下载文档原格式
第三章 从活细胞中纯化DNA 三种不同种类的DNA 1、全细胞DNA（total cell DNA），作为提取所需克隆基因的材料来源，是必须得到的。全细胞DNA可以从细菌培养物、植物、动物细胞或其他任何用作研究的生物中获取。全细胞DNA包括生物体本身的基因组DNA（genomic DNA）及其他一切DNA分子，如：存在质粒生物体中的质粒。 2、第二种所需类型的DNA是纯净的质粒DNA。 3、如果要用到噬菌体克隆载体，那么噬菌体DNA的制备就十分必要。 3、1全细胞DNA的制备 从细菌细胞培养物中制备全细胞DNA的步骤可分为4个阶段： （1）培养细胞的生长和收集（harvested）； （2）细胞被破碎并释放出内含物； （3）这个细胞抽提物（cell extract）被除去DNA外的所有成分； （4）得到的DNA溶液被浓缩。 3、1、1 细菌培养物的生长和收集 两种典型的细菌培养基组成 M9培养基 是一种典型的确定成分培养基（defined medium），其中所有成分都是可知的。这种培养基包含无机营养成分的混合物以提供基本元素，如氮、镁和钙以及葡萄糖，来提供碳源和能量。实际上，额外的生长因子如微量元素和维生素也必须加入M9中以维持细菌的生长。 Luria-Berani（LB）培养基是一种更加复杂的不确定成分培养基（undefined medium），LB培养基包含哪些成分以及这些成分的含量都是未知的。这种培养基的两种主要成分：胰蛋白胨和酵母提取物。胰蛋白胨实际上负责提供氨基酸以及小的肽段，酵母提取物（酵母细胞部分消化后的干粉制备产物）负责提供氮源、糖类以及其他有机和无机营养。类似LB的混合培养基并不需要再另外补充成分并且能够维持种类范围很广的细菌的生长。 10v9个细胞／mL。 为了便于获得细胞的提取物，细菌必须在尽可能小的体积中被获得，因此需要在离心机中对培养物进行离心以收集细胞。相对较低的离心转速就能够使细菌在离心管底部聚集。1000mL培养基中获得的最大密度的细菌能够通过离心后再次悬浮在不到10mL的液体中。 3、1、2 细胞提取物的制备 细菌细胞外包裹着一层细胞膜和一层坚固的细胞壁。对某些特殊种类的细菌，包括大肠杆菌，细胞壁自身也包裹着一个双层的外膜。所有这些屏障在释放细胞内含物之前都必须去除。裂解细菌细胞的技术大体上可以分为两种：物理方法和化学方法。物理方法指的是以机械力的方法打破细胞外的屏障来释放内含物。化学方法则是通过将细胞暴露在能够对细胞整体结构产生影响的化学药物中来对细胞进行破碎的方法。化学裂解通常包括一种能够攻击细胞壁的成分和一种能够除去细胞膜的成分。所用的化学物质通常使用到的是溶菌酶和乙二胺四乙酸盐（EDTA），或者两者相结合使用。溶菌酶是一种在鸡蛋清中存在的酶，并且在一些分泌物如眼泪和唾液中也存在，它能够消化掉赋予细胞壁坚固性的多聚混合物。另一方面，EDTA能够通过螯合除去对保持整个细胞外壁结构来说必不可少的钙离子，同时能够抑制一些能够降解DNA的细胞质中的酶。在某些条件下，用溶菌酶或EDTA来削弱细胞壁已经足以导致细胞膜破裂，但通常都还要加入一些去垢剂如十二烷基磺酸钠（SDS）。去垢剂通过移除液体分子并导致细胞膜破裂，协助了整个细胞外壁的裂解过程。 在裂解细胞的过程中，制备细胞提取物的最后一个步骤是细胞内不溶性残渣的去除。 3、1、3 从细胞提取物中纯化DNA 除了DNA，细菌细胞提取物中还包含大量的蛋白质和RNA。从这些混合物中纯化DNA有很多方法。 一种方法就是用试剂降解其中的杂质，留下纯的DNA溶液；另一种方法是使用离子交换层析（ion-exchange chromatography）分离各种组分，达到在细胞提取物中将DNA和蛋白及RNA分离的效果。 有机萃取和酶消化法去除杂质 除去细胞提取物中蛋白质的标准方法是，加入苯酚或1:1的苯酚与氯仿的混合物。这些有机溶剂能够沉淀出蛋白质但仍保留核酸（DNA和RNA）在水溶液中。 注意：实际上每进行一次混合和离心都会导致一定数量的DNA分子断裂。所以，对于一些蛋白质成分较多的细胞提取物来说，在进行苯酚提取前，先用蛋白酶（protease）对细胞提取物进行处理，比如链霉蛋白酶或蛋白酶K。这些酶将肽段降解成更小的单元以便于进行苯酚提取。最有效的除去RNA的方法是使用核糖核酸酶，它能够迅速降解RNA分子，把它们变成核苷酸单元。 使用离子交换层析从细胞提取物中纯化DNA 利用荷电量的不同能将混合物分离成各种单独组分以达到纯化DNA的目的。由于细胞提取物中不同分子核电量不同，其与层析分离基质（也称树脂（resin））的结合紧密程度也不同。DNA和RNA（包括一些蛋白质）都是带负电的，它们能够结合在带正电的树脂上。通过逐渐增加盐离子浓度，不同类型的生物分子就逐一从树脂中分离下来。洗脱下来的物质先是蛋白，接着是RNA，最后是DNA。不过，如此细致的分离通常没有必要，只需要使用两个盐浓度就可以了。