细胞爬片制作(Hela细胞为例)

免疫组化法：
1 胰酶消化细胞，收集至离心管；调整样本细胞数为1×106/ml；
2 将单细胞悬液滴加至平皿内无菌载玻片表面，置于37℃ 5%的加湿CO2孵箱中过夜，使细胞爬片。

3 吸弃平皿内培养上清，加入新鲜培养基，用无菌培养基洗3次；
4 PBS冲洗相应方案的载玻片3次；
5 将载玻片置于95%乙醇中固定约1h；
6 倒置相差显微镜下观察，并划定载玻片上细胞爬片密集区；
7 在相应区域滴加按一定比例稀释后一抗，4℃冰箱内过夜湿孵。

阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。

8 先暂复温30min，后PBS冲洗载玻片3次；
9 滴加二抗，室温湿孵30min；后PBS冲洗载玻片3次；
10 DAB显色：将配置好的DAB溶液滴加至载玻片上，室温下孵育3min至载玻片略显黄色；
11 清水充分冲洗载玻片，苏木素复染核3-5min，清水冲洗，盐酸酒精分化20s，清水冲洗，氨水返蓝3min，清水冲洗，后置于75%-80%-95%-无水酒精中脱水，每步骤约2min；
12 将载玻片置于1、2、3道二甲苯中，各约15min，中性树脂封片，置于阴凉通风处风干。

细胞培养（hela, 293,239T等细胞的培养）Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。

观察时拧紧盖子。

2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。

3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。

不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。

取小离心管一个，置于架子上。

4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。

放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。

5．取待传代的细胞。

打开versene，用酒精灯外焰烧。

烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。

把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。

（加versene主要是为了将旧培养基洗去）。

在离心管中间部分将液体加入。

吸液体和加液体时都不要对着细胞。

7．打开胰酶，然后将versene弃掉。

换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。

加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。

8．将细胞放入37度孵箱。

放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。

使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。

别忘了用旧培养基中和。

9．取细胞，镜下观察消化情况。

消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。

用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。

然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。

10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。

11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。

换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。

12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。

细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤1.爬片的准备1)爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；用盖玻片刻，可依据自己的需要用小砂轮或玻璃刀剪裁成适合的大小，以备置于6 孔板、 12 孔板或 24 孔板； 2)将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡留宿，次日先用自来水冲刷 20 遍，而后置于无水酒清中浸泡 6 小时，再用三蒸水冲刷 3 遍，放在饭盒或许玻璃培育皿中烘干后高压消毒。

高压消毒后拿出放入烘箱中烘干，烘干后可放入超净台中备用。

3)可将爬片用多聚赖氨酸办理，以使细胞与爬片联合更坚固。

1mg/ml 的多聚赖氨酸用0.22um 的滤器过滤除菌后分装于经过无菌办理的1ml 细胞冻存管内保留在 4℃里，三个月内仍旧能够使用。

用时将高压灭菌过的爬片放到0.1mg/ml 的多聚赖氨酸溶液内浸泡 5min，无菌晾干即可（放入培育板孔内注意爬片的正反面）。

或将爬片铺于培育皿中，将多聚赖氨酸溶液滴于爬片上，室温 10 分钟后，吸除玻片上的溶液，在超静台内晾干后使用。

储藏、稀释和汲取多聚赖氨酸要使用塑料制品。

2.细胞爬片1)胰酶消化细胞后重悬细胞于完整培育基中，充足吹打，使之成单细胞悬液，计数。

2)依据自己的需要选择适合的细胞密度种入培育板内。

滴加细胞悬液时，依据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的地点滴少许培育基，而后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培育皿靠培育基的张力粘合到一同，防备加细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。

若细胞贴壁能力不强，爬片可经多聚赖氨酸浸片后放入。

3.细胞的固定及免疫荧光1)在培育板中培育好细胞后，吸除培育基，一般先使用 PBS轻洗细胞 2× 3 min，而后再做固定（凋亡的 TUNEL染色等能够不冲洗）。

1 / 32)固定：加入 4%多聚甲醛 (PBS配制 )固定 20 分钟。

假如临时不可以立刻做组化检测，使用含 0.4%多聚甲醛的 PBSPH7.4浸泡细胞（注意在免疫组化检测达成前不要让细胞变干，不然细胞缩短形态不好）。

直接制备细胞涂片的方法
细胞涂片是一种基础的细胞学研究技术，也是细胞学和组织学实验中
经常使用的方法。

制备细胞涂片的过程需要在保持细胞完整性的同时，使细胞均匀分布于载玻片上。

下面将介绍一种直接制备细胞涂片的方法：
实验材料：
1. 空玻片
2. 细胞悬液
3. 细胞培养液
4. 神经刀
5. 羟甲基纤维素
操作步骤：
1. 将干净的玻璃片放入试管中加入适量的羟甲基纤维素溶液，充分浸
润。

