细胞爬片染色步骤

制备细胞爬片1、在无菌培养皿或6孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2×105/ml）。

再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。

将培养皿（6孔细胞培养板）置于 37℃，含 5% CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养。

2、4小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。

3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养（一般为1-3天）。

4、倾去培养液，加 PBS（PH 7.2～7.4）洗涤细胞爬片 2 次，每次 1 min。

5、加 10%中性多聚甲醛（或-20℃预冷的丙酮）固定 10～15min。

6、吸除固定液，加 PBS 再洗涤细胞爬片 3 次，每次 5 min。

7、置于室温下干燥1小时，如暂不染色，先放在-20 冰箱中保存。

8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面（有细胞的为正面）。

将硅化玻片放入饭盒（金属），排好顺序，一定要放平，消毒，将消化好的细胞滴在硅化玻片上，可一片滴两滴，放入培养箱2小时，待细胞贴片，2小时后取出加培液至没过玻片，放培养箱过夜，取出后即丙酮固定，偶做过，效果不错的。

免疫荧光双染用两个不同的物种的原始抗体的双免疫荧光染色基本方案1)冰冻切片，晾干，4%多聚甲醛固定 10～15min。

（细胞爬片固定后，以下步骤一样）2)漂洗和稀释：在10 mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，150mM NaCl（PBS）中漂洗切片，3×5分钟。

PBS液是用来漂洗和稀释的。

其他缓冲液如Tris缓冲碱（TBS）也可用。

3)在细胞爬片上加0.03%-1% Triton X-100溶液处理15min。

（若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省略），PBS液洗3×5分钟4)阻断步骤：用含5%的正常二度抗体物种来源血清的PBS孵化切片60分钟。

（37℃）（一抗前不洗，只甩干）5)原始抗体：在切片上吸干多余的阻断液，在室温下孵化60分钟或在4℃下相应地用稀释的两个物种（如鼠和兔）的未标记的一度抗体混合一起孵化过夜。

软骨细胞甲苯胺蓝染色
1%甲苯胺蓝配制
原液：1g甲苯胺蓝粉末+10ml 70%酒精溶解（据说可保存6个月）
工作液：取上述原液1ml+9ml 1% NaCl 溶解，滤纸过滤（用时新鲜配制）
1% NaCl：1gNaCl + 100ml 蒸馏水（用时新鲜配制）
染色步骤：
（1）爬片用PBS洗2次，直接用4% 多聚甲醛固定于6孔板中1h或更长时间（4度）（2）自来水洗15分钟，最好不要直接冲爬片，易脱片
（3）蒸馏水洗5分钟
（4）加1%甲苯胺蓝浸染2h
（5）去除多余染液，我觉得可以用注射器从6孔板中吸走。

