物，可靶向HER2蛋白并诱导乳腺癌细胞凋亡。
研究者通过将Trastuzumab-DM1联合反义寡核苷酸治疗HER2过度表达的乳腺癌，发现这种联合治疗可显著抑制HER2基因的表达并抑制肿瘤细胞的增殖和转移。
反义寡核苷酸技术研究进展
吕艳秋;石刚刚
【期刊名称】《广东医学》
【年(卷),期】2006(27)8
【摘要】反义寡核酸技术，是应用反义寡核苷酸类药物通过Waston-Crick碱基
配对与细胞内核酸（DNA或RNA）特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平抑制特定基因表达的基因治疗技术，是一种新的药物开发方法。
其机制是：①反义寡核苷酸与靶mRNA结合形成DNA-RNA杂合分子，可以激活RNase H。
该
酶可以切割杂合分子中的RNA链，导致靶mRNA降解。
②不能激活RNase H活性的反义寡核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译：另外还可以通过封闭剪接位点有选择的促进蛋白某个可变剪接体的表达，从而纠正错误的剪接。
【总页数】3页(P1270-1272)
【作者】吕艳秋;石刚刚
【作者单位】汕头大学医学院药理教研室,广东,汕头,515041;汕头大学医学院药理
教研室,广东,汕头,515041
【正文语种】中文
【中图分类】R9
【相关文献】
1.反义寡核苷酸技术的研究进展与哮喘气道重塑的治疗 [J], 陈磊;王志强
2.反义寡核苷酸技术与纳米基因输送载体的基因治疗研究进展 [J], 李丹
3.反义寡核苷酸治疗Duchenne型肌营养不良的研究进展 [J], 张竹君(综述);李茜茜(审校)
4.反义寡核苷酸应用于脑部疾病治疗的研究进展 [J], 李云凤;孟艳秋;徐亮
5.反义寡核苷酸在中枢神经系统退行性疾病中的作用研究进展 [J], 孙姜瑾;李鸣;刘亚奇
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・综 述・反义寡核苷酸设计策略与学习记忆研究熊 鹰 蔡文琴 李希成 隋建峰 反义核酸是指与体内某RNA或DNA序列具有互补顺序,并能通过碱基配对与互补链杂交,从而影响其转录或翻译过程的RNA或DNA片段。
反义RNA和DNA的特异性源自反义序列和靶序列之间的碱基配对。
反义核酸的长度可长可短,长的反义核酸一般都借助表达载体导入细胞,通过在细胞中进行转录而实现功能。
反义寡核苷酸(an tisen se o ligodeoxynucleo tides,ODN)是短序列的单链DNA,在体外通过化学合成,与细胞内特异的靶序列互补。
ODN比通过表达载体导入的方式应用广泛,而且由于它可以作为反义药物应用于临床,因此,ODN的研究已引起了广泛的重视[1,2]。
Ξ一、反义ODN的作用机理及设计策略反义ODN主要通过以下途径发挥作用:(1)抑制翻译[3、4].反义ODN通过与目标mRNA发生碱基特异性互补结合,形成杂交双链体,阻止核糖体与重要起始因子结合,使其不能启动翻译;一般以针对翻译起始区的ODN效果最佳,在此区域内可直接抑制翻译起始复合物与mRNA起始位点结合。
(2)抑制转录后加工.真核生物mRNA的核内加工包括5’端加帽结构、内部甲基化、3’端加po lyA及剪接等,最后转运到胞质成为成熟的mRNA,反义ODN可影响其中的任一环节。
(3)抑制DNA复制和转录.反义ODN通过在DNA结合蛋白的识别位点处与DNA双螺旋结合形成三螺旋,阻止基因的转录和复制,又称为反基因ODN。
理论上,反基因策略具有明显优点,因为DNA序列一般是单拷贝,较之mRNA的多拷贝,只需少量的ODN与DNA靶序列结合,即可达到较强的抑制效果。
但这种策略有一定的局限性,在三聚体中其靶序列不易寻找,而且,ODN进入核内需要通过更多的屏障,并且可能造成非特异性杂交,甚至基因突变[5]。
反义ODN的设计策略主要考虑以下几方面[1、2、6、7、8]: (1)特异性反义ODN与靶核酸之间的特异性一方面与其长度和顺序有关,另一方面与活细胞中基因组和mRNA的复杂性有关。
此外,针对某些序列的ODN本身也可能发生内部碱基互补形成发夹样结构,设计时应予考虑。