取出空玻片挂在玻片架上用酒精棉擦拭干净。

2. 用细胞培养液将细胞悬液充分悬浮。

3. 用吸头吸取适量的细胞悬液，均匀滴在已经浸润了羟甲基纤维素的玻片上，滴头离空玻片的顶部约1 cm。

4. 用神经刀在空玻片上做V字形的切口，先从一端到另一端，再从上到下。

V字口的尖端朝离滴液边缘最远的一侧。

注意力度要轻，以避免切破空玻片。

5. 将玻片静置约2分钟，让滴液充分渗透。

过程中要注意保持玻片平放。

实验室环境湿度低的时候可以用湿棉花覆盖。

6. 架在荧光显微镜或者普通显微镜上检查涂片是否均匀。

可以采用另一个空玻片轻轻压在细胞涂片上，使细胞充分接触玻片表面，然后将其取下。

7. 将制备好的涂片置于37°C恒温培养箱内，待其干燥。

干燥后可以染色、抗体标记、显微镜观察等。

总结：
制备细胞涂片的方法是细胞学和组织学实验中必不可少的技术之一。

其中直接制备细胞涂片方法简单、快捷，通常用于常规检查和初步鉴定。

在实际应用中，可以根据需要灵活选择不同的制备方法。

细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤细胞爬片：1.埋板准备：准备含有合适培养基的细胞培养板或培养皿。

将培养基预热至适宜的温度。

2.细胞处理：将需要爬片的细胞株从库存中取出，用PBS（磷酸盐缓冲液）或无酶胰蛋白酶溶解细胞外基质粘附，用培养基洗涤细胞。

3.细胞计数：用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞浓度，然后根据需要调整到合适的细胞密度。