有人说用90%酒精的，但一定要慎重。

否则时间稍长，就会将颜色洗脱。

当然洗脱后仍然可以从（4）开始重复。

（6）镜下观察，满意后晾干，中性树胶封片（或者镜下观察）。

细胞染色操作步骤及注意事项概述细胞染色是一种常用的实验手段，它可以通过标记细胞的某些特定结构或分子，帮助研究者观察和研究细胞的结构和功能。

本文档将介绍细胞染色的常用操作步骤及注意事项。

操作步骤步骤一：细胞固定1. 取出培养皿中的细胞载玻片。

2. 用PBS缓冲溶液洗涤细胞载玻片，去除培养基中的残留物质。

3. 使用细胞固定液（如4%的甲醛溶液）固定细胞，通常固定时间为15-30分钟。

4. 用PBS缓冲溶液洗涤细胞载玻片，去除固定液中残留的甲醛。

步骤二：细胞渗透1. 取出细胞载玻片中的细胞。

2. 用PBS缓冲溶液洗涤细胞载玻片，去除固定剂中的残留物质。

3. 在细胞载玻片上滴加渗透液（如0.1% Triton X-100），孵育10-15分钟。

4. 用PBS缓冲溶液洗涤细胞载玻片，去除渗透液中的残留物质。

步骤三：染色1. 取出细胞载玻片中的细胞。

2. 在细胞载玻片上滴加适当浓度的染色液（如DAPI染料），孵育时间根据实验需要而定（通常为5-15分钟）。

3. 用PBS缓冲溶液洗涤细胞载玻片，去除染色液中的残留物质。

步骤四：显微观察1. 将细胞载玻片翻转到显微镜载玻片上。

2. 加入一滴适当的封片液（如甘油/丙酮溶液）。

3. 用显微镜观察和拍摄细胞。

注意事项1. 操作时要注意佩戴实验手套和眼部防护设备，避免接触有毒或有害物质。

2. 细胞固定液需要根据实验需要和细胞类型进行选择，避免使用具有细胞毒性的固定液。

3. 染色液要根据需要选择，确保染色剂与研究对象的亲和力。

4. 操作过程中要注意细胞的温度和湿润度，避免细胞损伤。

5. 洗涤的PBS缓冲液要充分冲洗，避免残留物质对结果的影响。

6. 操作前要确保显微镜和镜头清洁，以获得清晰的观察结果。

7. 操作结束后要及时清理实验台面和工具，避免交叉污染。

结论细胞染色是一种重要的细胞学研究手段，通过本文档介绍的操作步骤及注意事项，可以帮助研究者正确地进行细胞染色实验。

合理的实验操作和注意细节能够提高实验结果的准确性和可靠性。

二、实验目的
1．巩固细胞传代技术。 2．掌握细胞爬片的方法。 3. 为细胞骨架的观察提供实验材料
三、实验材料及设备
1.细胞 CHO细胞、鸡胚成纤维细胞、HeLa
2.试 剂 DMEM培养基、血清、抗生素、胰酶
3.仪 器
超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜
4.其它用品： 盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿（六孔板）、 试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、 废液缸。
细胞传代（II） -------细胞爬片
2018.10.19
一、实验原理
1.细胞爬片
细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在 玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，切片， 细胞涂片，原位杂交等。
细胞爬片采用的玻片可以是普通的盖玻片也 可以用细胞爬片专用玻片。使用普通盖玻片时， 要按照玻璃器皿的清洗方法进行清洗，并进行高 压灭菌。专用玻片通常已经过处理可直接使用。
6. 加两滴管含10%FCS的DMEM培养基反复冲瓶壁上 的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成 细胞悬液，细胞计数，将细胞稀释成1105/mL）
7. 在35mm培养皿中加入1 mL细胞悬液+1 ml完全培 养基，镜下观察细胞密度和状态，标记细胞名称及 操作者。
8. 将细胞放入5%CO2、37℃培养箱培养，至下次课 期间换液即可。
9. 整理实验用品。
下次课内容：细胞骨架及细胞核染色 11月2日：期中考试（已学操作，无菌规范）
四、实验步骤：
1. 将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。
2. 用灭菌小镊子将处理好盖玻片轻轻放入35mm培养 皿中。
3. 打开细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉 或吸出培养基。细胞层，弃胰酶，再加入一滴管胰酶，盖好瓶盖。

细胞爬片细胞爬片【玻片的准备】1. 爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2．将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者培养皿中烘干后进行高压消毒再烘干。

4.多聚赖氨酸处理玻片，以使细胞与玻片结合更牢。

【细胞爬片】1. 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2. 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可。

4. 待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5. 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

【细胞爬片的固定】1.细胞爬片取出后，一般用PBS洗x2遍，然后再做固定。

2.室温固定15分钟后，弃去固定液，PBS洗3x3min，洗尽液体。

3.将表面液体吹干，入-20℃保存以下为常用的固定液（1）. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。

主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存（2）. 甲醛(福尔马林)应用最广缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。

可造成假阴性的染色结果。

（3）. 冷丙酮可用于一般的免疫组化染色。

2 / 2（4）. 95％乙醇，可用于免疫组化。

优点：穿透性强、抗原性保存较好。

缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

【高中生物】三种细胞免疫荧光染色操作具体步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，以下主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