(2)ODN长度从杂交链的稳定性来看,ODN越长越好,但过长时,不易通过细胞膜,而且与非靶序列结合机率增加,会引起非特异抑制作用。
一般认为ODN的长度以15～25个碱基较为合适。
(3)化学修饰未修饰的ODN易被核酸酶降解,而且不易被细胞摄取。
化学修饰包括主链修饰和末端修饰,其中主链修饰包括对磷酸、糖环和碱基的修饰及寡核苷酸构型的改变。
末端修饰主要是对末端疏水基团的修饰,从而有助于寡核苷酸进入靶细胞。
S2ODN均有较强的抗核酸酶的能力,能在较低的浓度下诱导RN ase H的活性,合成和纯化容易,水溶性较高,因而应用最广泛。
(4)亲和性ODN对靶序列的亲和力来自相互杂交作用。
结合的自由能来自两个主要方面:形成双螺旋的氢键和碱基堆积。
由于GC之间的亲和力比AU之间的亲和力大,因此,增加针对GC的靶序列的碱基在ODN 的比例,可增加其杂交亲和性,而适当减少ODN的长度。
(5)异抑制效应及是否存在副作用。
以往的实验常用正义链(sen se)作对照,现在一般采用无义(m issen se)或反向(re2 verse)作对照。
二、反义ODN在学习记忆研究中的应用现代分子生物学技术使研究者发现越来越多的基因在中枢神经系统表达。
然而,我们对于这些基因的功能了解很少或者根本不了解。
反义寡核苷酸技术能够有效的探讨这些基因的作用。
R ickm an同时使用了转基因Knockou t和反义knockdow n技术研究trkb配基在视网膜神经元发育中的作用,反义knockdow n技术避免了trkb转基因操作的一些缺点,尤其是转基因小鼠出生后极低的存活率。
Robertson认为反义途径比转基因技术有很多优越性,如应用范围广、具有可逆性和解剖特异性、没有复杂的发育问题以及花费较低等[2]。
学习记忆的研究需要弄清特异脑区的分子机制和由学习产生的行为修饰的因果关系,采用传统的神经电生理和生化的方法,搞清这一关系较为困难。
现在通过转基因小鼠和反义核酸两个途径使我们能够研究特异的基因在学习记忆过程中的作用。
本文综述反义ODN在学习记忆研究中的应用。
1.研究快反应基因在记忆中的作用快反应基因(i m m ediately early genes,IEGs)具有把短时程作用的细胞外信号和细胞功能的长时程改变耦联起来的作用。
长时记忆的形成依赖脑内RNA和蛋白质的合成,而这些与记忆相关的蛋白是由IEGs启动细胞内特异的目的基因(迟反应基因)表达的产物,有假说认为,细胞外信号激活胞浆第二信使(Ca2+,c AM P,IP3等),后者再激活IEGs的表达,进而启动目的基因的表达而形成长期记忆[9、10]。
快反应基因fo s和jun家族的表达产物是转录调节蛋白。
它们通过形成二聚体复合物调节靶基因的表达。
在哺乳动物中枢神经系统,c2fo s,c2jun以及其它IEGs的表达可被各种刺激包括长时程增强(L T P)、长时程抑制(L TD)以及行为训练等诱导[9]。
在分辨训练以后大鼠边缘系统的c2fo s表达增多;Y迷宫训练后,大脑皮层c2jun mRNA表达明显增多;A nokh in等的实验表明小鸡c2fo s和c2jun的表达在辨别学习和被动回避学习以后增多;H eu rteaux则证实小鼠海马c2jun mRNA在食物压杆操作学习后表达增强[10～14]。
理论上可用Fo s、Jun蛋白抗体来阻断其作用来研究Fo s、Jun的生理功能,但Fo s,Jun抗体不易进入细胞,特异性也不高,而IEGs反义ODN较易进入细胞且具有高选择性,对于c2fo s、c2jun等确切功能的研究是一种理想的手段。
T ischm eyer(1994)[15]研究了反义c2jun和jun2B ODN 对大鼠明暗分辨学习的影响。
反义c2jun S2ODN的序列: T GCA GTCA TA GAA C,反义jun2B:T T TCGT GCA CA TCC。
反义c2jun对照:T GCA CT GA TA CAA C。
双侧海马埋管,・37・中国行为医学科学1999年第8卷第1期2mM Λl的S2ODN间隔8h在两侧海马注射,在最后一次注射后2h,首先观察大鼠的开场行为(open field),然后进行分辨训练。