4.接种细胞：将适量的细胞接种到埋板中，根据实验要求可以采用单细胞克隆或稀释传代法。

5.培养细胞：将埋板放入细胞培养箱的适当环境中，通常为37°C、5%CO2的培养箱。

根据实验需要，培养时间可以从几小时到几天不等。

固定：1.筛选固定剂：选择适合的固定剂，常用的固定剂包括乙醛和甲醛等。

2.固定细胞：使用适当的浓度的固定剂，将培养的细胞浸泡在固定剂中，通常需要15-30分钟的固定时间。

3.洗涤细胞：使用PBS等缓冲溶液洗涤固定的细胞，去除多余的固定剂。

免疫荧光：1.孔板准备：将需要进行免疫荧光染色的细胞或组织培养在培养皿或孔板中。

2.阻断非特异性结合：用0.1-5%BSA或牛血清等蛋白质溶液阻断非特异性结合位点，减少假阳性信号。

3.一抗染色：加入适当浓度的一抗（具体浓度由厂家确定）到需要染色的细胞上，对于细胞表面的抗原，可以直接在细胞外孔板中加入一抗。

4.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤一抗残余的溶液。

5.二抗染色：加入与一抗同种小鼠或兔子抗体的特异性抗体（如荧光素、奥林染色试剂等）到孔板中，适当的浓度需根据实验所需，与一抗使用的缓冲液一致。

6.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤二抗残余的溶液。

7.成图：用荧光显微镜观察样品，利用相应的激发波长和荧光滤镜观察和拍摄免疫染色的图像。

细胞爬片、固定和免疫荧光技术的步骤可以根据具体实验的要求进行调整和优化。

这些操作步骤在细胞和分子生物学研究中非常重要，可以用于检测和观察各种细胞结构和分子的表达和分布。

整个过程需要细心和耐心，并且需要严格控制各个步骤的条件以确保实验结果的准确性和可重复性。

Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。

观察时拧紧盖子。

2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。

3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。

不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。

取小离心管一个，置于架子上。

4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。

放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。

5．取待传代的细胞。

打开versene，用酒精灯外焰烧。

烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。

把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。

（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。

在离心管中间部分将液体加入。

吸液体和加液体时都不要对着细胞。

7．打开胰酶，然后将versene弃掉。

换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。

加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。

8．将细胞放入37度孵箱。

放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。

使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。

别忘了用旧培养基中和。

9．取细胞，镜下观察消化情况。

消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。

用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。

然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。

10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。

11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。

换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。

12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。

不要把枪伸到离心管内。

13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。

Hela细胞
Hela细胞，是来源于1951年一个非洲裔美国女性Henrietta Lacks的宫颈癌细胞。

这一种细胞被称为永生细胞，因为它具有不寻常的生长特性，能够无限制地分裂增殖。

Hela细胞的独特之处在于其快速繁殖速度和对各种研究的广泛应用。

Hela细胞的发现是细胞学领域的一个重大突破。

通过研究Hela细胞，科学家能够更深入地了解细胞的生长和分裂机制。

这些细胞已经被广泛用于医学研究、疾病治疗和药物开发等领域。

Hela细胞的广泛应用也引发了一些伦理和法律问题。

Henrietta Lacks的细胞在没有她本人或家人的知情同意的情况下被使用，引发了对个人隐私权和细胞样本所有权的讨论。

这些问题促使人们重新审视细胞样本的使用和保护，以确保公平和透明。

虽然Hela细胞在科学研究中发挥了重要作用，但人们也要意识到细胞样本的来源以及使用的伦理和法律问题。

通过更加谨慎和透明地处理细胞样本，可以确保科学研究的合理性和公正性。

总的来说，Hela细胞的发现对细胞生物学和医学研究产生了深远影响，但我们也必须关注其中涉及的伦理和法律问题，以建立更加公正和透明的科研体系。

抗肿瘤药物对肿瘤细胞抑制及细胞形态观察实验导读细胞是生物体形态结构、生理功能和发育分化等生命现象的基本单位。

人体细胞种类繁多，大小不一，形态多样，结构和功能都不同。

每个细胞都由细胞膜、细胞质和细胞核三部分组成。

各种细胞具有一定的形态结构特点，合成与功能相关的特殊蛋白质，表达某种代谢特点和功能活动，即为细胞的表型。

为观察不同细胞或细胞在不同环境下的状态，染色是最常用、且最直观的方法。

染色是组织或细胞的某些成分与染料的化学结合或物理吸附作用而显色的过程。

染料是一种有机化合物，它们含有不饱和的基团，例如亚硝基（－N=O）、偶氮基（－N=N－）等称为发色团。

各种染料由于它们的发色团不同，显示的颜色就不同。

此外，染料还含有一些碱性基团如氨基（－NH2）或酸性基团如羧基（－COOH）或磺基（－SO3H），称为助色团。

含有氨基的染料是碱性染料，它在溶液内带阳电荷，为阳离子染料，它和组织内的酸性物质有亲和力。

含有羧基和磺基的染料是酸性染料，它在溶液内带阴电荷，为阴离子染料，它与组织内的碱性物质有亲和力。

5-氟尿嘧啶作为嘧啶类似物,用于固体瘤的治疗已经有近50年的历史。

目前作为首选抗代谢药用于临床治疗胃癌、乳腺癌等多种癌症。

5-氟尿嘧啶在细胞内先转变为5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸，后者抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸，从而抑制DNA的生物合成。

此外，通过阻止尿嘧啶和乳清酸掺入RNA，达到抑制RNA 合成的作用。

为细胞周期特异性药，主要抑制S期细胞。

各种组织或细胞的基本组成成分都是蛋白质、糖蛋白、或脂蛋白，蛋白质分子中既含有碱性的氨基，有含有酸型的羧基，它是两性电解质。

氨基和羧基在溶液内均可电离，如羧基的电离大于氨基时则蛋白质带阴电荷，此时它和阳离子的碱性染料亲和力大；如氨基的电离大于羧基时则蛋白质带阳电荷，此时它和阴离子的酸性染料亲和力大。

在一定的pH值时，某种蛋白质带有阴电荷和阳电荷的数目相等，此pH为该种蛋白质的等电点，此时蛋白质为不带电荷的两性物质，着色不佳。

细胞载玻片爬片培养法进行免疫组化染色方法介绍天津市灏洋生物制品科技有限责任公司郑斌徐彬传统的细胞爬片中使用24孔板或96孔板，因为是塑料材质不利于抗原热修复，而盖玻片较薄，易碎不容易取出，二者均存在一定的缺点。

本实验采用体外细胞载玻片爬片培养法，便于做热修复，同时操作较方便、简单、实用。

1 材料1．1 载玻片的处理：用肥皂水将载玻片洗净，自来水冲洗，晾干，再将载玻片浸泡在洗液中2~3小时，取出后再用自来水冲净，蒸馏水冲洗三遍，用干净的纱布将载玻片擦干，放在饭盒中，置170℃干烤5小时消毒灭菌。