【zo-1的免疫荧光】步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×pbs洗脸3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×pbs洗脸3次，每次10分钟5、0.2%tritonx-100透化2-5分钟6、1×pbs洗脸3次，每次10分钟7、5%bsa室温封闭30分钟8、加一抗(用1%bsa吸收)放到烫盒里，4渡过夜9、1×pbs洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%bsa吸收)30分钟，闭光11、1×pbs洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%triton，5%bsa均用1×pbs稀释从大鼠拆分的t细胞若想轻易搞细胞免疫荧光【细胞爬片的免疫荧光】步骤：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，pbs洗三遍。

特别注意：有的时候并作的细胞爬片可能将比较大，因此托盘的时候必须小心，特别注意反正面，放到皿里洗脸比较便利，防止了往复托盘，另外洗脸的时候提pbs不要太冲，不要细胞流下来。

洗脸的时候我都就是多提pbs，稍伸一下就死掉，没等5分钟或10分钟。

2.4%冷的多聚甲醛固定20分钟，pbs洗三遍。

3.0.2%tritonx-100通透10分钟，pbs洗脸三遍。

4.与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，pbs洗三遍。

5.一抗炎4度烫盒内过夜，也可以37度2小时，感觉前者效果不好，pbs洗脸三遍。

6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，pbs洗三遍。

7.最出色用dapi染核，然后轻易照荧光片。

8.蒸馏水洗掉pbs，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

精品文档实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。

为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。

在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。

能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。

1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂( 如 Decon)浸泡 5min，间或振荡。

2、用自来水冲洗 5min。

3、以 1％盐酸— 70％乙醇溶液浸泡5min。

4、烤箱干燥 ( 至此即可用于普通染色 ) 。

5、多聚 L- 赖氨酸 (1:10 溶于去离子水 ) 浸泡 5min，振荡。

6、入 60℃烤箱 1 h，或室温过夜干燥 ( 用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学 ) 。

二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。

同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。

1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。

2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。

对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞， PBS漂洗 2～3 次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后， PBS液漂洗 2～3 次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。

3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。

主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇 ( 锇酸 ) 。

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

股票代码：430601如有疑问欢迎垂询上海电话：************E-mail：**********************苏州电话：*************E-mail：************************ RNA FISH试剂盒（细胞爬片）说明书股票代码：430601一、检测原理RNA荧光原位杂交（Fluorescence in Situ Hybridization），简称为RNA FISH，是一种重要的非放射性原位杂交技术。

它的基本原理是：用已知的荧光染料标记单链核酸为探针，按照碱基互补配对原则，与待检测的RNA特异结合，二者经变性-退火-复性，即可形成靶RNA与核酸探针的杂交体，随后在荧光显微镜下对待测RNA进行相对定性、定量或定位分析。

二、组分和保存条件成分容量（50tests）容量（100tests）储存Buffer A（TritonX-100）30μL60μL室温Buffer C（20×SSC）6mL12mL室温Buffer E（杂交缓冲液）8mL16mL室温Buffer F（Tween20）50μL100μL室温DEPC水6mL12mL-20℃DAPI15μL30μL-20℃股票代码：430601三、试剂配置1.0.1%Buffer A配制：PBS999μL，Buffer A1μL，且每次新鲜配制；2.Buffer C母液为20×，用一级纯水稀释成4×、2×或1×使用；3.0.1%Buffer F配制：4×Buffer C999μL，Buffer F1μL，且每次新鲜配制；4.DAPI工作液：DAPI原液用PBS1000倍稀释，需避光保存和使用。

