基因工程的酶学基础课件
- 格式：ppt
- 大小：5.99 MB
- 文档页数：94
下载文档原格式
合集下载
基因工程酶课件
1）DNA分子的标记 2）DNA的序列分析 3）DNA的末端修饰 4）合成双链cDNA 5）定点突变 6）基因扩增（PCR技术）
33
三、RNA聚合酶（RNA polymerase） 催化RNA体外合成反应 分类：依赖DNA的RNA聚合酶 不依赖DNA的RNA聚合酶
34
四、DNA连接酶（DNA Ligase）
活性：
(1) 53聚合酶活性
(2) RNaseH活性(即外切RNA酶活性)
主要用途：反转录合成cDNA第一条链
31
7.末端转移酶
作用:无模板的情况下，在DNA或RNA3’羟基上加dNTP 主要用途：(1)载体或cDNA加同聚尾(<100nt)
(2)DNA的3’OH末端同位素标记
32
DNA聚合酶的用途：
23
24
聚合酶：
细菌DNA聚合酶
*E. Coli DNA聚合酶 I（全酶） *Klenow酶
噬菌体DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶
*测序酶（修饰的T7 pol） *Taq DNA聚合酶
*反转录酶
末端脱氧核苷酸转移酶
RNA聚合酶
SP6噬菌体RNA聚合酶 T3噬菌体RNA聚合酶 T4噬菌体RNA聚合酶
39
六、碱性磷酸酶
去除核酸末端磷酸基团的酶. 包括: 细菌碱性磷酸酶(BAP)
牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 虾碱性磷酸酶(SAP)
主要用途: 去除DNA、RNA的5磷酸根，防止片段自身连接; 标记（5' 端）前除 DNA 或 RNA 5' 磷酸
40
41
七、核酸酶（nuclease）
以核酸为底物的水解酶
eg: PmeI GTTTAAAC 20小时不能切 GGTTTAAACC 20小时，25%切开
33
三、RNA聚合酶（RNA polymerase） 催化RNA体外合成反应 分类：依赖DNA的RNA聚合酶 不依赖DNA的RNA聚合酶
34
四、DNA连接酶（DNA Ligase）
活性：
(1) 53聚合酶活性
(2) RNaseH活性(即外切RNA酶活性)
主要用途：反转录合成cDNA第一条链
31
7.末端转移酶
作用:无模板的情况下，在DNA或RNA3’羟基上加dNTP 主要用途：(1)载体或cDNA加同聚尾(<100nt)
(2)DNA的3’OH末端同位素标记
32
DNA聚合酶的用途：
23
24
聚合酶：
细菌DNA聚合酶
*E. Coli DNA聚合酶 I（全酶） *Klenow酶
噬菌体DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶
*测序酶（修饰的T7 pol） *Taq DNA聚合酶
*反转录酶
末端脱氧核苷酸转移酶
RNA聚合酶
SP6噬菌体RNA聚合酶 T3噬菌体RNA聚合酶 T4噬菌体RNA聚合酶
39
六、碱性磷酸酶
去除核酸末端磷酸基团的酶. 包括: 细菌碱性磷酸酶(BAP)
牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 虾碱性磷酸酶(SAP)
主要用途: 去除DNA、RNA的5磷酸根，防止片段自身连接; 标记（5' 端）前除 DNA 或 RNA 5' 磷酸
40
41
七、核酸酶（nuclease）
以核酸为底物的水解酶
eg: PmeI GTTTAAAC 20小时不能切 GGTTTAAACC 20小时，25%切开
第二章兰州大学基因工程基因工程酶学基础
（2）切割位点
•绝大多数II类酶在其识别位点内切割 DNA
PPT文档演模板
第二章兰州大学基因工程基因工程酶 学基础
• 粘性末端 （cohensive end）
• 连接便 利
PPT文档演模板
第二章兰州大学基因工程基因工程酶 学基础
PPT文档演模板
第二章兰州大学基因工程基因工程酶 学基础
• DNA 分子末端标 记
PPT文档演模板
•Dr. Werner Arber
第二章兰州大学基因工程基因工程酶 学基础
•2 性 质
内切酶，即在核酸分子内部制造切 口的酶
形成5`-P 和3`-OH末端
•3 功 能
• 自我保护作用 • 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
PPT文档演模板
第二章兰州大学基因工程基因工程酶 学基础
a 限制（Restriction）
• 大多数的核酸限制内切酶的标准反应温度 为37 ℃ ，但也有许多例外，如SmaI为25 ℃ ，ApaI为30 ℃ ，TaqI为65 ℃
c 限制修饰系统分子机理
• 由三个连续基因位点所控制：
hsd R, hsdM, hsd S
• hsd R---限制性内切酶:能识别DNA分子 上的特定位点并将双链DNA切断
• hsd M---限制性甲基化酶 :催化DNA分子 特定位点上的碱基甲基化反应
• hsd S---控制两个系统的表达 :协助上述 两种酶识别特殊的作用位点
• 1、DNA的纯度 • 2、DNA的甲基化程度 • 3、酶切反应的温度 • 4、DNA的分子结构 • 5、核酸限制性内切酶的反应缓冲液
PPT文档演模板
第二章兰州大学基因工程基因工程酶 学基础
DNA的纯度
基因工程酶课件
基因工程酶
7
目前已发现的限制酶有三大类：
类 型
Ⅰ
识 别 与 切 割 位 点分 别 ， 随 意 切
割 ， 相 距 较 远 ，
单 链 切 割
Ⅱ 相 同
Ⅲ 相 距 5-10bp
功 能 (限 制 ， 修 饰 ) 防 御 ， 单 功 能 对 基 因 工 程 意 义不 大
单 功 能 双 功 能 (限 制 -修 饰 )
如： 高浓度Hg2+、酚，氯仿、乙醇、EDTA SDS、NaCl等。
基因工程酶
12
2、反应系统因素
基因工程 工具酶
基因工程酶
1
基因工程酶
2
基因工程工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制 性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基 因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌 （或真核生物如酵母）进行改造、优株化、而产生的生物工程产品。