1．2 人乳腺癌细胞系T47-D、人骨肉瘤细胞系U2OS。

1．3 仪器倒置显微镜、光学显微镜、二氧化碳培养箱、隔水式电热恒温培养箱等。

1．4 试剂胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、免疫组化试剂盒、无水乙醇、抗葡萄糖转移酶（Glut-1）多克隆抗体、抗脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE1）单克隆抗体、抗血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体、PBS(含0.01M 磷酸盐缓冲液，0.85%NaCl，pH 7.2~7.4) 、0.1 M枸橼酸缓冲液（pH 6.2~6.4）、分化液（10%乙醇、0.5%盐酸）、二甲基联苯胺（DAB）等。

2 方法2．1 细胞爬片培养取人乳腺癌细胞系T47-D细胞及人骨肉瘤细胞系U2OS细胞各一瓶，用吸管吸除培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入2ml 0.25%胰蛋白酶,覆满瓶底。

室温放置5分钟后镜下观察，发现细胞变圆、细胞间隙增大后，立即终止消化，翻转培养瓶，使瓶底向上。

将胰蛋白酶吸去，加入约2ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，将细胞从瓶壁上吹打下来，制成细胞悬液，滴于已处理好的载玻片上，每张片子1~2滴，注意:滴于载玻片后1/3的位置，且不能有汽泡。

放在37℃ 5%CO2培养箱中继续培养过夜。

2．2 细胞的固定培养箱取出，用PBS将培养液洗去，放 将已培养过夜的细胞爬片从5%CO2在冷乙醇中室温固定30分钟后，取出爬片放置在切片盒内-20℃储存，待免疫组化染色。

细胞爬片HE染色方法一、原理苏木素（Hematoxylin）－伊红（Eosin）染色法，简称HE染色法。

HE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别于细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折光率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像。

该染色过程既有化学反应，又有物理作用参与。

从化学反应看，组织细胞内含有酸性物质和碱性物质，细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子结合，而细胞核的碱性物质与酸性染料的阴离子结合，使其中酸性细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，而碱性的胞浆被酸性染料伊红染成红色。

其结果胞核呈蓝色，胞浆呈红色。

从物理现象看，主要有吸附、吸收之说。

HE 染色提供良好的核浆对比染色，是细胞化学染色最常用的一种方法。

二、实验用品1、固定液：常用95％乙醇和冰丙酮2、苏木精染液：称取苏木精粉0.5g，铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取NaIO 31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均匀，滤纸过滤，备用。

3、伊红染液：称取0.5g水溶性伊红染液，溶于100ml蒸馏水中。

4、稀盐酸乙醇溶液：用75%乙醇配制1％盐酸。

5、系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。

6、培养瓶、培养皿、眼科镊、盖玻片、载玻片、显微镜。

三、实验步骤1、样品制备：对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×105/ml，滴加于盖玻片上（置于6孔板中），培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS洗涤3次。

2、样品固定：95％乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1mi n。

3、染核：苏木素染液染色2－3min，自来水洗涤。

4、分色：镜下观察，若细胞核染色过深，用1％盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。

5、染胞质：浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤。

6、吹干或自然晾干细胞爬片后，中性树胶封片。

1.转染48小时后，弃去旧液，1ml PBS洗两遍用BD公司的固定透膜液400ul （Fixation and Permeabilization Solution）于4度冰箱内固定透膜20分钟后，PBS洗两遍
2.用弯曲的针头挑起爬片，镊子夹出置于载玻片上，内源性过氧化物酶阻断剂室温（无色液体）孵育10分钟
3.吸水纸吸去阻断剂后将玻片在摇床上PBS中洗3次，每次5分钟。

（若洗的次数多则细胞脱片程度也有可能加大，摇洗的力度也不宜过高）
4.滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10分钟，用吸水纸从一侧吸去，勿洗。

5滴加20倍稀释的单抗，800倍稀释的感染血清，于湿盒内37度孵育2小时。

6.吸水纸吸去稀释后的一抗，在摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

7.滴加试剂B（黄色液体）室温孵育10分钟。

8.吸水纸吸去试剂B后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

9.滴加试剂C（橙色液体）室温孵育10分钟。

10.吸水纸吸去试剂C后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

11.显色剂DAB显色。

细胞爬片免疫荧光染色步骤以下是十条关于“细胞爬片免疫荧光染色步骤”的内容：
1. 嘿，先得准备好细胞爬片呀，这就像给细胞搭个小舞台一样重要！你想想，没有好的舞台，细胞怎么能好好表演呢？
2. 然后嘞，固定细胞可不能马虎！这就好比给细胞来个定格，让它们乖乖待着别动，不然怎么染色呀，对吧？
3. 接下来，透化这一步可不能忘！这就像给细胞打开一扇门，让染色剂能顺利进去和它们亲密接触。