注意：1.探针应避光稀释并保存，且实验过程中加入探针后的操作应在避光条件下进行。

2.实验过程中常用试剂，如多聚甲醛等请您自备。

3.探针配制方法及保存请参考探针使用报告。

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞;在进行各种染色前常需先制备成涂片..为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落;必须使其牢固贴附于载玻片上..在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一..能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等;这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法..1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂如Decon浸泡5min;间或振荡..2、用自来水冲洗5min..3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min..4、烤箱干燥至此即可用于普通染色..5、多聚L-赖氨酸1:10溶于去离子水浸泡5min;振荡..6、入60℃烤箱1 h;或室温过夜干燥用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学..二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来;避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等;使细胞和组织内的各种酶失去活性;防止细胞和组织的各种分子变性、解离;使细胞的化学物质和酶能准确定位;并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏..同时;固定还可使细胞的各部分易于着色;适于观察、长期保存和分析..1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法..2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物;如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料..对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说;常通过离心收集细胞;PBS漂洗2～3次后;备固定制片；对盖片单层培养物来说;将盖片从培养器皿中取出后;PBS液漂洗2～3次;以洗去血清和附着于细胞表面的残渣;备固定用..3.常用固定液：常用的固定液分两类;一类是以单一化学物质配成的固定液;称简单固定液..主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇锇酸..另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液;称混合固定液..如Mueller固定液、Flemming固液、FAA固定液、 Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等..不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同..因此;选择合适的固定液是达到固定目的的基础..14％甲醛-PBS:甲醛是一种气体;其饱和水溶液无色;约含40％甲醛..在很多情况下;甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀..4％甲醛-PBS使组织变硬速度比乙醇快;并能较好地保存组织的外部形式;固定效果不受制片影响;固定材料可用苏木精和其他合成染料染色..甲醛的穿透力较强;对组织固定均匀;能增强组织的弹性;大标本的固定和保存多用甲醛..甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液;在冷冻切片中;甲醛作固定剂具有显著的优点..用40％甲醛水溶液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液..2丙酮：丙酮为无色易挥发液体;用纯冷丙酮4℃固定细胞内酶效果较佳..3乙醇：乙醇又称酒精;固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细胞等效果优良..无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定液..乙醇除有固定作用外;还具有硬化和脱水的作用..作为固定用乙醇的适宜浓度为70％～100％..乙醇的缺点是渗透力差;并使组织收缩..4醋酸：常用0.3％～5％浓度的醋酸作固定剂..醋酸能和水及乙醇、甲醇溶合;醋酸不固定蛋白质;但能固定核酸..醋酸的穿透力很大;它对细胞的膨胀作用显著;这是由于它破坏了某些蛋白质分子的结合;所以;常用醋酸来减少其他固定剂引起的细胞收缩..细胞学技术中;它能防止细胞收缩;并能较好地保存染色体;还能把染色质沉淀成为可染色的块状体..5苦味酸：苦味酸是黄色结晶体;强酸;可溶于水、乙醇、苯和二甲苯;在水中的溶解度可因水温变化而变化..苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、组蛋白和核酸..苦味酸的穿透力很慢;单独使用时;造成组织严重收缩..它和其他药物混合配制时;可以作为蛋白质的沉淀剂;同时可避免组织收缩、硬化;而且易于染色..所以在很多混合固定液中被广泛采用..