TBE-300B型高速逆流色谱分离仪讲解

l 高速逆流色谱是液相色谱的一种新技术，无需载体，从几种色谱原理方法可以清晰说明。

大约50年前，根据对两种液体进行分配的理念，产生了两种相似的方法：逆流分配技术和液-液色谱分配技术，即：逆流色谱和液相色谱。

30年前，日本Sanki Engineering Ltd.利用前一种技术开发出了高性能的逆流色谱仪（HPCPC），它结合了液相色谱中的快速、高效和先进技术。

HPCPC尤其在利用色谱技术进行半制备和全制备的应用中倍受瞩目，它和采用色谱柱技术的液相色谱在四个方面具有显著优势：● 无样品损失：因为流动相和固定相都是液体，样品可以全部回收。

● 大容量和高的分离能力：流动相和固定相的体积比明显很高，从而无需更大的理论塔板数，就可以获得更大的容量和更高的分离能力。

● 十分灵活的两相系统：（两种、三种、四种溶剂混合）为了获得一种纯的化合物，实验中需要比较灵活的更改流动相，HPCPC可以很方便地调整两相的极性。

● 溶剂消耗少：相对于色谱柱制备系统，对于同样的制备量，HPCPC的溶剂消耗量只有十分之一，使用逆流色谱在实验室完成分离后，可以直接放大到生产规模。

● 固定相价格低：另一个显著优点是逆流色谱的固定相是溶剂，相比色谱柱中的填充材料价格低很多；而且固定相可以很容易再生，一些添加的物质如手性选择剂或复杂的配位体可以无损失地回收，国际上出版的论文可以提供十分有用的信息和应用参考。

新型的高速逆流色谱仪HPCPC广泛地应用于化学领域的纯化，如抗生素、缩氨酸、丹宁酸、皂角苷、油脂、药品等，将来的发展可以预见更大规模和产量的HPCPC设备出现，在化学领域将更加广泛地应用，如手性药物分离等。

与传统制备液相的优势● 逆流色谱仪HPCPC十分快速由于固定相溶剂通过离心力保留在分配通道中，可以不用顾及分离精度的高低要求而让流动相的流速保持很高。

● 明显优于传统制备液相由于逆流色谱仪HPCPC不需要固定相，不会出现对十分昂贵的样品产生不可逆转的保留，而在传统色谱柱的液相色谱中，经常出现的变性和分解现象在逆流色谱不会产生，同时保留了原来的生物活性。

高速逆流色谱原理(HSCCC：High Speed Counter-Current Chromatography)液相色谱系统构成高速逆流色谱系统构成TBE300A＋ÄKTA Prime逆流色谱原理萃取：利用物质在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使物质从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。

逆流色谱原理液－液分配色谱：利用样品中各组分在两相溶剂间分配比的差异，进行分离。

它是不用固态载体的全液态的液-液分配色谱技术.优点：不存在样品的不可逆吸附，理论回收率为100％极大地避免了样品的变性问题操作简单，无需太多样品前处理等。

HSES 流体静力平衡体系在充满下（上）相的螺旋管内慢慢注入上（下）相，最终会形成整个管柱里上下两相交替分段分布的状态。

无论哪一相作为流动相，都能建立起流体静力平衡状态。

如果流动相与管壁亲和性强，它会均衡沿管壁流过形成连续流，如果亲和性较弱，会形成小滴穿过固定相。

液滴逆流色谱(DCCC)旋转腔室逆流色谱(RLCCC)离心分配逆流色谱仪(CPC)利用离心力产生的恒定立场讲固定相保留在又管道连接的一系列腔体中。

优点：噪声小、平衡性好，多数溶剂系统都可在该仪器使用，流动相流速为数毫升每分钟。

由于死体积存在，两相溶剂难以充分混合，与同体积的流体动力学的逆流色谱仪相比分离效率差。

这类一起都是采用旋转密封接头，不可避免产生溶剂渗漏问题。

HDES流体动力平衡体系螺旋管力能保留住任一相充当的固定相，并能形成在数量上超过螺旋单元数的分配单元。

在螺旋管的各个部位，由大量小滴构成了两相间广阔的界面，这些小滴在支撑相里剧烈而稳定的震荡，减小了质点传递阻力，避免了使样品区带展宽的层流的产生。

螺旋管里不存在完全由流动相占据的无效空间，无论以哪一相做流动相，在整个螺旋管的有效空间里总是有一相会形成剧烈而稳定震动小滴，靠这样的运动和分布能开发出有效的逆流色谱仪。