3′ C T T A A G 5َ ′
5َ ′G 3′C T T A A 5’
c. 3′粘性末端
如 PstⅠ
5’A A T T C 3′ G 5َ ′
5َ ……′ C T G C A G 3′ ……
…… 3′ G A C G T C 5َ ′ ……
5َ ′ C T G C A 3′
3′ G 5َ ′
限制性内切酶的性质及切割特点
1、裂解产物均具有3′－羟基和5′－磷酸残基，5′P-N N…NN…NN-OH 3′。
2、识别序列及切点的高度专一。
5‘…… G A A T T C ……3’ 3’ ……C T T A A G ……5’
G GAT C C C C TAG G
基因工程的酶学基础
DNA甲基化对酶活性的影响 •大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶 和Dcm甲基化酶。 •Dam可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上 引入甲基 •Dcm在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5 位置上引入甲基。 •部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切 割，如FbaI和MboI等。
通常有两种方法： ①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA 识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化 影响； ②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA 的制备，如E. coli & nbsp; JM110和链霉菌 等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而 后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细 胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
CATG
SAGE Tag 5
CATG
SAGE Tag 2
SAGE Tag 4
SAGE Tag 6
•II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或
附近，产生以下4种情况。 ① 5’粘性末端；② 3’粘性末端；③ 平末端和 ④ 非互补的粘性末端 •无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内 切酶，所留下的残端都是一样的。 •经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端总是 保留一个OH
第二讲 基因工程的酶学基础
本节内容
•限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 •DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 •核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 •核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 •核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 •核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 •其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、 检测等。
Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性
1.具有高度特异性的识别位点与酶切位点。 2.辅基： Mg++。 特定识别序列一般长4 - 8对碱基； 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；
基因工程的酶学基础PPT课件
1. 用属名的第一个字母大写 2. 种名的前两个字母小写 3. 由3个字母形成的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基
本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
6
第6页/共105页
4. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株 名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因 位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母 表示此染色体外遗传成分。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
21
第21页/共105页
② 末端标记
A 末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 B 末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸 的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘 性末端。
③ 补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
22
第22页/共105页
[3] 平齐末端（blunt end）
在识别序列的对称轴上同时切割 如EcoR V
5’-
GATATC
-3’
3’-
CTATAG
-5’
23
第23页/共105页
[4] 平齐末端的特点