作固定用的最适浓度为1％..6锇酸四氧化锇：锇酸是一种强氧化剂;不能同乙醇和甲醛混合使用..它的挥发性很强;挥发出来的气体能固定结膜;对眼睛很有害;所以操作时应特别注意..四氧化锇是保存细胞结构的最好固定剂之一;配制时先在棕色试剂瓶中盛入50～100ml 0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.0～7.4;再将装有1g锇酸的安培瓶放人PBS中;以玻棒击碎安培瓶;摇荡使锇酸溶解;备用..常用的固定液浓度为1％～2％..7戊二醛：戊二醛对组织的渗透率高;与蛋白质反应快;能较好地保存蛋白质;对微管和膜性结构保存亦比较好;并能较好地保存糖原..常用的戊二醛固定液配制方法列于表12-1..表12-1 常用的戊二醛固定液配制方法8甲醇／醋酸固定液：甲醇：醋酸为3:1的固定液是应用最广的一种培养细胞固定剂..甲醇穿透力好;醋酸固定蛋白效果好;两者结合;能使固定细胞形态不变..不仅最适用于固定染色体;而且固定的染色体适于Giemsa染色注意：此固定液宜现用现配..9FAA固定液：此固定液适用于固定盖片单层培养的细胞;固定效果好..配制方法：90ml 80％酒精中加5ml冰乙酸和5m140％甲醛..10Carnoy固定液：Carnoy固定液是较好的非水溶性固定液;是显示细胞化学成分如粘多糖等时常用的固定剂;固定、保真效果好;但穿透力差;适于固定培养的单层细胞..配制方法：60ml纯酒精加30ml氯仿和10ml冰乙酸..11Bouin固定液：用于固定双盖片法培养的标本;固定30分钟后;用70％酒精褪去苦味酸黄色;如不立即染色;可将标本保存在70％酒精中..本试剂适于固定组织细胞的糖原..配制方法：先将75ml饱和苦味酸100ml水中加1.2～1.4g过滤;加入25ml福尔马林40％甲醛;有沉淀时禁用;最后加入5ml冰醋酸;混和后存于4℃冰箱中备用..冰醋酸最好在临用前加入..该固定液对组织细胞穿透力较强;固定效果较好;保存的细胞结构完好..但因偏酸pH为 3～3.5;对抗原有一定损害..124％多聚甲醛-PBS固定液：多聚甲醛为白色固体;在50ml蒸馏水中加入4g多聚甲醛;加热至60～70℃时;边搅拌边逐滴加入2mol/LNaOH;至液体清晰透明..用1mol/LHCl调节pH 至7.4;冷却后加入 0.01mol/LPBS液至100ml;4℃保存..本试剂适于固定肾纤维蛋白和细胞骨架蛋白..三、常见的细胞染色方法1普通染色观察苏木精-伊红hematoxylin-eosin;HE染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般形态的最常用方法;也是把细胞作为标本保存的主要方法..对于贴壁培养的细胞;以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作..固定前先用Hanks液、PBS、BSS或生理盐水清洗培养物2次;去除妨碍染色的血清..固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上;以利操作..对于悬浮培养细胞;须先经离心沉淀1000r／min;10min;弃上清液后留少量液体;将细胞悬液滴于玻片上做成涂片;冷风吹干..1.1HE染色法1.1.1染液配制1苏木精染液：这里介绍鄂征1995改良的Mayer法..称取0.5g苏木精;5.0g 铵矾或钾矾;0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水..再加入30ml甘油; 2ml冰醋酸..混匀..过滤后即成母液..可长久保存..用蒸馏水以1:20稀释即成工作液;可用很长时间..每次染色前宜过滤;去除氧化膜..2伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分..将0.5g伊红溶于100m170％乙醇或蒸馏水即成工作液..1.1.2染色程序1用10％甲醛福尔马林固定培养物30min;或以丙酮固定15min..2蒸馏水洗1次后;入苏木精染液5～10min染细胞核..3 入0.5％盐酸-70％乙醇溶液30～1min;脱去胞质的着色..此时核呈紫红色..4入碱性溶液碱化;使细胞核变成蓝色..如果时间允许;最好用自来水呈弱碱性长时间浸泡..也可入1％NaHCO3溶液..此过程须不断用显微镜监视;以掌握碱化时间..5蒸馏水洗1 min;去除残留的碱性溶液;否则影响伊红着色..6入伊红染液30s～1 min..7用梯度乙醇溶液脱水：70％、90％、95％乙醇各30s～1 min；100％2次各2min..如伊红为乙醇溶液;略去70％乙醇..8用二甲苯透明2次;各5min..9树胶封固..1.1.3染色结果细胞核呈紫蓝色或深蓝色;大部分细胞的胞质呈粉红色..如果胞质内含较多核糖体例如淋巴细胞则亦呈蓝色..1.2吉姆萨染色法此法可将细胞核与胞质同时染色;故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握;效果常不如HE染色稳定..1.2.1吉姆萨Giemsa染液的配制1取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油;置于60℃温箱;约3h后溶解..2取出后倒入50ml中性甲醇;即为母液..于棕色瓶可长久保存..需要注意的是;有的甲醇内含醋酸;会使染液中的伊红沉淀出来;不利染色..3将母液与0.1 mol／LPBSPh6.9～7.2按1:9混合即成工作液..吉姆萨染液对pH极敏感;偏酸时染色过红;偏碱时则过蓝..所以;工作液宜现用现配;保存时间不超过48h以免被CO2酸化..1.2.2染色程序1将标本用甲醇固定5～10min..2入吉姆萨液染色10～15min..可用染色缸；或将染液滴覆于标本..3蒸馏水清洗;空气干燥;二甲苯透明;树胶封固..1.2.3染色结果细胞核呈蓝或蓝紫色;胞质呈色与HE染色相仿..。