4. 哇哦，一到抗体孵育这步就超关键啦！就好像给细胞穿上特制的衣服，让它们变得与众不同。

5. 洗去多余抗体也很重要呀，不然乱七八糟的可不行，这就跟打扫房间一样，得把多余的垃圾清理掉嘛。

6. 再接着，染荧光这步可太神奇啦！就像是给细胞点上了闪耀的星光，让它们瞬间璀璨起来。

7. 封片这一步也不能小瞧哦！这就像是给细胞的小世界加上一层保护罩，让它们安安稳稳的。

8. 哎呀，观察的时候可激动啦！你能看到细胞变得美美的，就像看到了一场华丽的表演，不是吗？
9. 整个过程中，每一步都要细心再细心呀！这就像搭积木，一个不
小心就可能前功尽弃哦。

10. 所以说呀，细胞爬片免疫荧光染色步骤可真不简单，但只要认真做，就能看到超棒的结果！
我的观点结论：细胞爬片免疫荧光染色步骤需要严谨对待，每个环节都很重要，只有认真操作才能获得理想的染色效果。

肿瘤高分文章必备：细胞免疫荧光详细Protocol分享！细胞免疫荧光可以观察蛋白在细胞中的定位，以及一些特殊信号分子蛋白的出核/入核的定位变化。

在进行细胞免疫荧光过程中，需要用到细胞爬片，通过将爬片浸在细胞培养基内，细胞在爬片上生长，进而进行细胞的免疫荧光。

实验前准备：1.胰酶2.DMEM细胞培养基3.细胞培养12孔板或者6孔板4.爬片实验步骤：1．细胞种板与细胞爬片制备：1) 细胞密度在90%-95%左右，用预热胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数。

2)取细胞培养12孔板，在每个孔放爬片的位置根据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴几滴培养基，然后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。

根据自己的需要选择合适的细胞密度种入12孔板培养板内。

3)24h或者48h后，根据细胞生长速度快慢，观察判断细胞密度，约90%时进行细胞免疫荧光。

2．细胞的固定及免疫荧光1)吸除培养基，一般先加入PBS浸洗细胞 3 次，每次 5 min。

2)向孔内加入4%多聚甲醛1ml，进行细胞固定，室温固定20分钟。

3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。

4)向孔内加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20min，目的是使细胞通透。

5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。

6)用10%的与二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封闭2小时（选择的封闭液与后面操作过程中抗体稀释液一致）。

封闭后不需要用PBS清洗。

7)吸去封闭液，向每孔滴加足够量适宜浓度的一抗（第一次使用抗体可以根据抗体说明书推荐浓度，后续实验可以摸索抗体的适宜浓度），4℃湿盒内孵育过夜。

8)吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。

9)向孔内滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，室温避光孵育1小时。

固定液配方（细胞免疫组化，用的是4%多聚甲醛固定的）：我们用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的，然后再用0.1m PB稀释的。

0.1m PB配方（PH值7.4）1000ml磷酸氢二钠48.693g磷酸二氢钠 5.023g三蒸水1000ml12.5%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml多聚甲醛125g三蒸水1000ml 磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下，如仍不溶，加NaOH（三蒸水先放800ml，10小时左右，再补加200ml）4%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml12.5%多聚甲醛320ml0.1m PB 680ml步骤：1 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。

2 PBS清洗标本3次各1 min。

3 冰丙酮固定15 min。

4 空气干燥5min。

5 PBS清洗标本3次各2 min。

6 0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育1次20 min。

7 PBS清洗标本3次各2 min。

8 3%H2O2孵育15 min。

9 DPBS清洗标本3次各2 min。

10 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20min。

11一抗孵育（PBS配，滴度1：200，湿盒）4OC 过夜或37OC 60 min。

阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液12 PBS清洗标本3次各5 min。

13 二抗工作液孵育（湿盒）37OC 30 min。

14 PBS清洗标本3次各5 min。

15 C液（湿盒）37O C30 min。

16PBS清洗标本3次各5 min。

17DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。

18蒸馏水洗2次1 min。

19苏木素复染0.5~1min。

20自来水洗30min。

21树胶封片。

注意事项：1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：（1）对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片；（2）接种的细胞密度适中，以2*104/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4O C冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。