两相不相溶的溶剂在一根绕自身轴旋转的螺旋管内，其中一相的小液滴会向首端迁移，另一相向尾端迁移。

高速逆流色谱法分离纯化丹参中丹酚酸B和迷迭香酸李行诺;张文强;楚楚;童胜强;颜继忠【摘要】研究建立高速逆流色谱法分离制备丹参中丹酚酸B和迷迭香酸.丹参药材经过提取、大孔吸附树脂吸附处理得到粗品,然后以Ⅴ(正己烷)∶Ⅴ(乙酸乙酯)∶Ⅴ(乙醇)∶Ⅴ(水)=3∶7∶1∶9为两相溶剂体系,上相为固定相,下相为流动相,流速1.8 mL/min,检测波长280 nm,利用制备型HSCCC分离制备丹参中丹酚酸B 与迷迭香酸,利用HPLC测定分离得到的化合物Ⅰ和Ⅱ.纯化后的丹酚酸B(Ⅰ)和迷迭香酸(Ⅱ)经HPLC检测,质量分数分别达到98.4％和95.0％.结果表明:该方法快速简便,制备样品纯度高.【期刊名称】《浙江工业大学学报》【年(卷),期】2014(042)005【总页数】4页(P509-512)【关键词】丹酚酸B;迷迭香酸;高速逆流;丹参【作者】李行诺;张文强;楚楚;童胜强;颜继忠【作者单位】浙江工业大学药学院,浙江杭州310014;浙江工业大学药学院,浙江杭州310014;浙江工业大学药学院,浙江杭州310014;浙江工业大学药学院,浙江杭州310014;浙江工业大学药学院,浙江杭州310014【正文语种】中文【中图分类】R917.101丹参为唇形科植物Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根，具有活血通经、祛瘀止痛、清心除烦的药效[1].丹参的化学成分主要为水溶性的丹酚酸类与脂溶性的丹参酮类.丹酚酸B具有强烈的抗氧化和清除氧自由基的活性[2-4]，2010版中国药典将丹酚酸B作为丹参的指标成分[1].迷迭香酸是一种天然抗氧化剂，具有抗炎抗氧化等活性[5].在中药研究的过程中[6-7]，制备高纯度的单体化合物对中药药效物质基础的深入研究具有十分重要的意义.高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography)作为一种新型液液分配色谱技术，使用液相作为载体，因此有效避免了固体载体吸附、样品损失等缺点.由于HSCCC具有制备量大、回收率高等优点，近年来广泛应用于中药活性成分的制备分离[8-10].研究应用HSCCC分离制备中药丹参中的丹酚酸B与迷迭香酸，以期为丹参有效成分的制备提供快速简便的方法.1 仪器与材料Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，色谱柱为Phenomenex Gemini C18键合硅胶柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)；TBE-300A高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司)；N2000色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司)；恒流泵(北京圣益通技术开发有限公司)；紫外检测器(上海同田生化技术有限公司)；恒温循环器(北京德天佑科技发展有限公司)；旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；Bruker AVANCE Ⅲ型磁共振波谱仪(TMS为内标，瑞士Bruker公司，500 MHz).HSCCC分离用溶剂(正丁醇、乙酸乙酯等)为分析纯.HPLC用试剂甲醇、乙腈为色谱纯(美国Tedia).中药材丹参，购于药店，由楚楚博士鉴定为Salvia miltiorrhiza Bge，留样保存于浙江工业大学药学院.2 实验方法2.1 HPLC分析条件色谱柱Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)，流动相为V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(甲酸)∶V(水)=30∶10∶1∶59；柱温30 ℃，体积流量0.5 mL/min，检测波长282 nm[1].2.2 样品处理2.2.1 提取丹参药材粉碎，过60目筛，称取粉末100 g以50%乙醇溶液为提取溶剂，料液比1∶10，加热回流提取3次，每次1 h，过滤，合并滤液并浓缩.2.2.2 预纯化将提取浓缩物用乙酸乙酯萃取，旋去溶剂.取乙酸乙酯萃取物10 g用AB-8大孔吸附树脂进行初步分离，上样后静置2～3 h，待树脂充分吸附后，用水洗脱至洗脱液无色，弃去，再分别用6 BV的10%乙醇，30%乙醇，40%乙醇，50%乙醇，60%乙醇，95%乙醇溶液进行梯度洗脱，体积流量3 BV/h，收集洗脱液，回收乙醇，干燥.用HPLC检测洗脱液，将含有目标成分的部分冷冻干燥，用于HSCCC 进一步分离纯化.2.2.3 HSCCC溶剂体系的选择溶剂体系是HSCCC成功分离的关键.本研究通过测定丹酚酸B在不同溶剂体系中的分配系数K从而优选出合适的溶剂体系.