大鼠在24h、48h、72h进行重复训练。
结果,反义c2 jun S2ODN海马内注射显著损害大鼠明暗分辨学习的完成,而反义jun B S2ODN无明显影响。
N o rthern杂交分析表明,训练后jun2B mRNA在海马和大脑皮层的表达增加2～3倍,而c2jun mRNA的表达只在大脑皮层增加。
35S标记的硫代ODN(S2ODN)在海马锥体细胞的大部分以及齿状回颗粒细胞有分布。
靠近注射位点的胼胝体纤维和皮质区也有强烈标记。
在F ITC标记的S2ODN注射后26h,在海马锥体细胞以及注射位点周围仍然可观察到强烈的信号。
海马内注射反义c2jun S2ODN的行为效果是由于降低了c2jun的稳定表达,而不是抑制其诱导,因为海马c2jun mRNA水平在明暗分辨学习以后没有增加。
抑制c2jun表达主要影响分辨学习的习得,学习的损害似乎并不是由于反义c2jun注射后机体的简单神经反射造成的,因为在分辨学习前的开场行为测试中,实验组和对照组没有差异。
反义jun2B对分辨学习没有影响,说明两个问题:残留的jun2B的表达足够应付学习记忆的需要;jun2B的表达不是分辨学习习得和巩固必需的。
本文作者观察到反义c2jun S2ODN对早期发育大鼠学习记忆行为以及L T P的损害更显著[16]。
小鸡进行一次性被动回避反应训练后,特定脑区发生一系列的生化反应过程,突触受到各种信使和调制物的修饰,这种修饰与记忆的早期驻留或长期贮存的形成有关。
要产生长期记忆,突触瞬间态就必需转化为膜构象的长期性变化,因而必须要有基因的活动。
根据这个观点,Ro se发现被动回避训练会使c2fo s、c2jun表达增强,如果在训练前用注射c2 fo s的反义ODN探针的方法封闭fo s的表达,则动物就健忘。
这一基因活化可能是由膜信号传导,尤其是钙通道打开和磷酸化反应引起磷酸肌醇循环的激活所发动的[17]。
2.研究某些肽类物质、蛋白质以及受体在记忆中的作用Schm idt采用反义ODN技术研究了ependym in在金鱼脑内记忆巩固中的作用。
在学习过程以后,中枢神经系统获得的信息可以作为记忆踪迹永久保存,记忆巩固的这一阶段对转录和翻译的生化抑制剂的干扰很敏感。
Ependym in是金鱼脑内与记忆巩固有关的特异的中枢神经系统糖蛋白,在主动回避反应训练以后,ependym in mRNA在脑膜成纤维细胞快速诱导。
将18个碱基的反义ependym in S2ODN在主动回避反应训练前注射到脑脊液中,主要抑制新的ependym in 分子的合成,而不干扰已经存在的ependym in。
注射S2ODN 的动物可以学会回避反应,然而,不能保持这一记忆。
S2ODN 不干扰overtrained大鼠主动回避反应的完成和再现。
分析F ITC结合的ODN探针,在成纤维细胞显示强烈的网状F ITC2S2ODN荧光,成纤维细胞是已知的ependym in唯一的合成位点。
结果显示在体选择性抑制ependym in基因的表达能够特异性阻止记忆的形成。
作者认为只有新合成的ependym in分子与记忆巩固过程有关,其原因可能是由于它们还没有经历不可逆的分子改变[18、19]。
小脑在运动学习记忆中起关键作用,以前的报道发现,下橄榄核的胰岛素样生长因子I(in su lin2like grow th facto r I,IGF2I)调制谷氨酸诱导的小脑Pu rk in je细胞的GABA释放,在此基础上,Castro2A lam anco s采用反义ODN技术研究IGF2I是否是运动学习的调制因子。
Pu rk in je细胞的突触可塑性被认为是运动学习的关键。
反义IGF2I ODN(5’2A CT2子1的转录起始位点。
反义IGF2IODN(50Λg 5Λl)下橄榄核注射完全抑制大鼠瞬目条件反射。
这一阻断是可逆的,在小脑IGF2I返回到正常水平时条件反射恢复。
但反义IGF-I 对瞬目条件反射的保持没有影响[20]。
Sku tella设计了针对大鼠酪氨酸羟化酶(TH)mRNA起始编码区的反义ODN,TH是调控儿茶酚胺合成代谢通路限制酶的转录信使。
将反义TH ODN注射到腹侧被盖区(V TA),36小时后检测,操作行为显著减少,TH在V TA的免疫活性也减少。