连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接 效率的1%，这种连接常出现多联体连接。
粘性末端与平齐末端连接的处理方法
-3’ -5’
19
ⅱ） 3’端凸出（如Pst I切点）
5’-
CTGCAG
-3’
3’-
GACGTC
-5’
5’-
CTGCA
G
-3’
3’-
G
ACGTC
-5’
本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
6
第6页/共105页
4. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株 名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因 位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母 表示此染色体外遗传成分。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
21
第21页/共105页
② 末端标记
A 末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 B 末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸 的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘 性末端。
③ 补平成平齐末端
粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
22
第22页/共105页
[3] 平齐末端（blunt end）
在识别序列的对称轴上同时切割 如EcoR V
5’-
GATATC
-3’
3’-
CTATAG
-5’
23
第23页/共105页
[4] 平齐末端的特点
连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接 效率的1%，这种连接常出现多联体连接。
粘性末端与平齐末端连接的处理方法
-3’ -5’
19
ⅱ） 3’端凸出（如Pst I切点）
5’-
CTGCAG
-3’
3’-
GACGTC
-5’
5’-
CTGCA
G
-3’
3’-
G
ACGTC
-5’
2第二章_基因工程的酶学基础
无用
位于识别位点上
是 非常有用
特异性位点3‘端 24-26bp处
是
用处不大
三、限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统， 命名原则如下：
1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3 个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基 本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶
4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名 称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。
如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶
实际应用中，R常被省略。
四. Ⅱ类限制性内切酶的基本特性
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从 流感嗜血菌中分离出来。
酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件
第二节 DNA 连接酶
一、DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把 两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口
1967年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能 够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA 连接酶。
持续合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不 从模板上掉下来。 有的DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会 从模板上解离下来。
3. 常用DNA聚合酶的特性比较
DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow fragment T4 DNA聚合酶 T7 DNA聚合酶 化学修饰T7 DNA聚合酶 遗传修饰T7DNA聚合酶 逆转录酶
位于识别位点上
是 非常有用
特异性位点3‘端 24-26bp处
是
用处不大
三、限制性内切酶的命名
1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统， 命名原则如下：
1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3 个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基 本名称。
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶
4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名 称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。
如 R.Hind Ⅲ表示限制性内切酶 M.Hind Ⅲ 表示相应的甲基化酶
实际应用中，R常被省略。
四. Ⅱ类限制性内切酶的基本特性
首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从 流感嗜血菌中分离出来。
酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件
第二节 DNA 连接酶
一、DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把 两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口
1967年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能 够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA 连接酶。
持续合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不 从模板上掉下来。 有的DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会 从模板上解离下来。
3. 常用DNA聚合酶的特性比较
DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow fragment T4 DNA聚合酶 T7 DNA聚合酶 化学修饰T7 DNA聚合酶 遗传修饰T7DNA聚合酶 逆转录酶
基因工程中的酶PPT课件
两条链上的断裂位置是交错 地，但又是围绕着一个对称 结构中心，这样形成的断裂 结果形成具有粘性末端的 DNA片段
18
含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型：
① 5’端凸出（如EcoR I切点）
5 ’3 ’5 ’3 ’-
GAATTC CTTAAG 3 ’G AATTC CTTAA G 5’-
第三节基因工程中的酶学
关键词： • 了解各种酶在基因工程 中的作用 • 掌握限制性内切酶和连 接酶的基本特性 • 逆转录酶在A技术中常用的工具酶
工具酶 功能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5‘磷酸基和3’羟基末端之间形成 磷酸二酯键，是DNA切口封合或是DNA片段连接 ①合成双链cDNA的第二条链 DNA聚合酶I ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3’末端 ①合成cDNA 反转录酶 ②代替DNA聚合酶I 进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5’羟基末端磷酸化，或标记探针 多聚核苷酸激酶 在3’羟基末端进行同质多聚物加尾 末端转移酶 切除末端磷酸基 碱性磷酸酶
16
（3）平末端（ blunt end ） 两条链上的断裂位置是处在一 个对称结构的中心,这样形式的 断裂是形成具有平末端的DNA 片断。不易重新环化。
EcoR V 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’
产生平齐末端
17
（4）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）
（5）粘性末端的意义 ①连接便利 i）不同的DNA双链：
只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。 ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接 成环形分子。
基因工程的酶学基础课件
第六章 基因工程的酶学基础
基因工程的酶学基础
1
• 限制性内切酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶和反转录酶 • DNA修饰酶 • 外切核酸酶 • 单链内切核酸酶 • RNA酶
基因工程的酶学基础
2
• 核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而使核酸分子断链。
• 根据水解的不同方式，分为：
基因工程的酶学基础
30
六、限制内切酶对DNA的消化
1.DNA分子的双酶切消化 可以先后分别在不同的反应体系中进行：
• 先用需要低盐离子浓度的酶切割，再调节盐离子 浓度，加入另一种酶切割。
• 先用最适反应温度较低的酶切割，升温后再加入 第二种酶。
基因工程的酶学基础
31
基因工程的酶学基础
32
2.DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化
基因工程的酶学基础
35
6.2 DNA连接酶
一、DNA连接酶的发现 • DNA连接酶（DNA ligase）是能催化双链DNA片段
靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基因末端之间形 成磷酸二酯键，使两末端连接在一起。—“分子黏 合剂”
基因工程的酶学基础
36
• 依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类：
对平末端的连接； • 当ATP浓度上升至7.5mmol/L时，对黏性末
端及平末端的连接均有抑制作用。
基因工程的酶学基础
44
• 4.DNA片段末端
基因工程的酶学基础
45
6.3 DNA聚合酶和反转录酶
• DNA聚合酶（DNA polymerase）：在引物和模板 的存在下，把dNTP连续加到DNA分子3-OH末端， 催化核苷酸的聚合。
基因工程的酶学基础
基因工程的酶学基础
1
• 限制性内切酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶和反转录酶 • DNA修饰酶 • 外切核酸酶 • 单链内切核酸酶 • RNA酶
基因工程的酶学基础
2
• 核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而使核酸分子断链。
• 根据水解的不同方式，分为：
基因工程的酶学基础
30
六、限制内切酶对DNA的消化
1.DNA分子的双酶切消化 可以先后分别在不同的反应体系中进行：
• 先用需要低盐离子浓度的酶切割，再调节盐离子 浓度，加入另一种酶切割。
• 先用最适反应温度较低的酶切割，升温后再加入 第二种酶。