具体操作：将不同溶剂按照一定比例配制，充分混匀，静置平衡后取经预纯化得到的粗品用2 mL上相与2 mL下相的混合液溶解，震荡静置分层后，分别各取10 μL上相、10 μL下相用HPLC进行测定，上相的峰面积记为A1，下相的峰面积记为A2，则分配系数K=A1/A2.2.2.4 HSCCC分离制备选择V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)=3∶7∶1∶9作为溶剂体系进行分离.将选好的溶剂体系按比例配制，充分混匀后在分液漏斗中静置分层，待两相平衡后，将两相分别放入棕色试剂瓶中，超声脱气20 min后，将固定相(上相)首先泵入HSCCC的分离管中，待上相将整个分离管充满后，开启主机，设定转速为800 r/min，待转速稳定后，将流动相(下相)以1.8 mL/min的体积流量泵入分离管.等到两相平衡后，称取经AB-8大孔吸附树脂吸附分离获得的粗品161 mg，用等体积的上相与下相各5 mL超声溶解，从进样口加入.紫外检测器波长设定为280 nm，利用自动收集器收集流出液.2.3 单体化合物的鉴定及质量分数检测采用1H NMR与13C NMR鉴定得到的化合物.用HPLC检测，面积归一化法确定其质量分数.3 结果与讨论3.1 提取物的预纯化丹参提取液的乙酸乙酯萃取物，经过AB-8大孔吸附树脂吸附后，所含杂质减少，目标化合物得到有效初步分离，利于下一步HSCCCC的纯化(图1，2).图1 乙酸乙酯萃取部分高效液相色谱图Fig.1 Chromatogram of the extract of Salvia miltiorrhiza with ethyl acetate图2 大孔树脂洗脱部分高效液相色谱图Fig.2 Chromatogram of fraction by macroporous resin3.2 溶剂体系的选择HSCCC进行样品分离的理想溶剂系统分配系数应在0.5～2.0之间[11].若分配系数过小，则样品保留时间太短，不能够达到有效分离；若分配系数过大，则保留时间过长，致使峰形变宽，整个分离过程延长.本实验采用HPLC测定样品在两相中的分配系数.根据丹酚酸B在不同溶剂体系中的K值，见表1，选择V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)=3∶7∶1∶9作为本研究的溶剂体系.表1 丹酚酸B在不同溶剂体系中的分配系数Table 1 Distribution coefficient ofsalvianolic acid B in different solvent systems溶剂体积比比值KV(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)10∶1∶1038.27V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水)3∶6∶6∶100.28V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)3∶6.5∶1.5∶92.26V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)3∶6.5∶1∶90.22V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)3∶7∶1∶90.70V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(0.2%乙酸水)3∶7∶1∶90.013.3 HSCCC分离按照选定的溶剂体系进行HSCCC分离，工作站记录得到的色谱图见图3.按照色谱峰减压干燥得到化合物Ⅰ与Ⅱ.3.4 产物鉴定及质量分数测定用高效液相色谱仪检测其质量分数，面积归一法，测定化合物Ⅰ与Ⅱ的质量分数分别为98.4%和95.0%(图4).图3 HSCCC分离色谱图Fig.3 Chromatogram of separation by HSCCC图4 化合物的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of salvianolic acidB and rosmarinic acid化合物Ⅰ，(CD3OD，500 MHz，δ)ppm：6.85(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.17(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，7.53(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，6.22(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，6.78(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.76(1H，d，J=3.5 Hz，H-5′)，6.65～6.62(1H，m，H-6′)，5.87(1H，d，J=4.8 Hz，H-7′)，4.37(1H，d，J=4.8 Hz，H-8″)，6.75(1H，d，J=2.7 Hz，H-2″)，6.72(1H，d，J=8.0 Hz，H-5″)，6.67(1H，dd，J=2.1，8.2 