第一个浓度的盐溶液将蛋白和RNA洗脱下来，只留下DNA结合在上面，紧接着再用一个较高浓度的盐溶液将DNA洗脱下来，这样DNA就从RNA和蛋白污染物中分离开来。 3、1、4 DNA取样的浓缩 有机萃取的方法常能得到浓度非常高的DNA溶液，没有必要进行进一步的浓缩。其他分离方法得到较稀的DNA溶液，需要浓缩增加DNA溶液的浓度。 最经常用到的浓缩方法是乙醇沉淀（ethanol precipitation）。在盐（严格来说是单价阳离子如钠离子）存在的条件下。处在-20℃或更低一些的温度，纯的乙醇能够有效地使多聚核苷酸沉淀。 3、1、5 DNA浓度的测量 DNA浓度能够通过紫外吸收分光光度测定法进行测定。被DNA溶液吸收的紫外线的量能够正比于样品溶液中的DNA含量。µg双链DNA。紫外吸收还能够被用来检测DNA制备物的纯度。对纯净的DNA样品，在260nm和280nm 的吸收量之比应为1.8。如果实际测量时这个比例小于1.8的话，就表示样品被蛋白质或苯酚污染了。 3、1、6 制备全细胞DNA的其他方法 液体培养基只适合于细菌、其他微生物和动植物细胞的培养。破碎细菌细胞时所使用的化学物质对其它生物细胞并不总是适用，比如说，溶菌酶对植物细胞就毫无作用。专一性的降解酶对绝大多数的细胞壁都适用，但是通常一些物理方法，比如用研钵和乳钵对冷冻的材料进行研磨要更有效。另一方面，绝大多数动物细胞根本就没有细胞壁，仅仅用去垢剂处理就能去掉外被。对于绝大多数细菌细胞来说，主要的细胞提取物就是蛋白质、DNA和RNA,因此苯酚提取或蛋白酶降解，接下来利用核糖核酸酶分解RNA，就能够得到纯净的DNA样品了。然而，对于植物细胞组织等细胞中还含有大量的其它生化成分的对象，就需要使用一些不同的方法来提纯。 方法之一是使用一种称作十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的去垢剂，这种去垢剂能够和核酸一起形成不溶的混合物。当CTAB加入到植物细胞提取物中时，核酸-CTAB混合物就能够沉淀出来，经过离心后，沉淀混合物聚集在离心管底部，而糖类、蛋白质以及其他杂质仍然保留在悬液中。接下来，将混合物沉淀再溶于1mol/L NaCL溶液，使CTAB与核酸分离。这样，核酸就能利用乙醇沉淀进行浓缩并利用核糖核酸酶处理除去RNA。 也可以采用异硫氰酸胍，它具备的两种特性对DNA纯化十分有用。第一，它能够使除了核酸外的所有生化成分变性和溶解，因此实际上可以用来从任何组织细胞中分离DNA。第二，在异硫氰酸胍存在情况下，DNA会牢固地结合在二氧化硅颗粒上。
将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。
要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。
一、工具酶：基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。
要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。
一、工具酶：基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的DNA 分子，要把不同基因的DNA 线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（DNA ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA 聚合酶（DNA polymerase）等。
因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所用的酶统称为工具酶。
工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。
基因重组正是利用了这些工具酶对DNA 分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA 分子的切割和连接。
因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。
首先重点介绍限制性内切酶（restriction endonucleases＝restriction enzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。
从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。
首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973 年完成的，Stanley Cohen，Herbert Boyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。