蛋白实验技术——免疫组化实验步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉。

2. 水浴锅。

（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。

2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB，ph6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。

4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至ph8.0，加水1000ml。

5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。

b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制。

8．TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。

（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复：在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。

细胞爬片RNA FISH具体说明及步骤一、检测原理RNA荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization），简称为RNA FISH，是一种重要的非放射性原位杂交技术。

传统的RNA FISH，直接在oligos上标记荧光素，根据碱基互补配对原则，与待检测的RNA特异结合，通过荧光显微镜以检测荧光信号，该方法一般需要20个oligos以上，以便检测到较强较多的荧光信号点。

本系统中SA（链霉亲和素蛋白）是一类四聚体蛋白，大小为66KDa，每一分子SA能够与四分子生物素进行高度特异性的结合，且两者之间的亲和力较强。

应用该原理，我们将染料Cy3偶联到SA蛋白上，一分子SA能偶联上6个Cy3；同时在探针上标记生物素，将两者在体外进行亲和连接，大约每个SA能与4条oligo-Biotin结合，每个SA上有6个Cy3，也就是每一条探针上连接了6个Cy3，因此该方法具有一定的放大信号的作用二、实验方法贴壁细胞（以48孔板为例）1.按照1×104细胞/孔的密度将贴壁细胞接种于48孔板（孔内提前放入已处理好的且大小合适的盖玻片）中（建议事先铺在Confocal专用培养皿中），于培养箱中培养过夜；2.吸弃培养基，PBS洗两次，每次5min；3.吸弃PBS，每孔加入100μl 4%多聚甲醛，室温固定15min；4.吸弃4%多聚甲醛，每孔加入100μl 0.5% Buffer A（现用现配）室温处理细胞15min（细胞通透）；5.吸弃0.5% Buffer A，PBS洗两次，每次5min；6.每孔加入100μl 1×封闭液，37°C孵育30min；7.吸弃1×封闭液，每孔加入100μl 2×Buffer C，37ºC培养箱放置30min；8.Buffer E提前在73ºC水浴锅孵育30 min，至澄清透亮；探针稀释：可参看标签或报告单上所示参数：nmole/OD260，例如：nmole/OD260= 4.17，则在每OD探针干粉制品中加入41.7μl灭菌DEPC水，混匀后即得浓度约为100μmol/L的储存液，建议进行分装后避光储存于-20°C，避免多次冻融操作；10.配制探针工作液：将探针储存液稀释至1μmol/L，放入75°C水浴锅变性10min，然后与SA-Cy3按比例加入到PBS，（以10μl体系为例，即1μl 1μmol/Lbiotin-probe+1μl1μmol/LSA-Cy3+8μl PBS），37度孵育30min（可做预实验确定探针和SA-Cy3的比例，例如1:1，2:1，4:1，8:1等）；11.将上述10μl探针工作液和90μl Buffer E混匀；12.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl变性后的探针混合液，采取避光措施后置于37ºC培养箱中杂交过夜（12-16h）；13.杂交次日，将样本从37ºC培养箱取出，吸弃探针混合液，每孔加入100μl0.1% Buffer F于37ºC洗涤10min；14.吸弃0.1% Buffer F，每孔加入100μl的2×Buffer C，60ºC洗涤10min，洗涤3次；15.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl 的2×Buffer C，37°C洗涤10min，洗涤3次；（如果背景深时，建议适当提高洗涤温度及次数）16.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl稀释后的DAPI工作液，避光染色10 -20min；17.吸弃DAPI工作液，PBS洗涤2次，每次5min；18.滴加甘油或抗淬灭剂，盖上盖玻片，封片胶封片于荧光显微镜下观察。