Hz，H-6″)，2.84(1H，dd，J=9.6，14.3 Hz，H-7″a)，3.03(2H，dd，J=4.5，14.3 Hz，H-7″b，H-7‴a)，5.19(2H，dd，J=5.8，12.9 Hz，H-8″，H-8‴)，6.53(1H，d，J=1.9 Hz，H-2‴)，6.56(1H，d，J=8.0 Hz，H-5‴)，6.35～6.30(1H，m，H-6‴)，3.09(1H，dd，J=4.1，14.3 Hz，H-7‴b).13C NMR(CD3OD，125 MHz，δ)ppm：121.9(C-1)，124.8(C-2)，146.2(C-3)，149.2(C-4)，122.2(C-5)，122.4(C-6)，143.7(C-7)，118.5(C-8)，168.2(C-9)，129.4(C-1′)，117.7(C-2′)，145.4(C-3′)，145.2(C-4′)，117.5(C-5′)，126.5(C-6′)，37.6(C-7′)，74.9(C-8′)，172.4(C-9′)，133.8(C-1″)，118.5(C-2″)，118.5(C-3″)，146.2(C-4″)，146.1(C-5″)，113.5(C-6″)，88.4(C-7″)，58.1(C-8″)，172.4(C-9″)，129.1(C-1‴)，116.8(C-2‴)，146.9(C-3‴)，146.7(C-4‴)，116.6(C-5‴)，122.2(C-6‴)，38.0(C-7‴)，75.8(C-8‴)，172.4(C-9‴).上述波谱数据与文献报道基本一致[12]，可推测该化合物为丹酚酸B.化合物Ⅱ，1H NMR(CD3OD，500 MHz，δ)ppm：7.06(1H，d，J=1.7 Hz，H-2)，6.96(1H，dd，J=8.2，1.7 Hz，H-5)，6.81～6.76(2H，m，H-6，2′)，7.56(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，6.28(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，6.71(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.63(1H，br d，J=8.0 Hz，H-6′)，3.14～2.96(2H，m，H-7′)，5.18(1H，s，H-8′)；13C NMR(CD3OD，125 MHz，δ)ppm：127.9(C-1)，114.8(C-2)，146.3(C-3)，149.8(C-4)，115.4(C-5)，123.2(C-6)，147.7(C-7)，116.6(C-8)，168.7(C-9)，129.8(C-1′)，117.7(C-2′)，146.9(C-3′)，145.3(C-4′)，116.4(C-5′)，121.9(C-6′)，38.2(C-7)，75.7(C-8′),168.7(C-9′).上述波谱数据与文献报道基本一致[13]，可推测该化合物为迷迭香酸.4 结论本研究选用V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)∶V(水)=3∶7∶1∶9作为溶剂体系进行HSCCC分离制备丹参中的丹酚酸B与迷迭香酸，丹参药材经过萃取、大孔吸附树脂吸附，除去部分杂质，使得目标化合物得到初步分离，然后将161 mg粗品应用制备型HSCCC分离得到丹酚酸B 52.3 mg和迷迭香酸14.5 mg，质量分数分别达到98%与95%以上.结果表明：与直接利用丹参提取物进行HSCCC分离相比，本方法能够避免因提取物中存在杂质过多致使分离制备得到的样品质量分数不高的缺点，为丹参有效成分的进一步开发利用奠定了基础.参考文献：[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2010.[2] 高枫，孙桂波，任小宇，等.丹酚酸B对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国中药杂志，2012，37(3):358-361.[3] 石少明，李泽慧，田书林，等.丹酚酸B对脑缺血再灌注损伤大鼠纹状体氨基酸类神经递质的影响[J].北京中医药大学学报，2012，35(8):535-538.[4] 马丙祥，董宠凯.丹参的药理作用研究新进展[J].中国药房，2014，25(7):663-665.[5] 张玉杰，徐文清，沈秀.迷迭香酸的提取分离及药理学新发现[J].中国新药杂志，2013，22(4):433-437.[6] 李行诺，马旭，楚楚，等.泽泻指纹图谱研究[J].浙江工业大学学报，2013，41(2):143-146.[7] 颜继忠，雷伟，李行诺，等.桑叶中降血糖组分1-脱氧野尻霉素的富集与纯化研究[J].浙江工业大学学报，2013，41(3):241-243.[8] 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黄酮类化合物的提取、分离、纯化研究进展摘要：本文对黄酮类化合物的提取、分离、纯化研究进展进行综述。