核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶。
关于基因克隆的相关研究与PCR、qPCR等技术一样，作为分子实验室必备手段，分子克隆技术被广泛用于多样的基因功能研究。
所谓分子克隆指的是在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。
基因克隆技术的发展经历3个阶段，第一阶段为经典的T4 DNA 连接酶介导的TA克隆及粘性末端克隆，第二阶段为基于DNA修饰酶的LIC系列克隆，第三阶段为基于DNA重组酶的Gateway克隆及一步法克隆。
一、基于T4 DNA连接酶的克隆本系列克隆使用的酶类为：T4 DNA连接酶。
限制性内切酶：可以对目的片段和载体识别并切割出相同的粘性末端，用于碱基互补配对。
T4 DNA连接酶：可以催化目的片段和载体最后一位碱基上的5’磷酸基团和3’羟基形成磷酸二酯键，以实现将目的片段和载体连接成环状质粒。
根据是否使用限制性内切酶，可分为平末端克隆/TA克隆和粘性末端克隆。
二、基于DNA修饰酶的克隆方法本系列克隆使用的酶类为：T4 DNA聚合酶T4 DNA聚合酶具有3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性。
缺乏dNTP时，表现为3'→5'核酸外切酶活性，切割目的基因和载体，产生单链的DNA粘性末端；加入某一单独dNTP，3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性平衡，掺入与切割动态平衡，切割终止。
因此，T4 DNA聚合酶为基础的克隆方法的关键是目的基因和载体间需要有一定数量的重叠序列。
三、基于重组酶的克隆方法Gateway克隆法——本系列克隆使用的酶类为：λ整合酶Int、λ切除酶Xis、大肠杆菌IHF因子。
该技术需要四个特异性重组位点（attB、aatP、attL、attR），引导发生两个特异性重组反应（BP反应和LR反应）。
BP反应：将目的基因克隆进入入门质粒。
三四章分⼦克隆载体---答案_完_第三章分⼦克隆载体（Molecular cloning vectors）⼀、名词解析1.质粒：质粒是染⾊体外的遗传因⼦，能进⾏⾃我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋⽩质）；⼤多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分⼦（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；⼤⼩⼀般为1～200Kb，有的更⼤。
2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单⼀质粒的份数同染⾊体数之⽐值,常⽤质粒数/每染⾊体来表⽰。
不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。
3.质粒的不相容性：两个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒⼀般都利⽤同⼀复制系统，从⽽导致不能共存于同⼀宿主中。
4.质粒的转移性：质粒具转移性。
它是指在⾃然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作⽤转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因⼦ bom 及其内部的转移缺⼝位点 nic。
5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖⼜能在原核细胞中繁殖的载体。
这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，⼜含有真核⽣物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。
它⽤来转化细菌，⼜可以⽤于转化真核细胞。
6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补⽽建⽴的7.温和噬菌体：既能进⼊溶菌⽣命周期⼜能进⼊溶源⽣命周期的噬菌体。
8.溶源性细菌：具有⼀套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。
9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染⾊体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。