细胞爬片荧光原位杂交流程
细胞爬片荧光原位杂交实验步骤
1. 准备细胞爬片：选择适当的细胞爬片，如盖玻片或载玻片，并进行适当的处理，如涂布血清或明胶。

2. 细胞培养与固定：将细胞种植在爬片上，培养一定时间后进行固定，常用的固定剂包括甲醇和冰醋酸等。

3. 脱蜡与水化：将固定好的爬片放入脱蜡缸中，按照规定程序进行脱蜡，然后进行水化。

4. 通透处理：用一定浓度的盐酸或甲酸对细胞进行通透处理，使探针能够进入细胞内。

5. 杂交：将标记有荧光染料的核酸探针与细胞中的核酸进行杂交，通常在一定温度下进行一定时间的杂交。

6. 洗涤：杂交后需要进行充分的洗涤，以去除未结合的探针和杂质。

7. 观察：在荧光显微镜下观察杂交结果，记录荧光信号的位置、强度等信息。

8. 数据分析：对观察到的荧光信号进行分析，计算荧光密度、阳性率等指标，并进行统计学处理。

需要注意的是，荧光原位杂交技术是一种相对复杂的技术，需要一定的实验技能和经验。

在进行实验前，应充分了解实验原理、操作步骤和注意事项，严格遵守实验室规章制度和操作规程。

1．将特殊处理过的（转染某个基因或用药物处理后） 永生化的活细胞种在某种载体上培养一段时间后 形成细胞单层时（注意：细胞不能太密）停止培 养，用PBS洗去血清，快速在去离子水中脱盐后用 4度冷丙酮固定30分钟。
2．PBS洗 3．0.3%双氧水封闭10分钟。 4．PBS洗 5．滴加一抗37℃孵育2小时。 6．PBS洗 7．滴加通用二抗。 8．PBS洗 9．DAB显色
二、实验过程中应注意的一些问题
细胞载体的处理： 盖片和载片在接种细胞前一定要处理好， 不要怕麻烦。盖片和载片入酸前要将所附 着的脏东西洗干净。过蒸馏水和酒精时要 用镊子一片一片的过，平放在干净滤纸上 自然干燥。包装好后经烤箱干烤消毒保存。
2．细胞种植时应注意的一些问题：
选用何种载体：细胞在盖片和载片上一般4小时就 可以贴壁并开始生长，如果细胞贴壁后不需再进 一步处理，则可以将细胞爬在载片上，载片不用 消毒，也可以用DAKO笔在载片上画圈。用 DAKO笔划过圈的载片最好不要干烤消毒。细胞 帖壁后还要加药继续培养若干时间的则应选用盖 片爬片，这时盖片最好选用160度干烤消毒。
不要放在木制的片盒里，尤其是新的木 制片盒，木制品里的甲醛会影响抗原的表 达。如果放在新的木制片盒,要做恢复抗原. 细胞爬片制好后最好马上染片.
细胞的亚建康对实验结果的影响
当我们培养细胞时,细胞长得很差时我 们会把它们扔掉,不会用它们做进一步 的实验.但长得不太好,我们观察细胞时 有时分辨不出来,就可能使我们白做工, 既浪费了时间又浪费了 经费.这是一个 值得我们注意的问题.
此爬片由于该盖片 处理得不好,虽爬上 细胞但细胞的形态 很差,表现在细胞膜 和细胞器边界不清 晰
U251MG培养细 胞 (10hr)扫描电镜图
FN
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细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤1.爬片的准备1)爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；用盖玻片时，可根据自己的需要用小砂轮或玻璃刀剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；2)将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，然后置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后高压消毒。