本文介绍了黄酮类化合物的提取、分离、纯化的最新方法。

关键词：黄酮类化合物提取分离纯化黄酮类化合物又名生物类黄酮化合物，是色原酮或色原烷的衍生物，黄酮类化合物是自然界中以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，其化学结构中C3部分可以是脂链，或与C6部分形成六元或五元环，黄酮类化合物泛指这种两个苯环通过中央三碳链相互连接而成的一系列化合物。

一般黄酮类化合物可根据母核基本结构的不同进行分类，主要有黄酮醇、黄酮、黄烷酮、黄烷醇、花色素、异黄酮、二氢黄酮醇以及查尔酮等八类。

黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)结构的化合物。

它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。

黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在。

绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。

许多研究已表明黄酮类化合物具有显著的生理药理活性，除具有抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用外在抗氧化、抗癌、防癌、抑制等方面也有显著效果。

黄酮类化合物在治疗心脑血管等疾病效果显著[1]。

本文介绍黄酮类化合物的提取、分离、纯化的研究进展。

1、黄酮类化合物的提取方法1.1有机溶剂萃取法这是目前国内外使用最广泛的方法，很容易实现工业化生成。

其原理是利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同极性的溶剂萃取。

常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，一般采取乙醇为提取溶剂。

高浓度的醇(90%～95%)适用于提取黄酮甙元类化合物，而低浓度的醇(60%～70%)更适合提取黄酮甙类化合物[2]。

提取次数一般为2~4次，提取方法有热回流提取和冷浸提取两种方式。

高速逆流色谱分离纯化钩吻中钩吻素甲刘浩;沈洁;刘铭;许盈;俞昌喜【摘要】采用高速逆流色谱法,分别以正己烷-乙酸乙酯-无水乙醇-水(3∶3:2∶3 V/V)和氯仿-甲醇-0.2 mol/L盐酸(4∶ 3∶1.5 V/V)为溶剂体系,从300 mg钩吻总碱中分离纯化出一种钩吻生物碱单体30.78 mg,高效液相色谱技术分析其质量分数为97.76％,核磁共振谱、质谱分析确证其为钩吻素甲；通过小鼠醋酸扭体法检测,表明钩吻总碱和钩吻素甲对小鼠均具有显著的镇痛活性.高速逆流色谱技术可高效分离纯化具有镇痛活性的钩吻素甲.【期刊名称】《天然产物研究与开发》【年(卷),期】2013(025)004【总页数】6页(P479-483,488)【关键词】钩吻;钩吻素甲;高速逆流色谱;分离纯化;镇痛【作者】刘浩;沈洁;刘铭;许盈;俞昌喜【作者单位】福建医科大学药学院药理学系,福州350004;武警福建总队医院药剂科,福州350003;福建医科大学药学院药理学系,福州350004;福建医科大学药学院药理学系,福州350004;福建医科大学药学院药理学系,福州350004;福建医科大学药学院药理学系,福州350004【正文语种】中文【中图分类】R284.2中国钩吻为马钱科植物胡蔓藤的全草，盛产于浙江、福建、广东、广西、湖南、贵州、云南等地［1］，本地区资源丰富。

我国民间一直应用钩吻原植物治疗各类疼痛，尤其慢性神经性疼痛与癌性疼痛。

钩吻主要有效成分为吲哚类生物碱。

临床和基础研究表明，钩吻总生物碱具有显著的抗肿瘤、镇静镇痛、促进造血、抑制血小板聚集、免疫抑制等药理作用［2，3］，但是治疗量却与中毒量较接近，限制了临床应用。

因此，从钩吻总碱中分离得到高效低毒的生物碱单体成为新药研发的目标。

从20 世纪30 年代起，我国学者赵承嘏等先后完成了钩吻化学成分分析方面的研究［4-7］，钩吻素甲是钩吻生物碱中含量最高的两种单体之一，且毒性相对较低［8］，使其研发成为可能，但是传统采用的分离方法主要是碱性硅胶柱或氧化铝柱色谱［4-7］，分离周期长，溶剂消耗大，得率低。