基因工程的酶学基础
31
基因工程的酶学基础
32
2.DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化
基因工程的酶学基础
35
6.2 DNA连接酶
一、DNA连接酶的发现 • DNA连接酶（DNA ligase）是能催化双链DNA片段
靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基因末端之间形 成磷酸二酯键，使两末端连接在一起。—“分子黏 合剂”
基因工程的酶学基础
36
• 依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类：
对平末端的连接； • 当ATP浓度上升至7.5mmol/L时，对黏性末
端及平末端的连接均有抑制作用。
基因工程的酶学基础
44
• 4.DNA片段末端
基因工程的酶学基础
45
6.3 DNA聚合酶和反转录酶
• DNA聚合酶（DNA polymerase）：在引物和模板 的存在下，把dNTP连续加到DNA分子3-OH末端， 催化核苷酸的聚合。
基因工程的酶学基础
第二章兰州大学基因工程基因工程酶学基础
1967年，世界多个实验室发现催化DNA双链上相邻的3`OH和5`-P共价结合形成3`-5`磷酸二酯键的酶
• 二 、特点
• 2 连接条件
• 3 DNA连接酶连接反应条件
• 三、连接反应机理
• 四、连接反应温度
• 五、影响因素
• 六、反应体系
• 七 、连接操作
• 八、体外连接DNA片段的几种方法
Nathan和Dr. Hamilton Smith博士第一次从 大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶 • 已经分离提取出500多种限制性内切核酸酶
Dr. Werner Arber
2性质
内切酶，即在核酸分子内部制造切 口的酶
形成5`-P 和3`-OH末端
3功能
自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯 (Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖
• 同裂酶 (isoschizomers)： 来源不同， 识别的是同样的核苷酸靶序列
• 同尾酶(isocaudamer) ：来源不同，识别的靶 序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端
由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的 互补作用而彼此连接起来的，在基因克隆实验中很有用处
• 消化反应温度高于或低于最适反应温度， 都会影响酶的活性
• 每ugDNA 用1-5U酶切1-2h
DNA的分子结构
• 某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需的 酶量比消化线性DNA高出20倍
• 一些核酸内切酶，切割处于不同位置的限制位点，其效率有 明显的差异， 可能是由于侧翼序列的核苷酸成分的差异造 成的
• 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结 合形成的位点，称之为“杂种位点 ”(hybrid site)。但这类杂种位点的结构， 一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别
• 二 、特点
• 2 连接条件
• 3 DNA连接酶连接反应条件
• 三、连接反应机理
• 四、连接反应温度
• 五、影响因素
• 六、反应体系
• 七 、连接操作
• 八、体外连接DNA片段的几种方法
Nathan和Dr. Hamilton Smith博士第一次从 大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶 • 已经分离提取出500多种限制性内切核酸酶
Dr. Werner Arber
2性质
内切酶，即在核酸分子内部制造切 口的酶
形成5`-P 和3`-OH末端
3功能
自我保护作用 细菌的限制和修饰系统（R/M体系）
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯 (Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖
• 同裂酶 (isoschizomers)： 来源不同， 识别的是同样的核苷酸靶序列
• 同尾酶(isocaudamer) ：来源不同，识别的靶 序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端
由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的 互补作用而彼此连接起来的，在基因克隆实验中很有用处
• 消化反应温度高于或低于最适反应温度， 都会影响酶的活性
• 每ugDNA 用1-5U酶切1-2h
DNA的分子结构
• 某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需的 酶量比消化线性DNA高出20倍
• 一些核酸内切酶，切割处于不同位置的限制位点，其效率有 明显的差异， 可能是由于侧翼序列的核苷酸成分的差异造 成的
• 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结 合形成的位点，称之为“杂种位点 ”(hybrid site)。但这类杂种位点的结构， 一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
基因工程的酶学基础
5
• 各种细菌都能合成一种或几种能够切割双链DNA 的内切核酸酶，以此来限制外源DNA在自身细胞 内的存在。
• 几乎所有的限制性内切酶都和能识别甲基化相同 DNA位点的甲基转移酶共同作用，构成制-修饰 系统。
• 宿主细胞的DNA被甲基转移酶修饰而被保护起来， 不被限制性内切酶识别，从而使自身DNA免受降 解。
基因工程的酶学基础
10
命名
HindⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属种 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
基因工程的酶学基础
11
四、Ⅱ型限制内切酶的基本特性
基因工程的酶学基础
15
（二）切割位点的特异性
1.DNA分子酶切片段的末端
• 切割：水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的 DNA片段5’端为磷酸基，3’ 端为羟基。
基因工程的酶学基础
16
• 酶切后产生的片段末端有黏性末端和平末端 等形式。
• 黏性末端：DNA分子在限制性内切酶的作用 下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末 端结构。它们能够通过互补碱基间的配对而 重新连接起来。
基因工程的酶学基础
13
基因工程的酶学基础
14
• 有些限制性内切酶的识别序列中，某一位或二位碱 基并非严格专一，但不影响其作用位点，只是增加 酶的识别和作用频率。如HindⅡ识别序列为-GTYRAC--，其中Y表示C或T，R表示A或G。
• 有的酶识别6个以上的核苷酸序列，称为稀有限制 性内切酶，如NotⅠ，识别序列为（GCGGCCGC）
5' …C TGCA▼G…3' Pst I 5' …CTGCA3’ G…3'
3' …G▲ACGT C…5'
3' …G 3’ACGTC… 5'
基因工程的酶学基础
19
（3）在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或 称钝性末端（blunt end），如SmaI：
5' …CCC▼GGG…3' Sma I 5' …CCC GGG…3'
3' …GGG▲CCC…5'
3' …GGG CCC… 5'
基因工程的酶学基础
20
2.同切点酶（或同裂酶，isoschizomer）
• 同裂酶：是一类来源于不同的微生物、能识别相 同靶序列的限制性内切核酸酶。
识别序列相同，切割位点不同
例：SmaⅠ CCC ↓ GGG XmaⅠ C ↓ CCGGG
基因工程的酶学基础
4
一、限制性内切酶的发现
1. 细菌限制修饰系统的发现 • 20世纪60年代在研究噬菌体的寄主范围时发现的。 • 从天然宿主大肠杆菌K中分离得到的λk噬菌体，当
其感染B菌株时，感染率仅为10-4，分离得到幸存 的子代λk病毒，再用其感染B菌株，感染率为 100%；若再用其感染K菌株，感染率又降为10-4。 此现象称为宿主限制现象。
基因工程的酶学基础
17
（1）在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。 靠近5’ 端切割产生 5' 端突出的粘性末端，如 EcoRI ：
5' …G▼AATT C…3' EcoR I 5' …G 5’AATTC…3'
3' …C TTAA▲G…5'
3' …CTTAA 5’ G… 5'
基因工程的酶学基础
18
（2）靠近 3' 端切割产生3' 端突出的粘性 末端。如Pst I：
其中，N为任意碱基。
基因工程的酶学基础
12
回文诗
悠悠绿水傍林偎， 日落观山四望回。 幽林古寺孤明月， 冷井寒泉碧映台。 鸥飞满浦渔舟泛， 鹤伴闲亭仙客来。 游径踏花烟上走， 流溪远棹一篷开。
开篷一棹远溪流， 走上烟花踏径游。 来客仙亭闲伴鹤， 泛舟渔浦满飞鸥。 台映碧泉寒井冷， 月明孤寺古林幽。 回望四山观落日， 偎林傍水绿悠悠。
基因工程的酶学基础
6
2. 限制酶HindIII的发现
• Smith 等于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现 并分离到HindIII限制酶。
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
• Nathans（1971年）用HindIII绘制SV40的限制酶谱。
基因工程的酶学基础
第六章 基因工程的酶学基础
基因工程的酶学基础
1
• 限制性内切酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶和反转录酶 • DNA修饰酶 • 外切核酸酶 • 单链内切核酸酶 • RNA酶
基因工程的酶学基础
2
• 核酸酶：水解相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸 二酯键，从而使核酸分子断链。
• 根据水解的不同方式，分为：
（一）识别序列的特异性
• 大多数Ⅱ型限制内切酶的识别序列长度为4~6bp， 具有双重旋转对称结构的回文序列（palindromic sequence）。
BamHⅠ：
GGATCC CCTAGG
❖如果识别序列由5对碱基组成，其对称轴为
中间的一对碱基，如MaeⅢ的识别序列为：
--GTNAC---CANTC--
基因工程的酶学基础
8
• Ⅲ型酶：有专一的识别序列，但不是对称的回 文序列，在识别序列旁边的位置上切割双链。 切割后产生的DNA片段具有各种单链末端。
• Ⅳ型酶：新鉴定出的一种酶，目前无应用。
基因工程的酶学基础
9
三、限制性内切酶的命名
• 命名原则： 属——种——株——分离序号
例如：EcoRⅠ 属：Escherichia 种：coli 株：R 分离序号：Ⅰ
• 外切核酸酶（exonuclease） • 内切核酸酶（endonuclease）
• 根据作用的核酸底物不同，分为：
• RNA酶 • DNA酶 • 底物非专一性核酸酶
基因工程的酶学基础
3
6.1 限制性内切酶
• 定义：限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序 列, 并在识别位点或其周围切割双链 DNA的一类内切酶。
7
二、限制性内切核酸酶的类型
• 已经鉴定出的限制性内切核酸酶可分为4种不同类型： • Ⅰ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别位点附近的核苷酸
切割DNA双链，但切割序列是随即的，无专一性。在基因工程中 应用不大。 • Ⅱ型酶：能识别专一的核苷酸序列，并在识别序列的固定位置切 割双链DNA分子，是基因工程中最常用的工具酶。