高压消毒后取出放入烘箱中烘干，烘干后可放入超净台中备用。

3)可将爬片用多聚赖氨酸处理，以使细胞与爬片结合更牢固。

1mg/ml的多聚赖氨酸用0.22um的滤器过滤除菌后分装于经过无菌处理的1ml 细胞冻存管内保存在4℃里，三个月内仍然可以使用。

用时将高压灭菌过的爬片放到0.1mg/ml的多聚赖氨酸溶液内浸泡5min，无菌晾干即可（放入培养板孔内注意爬片的正反面）。

或将爬片铺于培养皿中，将多聚赖氨酸溶液滴于爬片上，室温10分钟后，吸除玻片上的溶液，在超静台内晾干后使用。

储存、稀释和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。

2.细胞爬片1)胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数。

2)根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内。

滴加细胞悬液时，根据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，然后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。

若细胞贴壁能力不强，爬片可经多聚赖氨酸浸片后放入。

3.细胞的固定及免疫荧光1)在培养板中培养好细胞后，吸除培养基，一般先使用PBS轻洗细胞2×3 min，然后再做固定（凋亡的TUNEL染色等可以不清洗）。

2)固定：加入4%多聚甲醛(PBS配制)固定20分钟。

如果暂时不能立即做组化检测，使用含0.4%多聚甲醛的PBS PH7.4浸泡细胞（注意在免疫组化检测完成前不要让细胞变干，否则细胞收缩形态不好）。

三种细胞免疫荧光染色操作步骤三种细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫荧光，步骤如下:1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注:4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致:1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意:有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

细胞爬片tc处理原理-概述说明以及解释1.引言概述:细胞爬片(tc)处理是一种重要的实验技术，广泛应用于细胞生物学领域。

通过tc处理，研究人员可以将细胞分离、固定、染色并观察细胞形态和结构，从而深入了解细胞的生物学功能和机制。

本文将详细介绍tc处理的原理、应用和优势，旨在帮助读者更好地理解和应用这一重要的实验方法。

写文章1.1 概述部分的内容1.2 文章结构文章结构部分主要描述了整篇文章的框架和内容安排。

具体包括引言、正文和结论三个部分的内容。

引言部分概括介绍了文章的主题，引出了讨论的话题，并说明了文章的结构和目的。

正文部分详细介绍了TC处理原理的概述、应用和优势，通过理论知识和实践案例来说明TC处理的重要性和价值。

结论部分总结了TC处理的重要性，展望了TC处理的发展前景，并给出了文章的结束语，强调了文章的主题和意义。

通过清晰的文章结构，可以让读者清楚地了解文章的内容框架，帮助他们更好地理解文章的主题和论点。

1.3 目的本文的目的是探讨细胞爬片TC处理原理，深入了解其在生物学和医学领域中的应用和优势。

通过对TC处理原理的概述和分析，我们旨在帮助读者更好地理解细胞爬片技术的工作原理，并为其未来的研究和应用提供参考和指导。

同时，我们也将总结TC处理在细胞研究中的重要性，展望其未来的发展前景，并希望通过本文的介绍，能够促进该领域的进一步研究和发展。

2.正文2.1 TC处理原理概述TC处理原理是一种在细胞学研究中常用的技术手段，通过对细胞进行爬片处理，可以观察到细胞内部的结构和功能。

TC处理原理主要包括以下几个步骤：首先，将要进行TC处理的细胞培养在一个含有适当营养物质的培养基中，使细胞以最佳状态生长。

其次，利用显微镜观察细胞的生长情况，确定需要进行TC处理的细胞类型和数量。

接着，将细胞培养皿放置在一个特制的TC处理装置中，将装置调整到适当的温度和湿度条件下。

然后，利用专门设计的细胞爬片工具，对细胞进行精细的处理，清晰地观察到细胞内部结构的变化。