高速逆流色谱法.ppt
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高速逆流色谱High Speed Countercurrent Chromatography(HSCCC)逆流色谱是利用溶质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同,应用色谱层析的方法,将不同溶质分离。
逆流色谱的发展从逆流分配、液滴逆流色谱直至现在的高速逆流色谱,经历了近60年的历程,技术和设备均已日益成熟,现越来越多地应用于中药及天然药物的研究开发。
高速逆流色谱特点:! 无不可逆吸附# 液—液层析系统,无样品与固定相之间的不可逆吸附! 高回收率# 流动相和固定相均为液体,样品可全部回收! 操作简便# 固定相为液体,体系更换、平衡方便、快捷。
高速逆流色谱原理:高速逆流色谱是利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力,使互不相溶的两相不断混合,同时保留其中的一相(固定相),利用恒流泵连续输入另一相(流动相),随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配,按分配系数的次序,被依次洗脱。
在流动相中分配比例大的先被洗脱,反之,在固定相中分配比例大的后被洗脱。
图1是螺旋柱中互不相溶的两相溶剂在行星运动时的流体动力学运动及分配示意图。
上图,在达到稳定的流体动力学平衡态后,柱中呈现两个截然不同的区域:在靠近离心轴心大约有四分之一的区域(混合区)呈现两相的激烈混合。
其余区域(静置区)两溶剂相分成两层:较重的溶剂相在外部,而较轻的溶剂相在内部,两相形成一个线状分界面。
下图,I到IV的展开柱,分别与上图中I到IV位置相对应,每一混合区以跟柱旋转速度相同的速度向柱头端移动(与海面波的运动相似)。
在螺旋柱中任何一部分,两相溶剂都在反复进行混合和静置的分配过程,这一过程频率极高,当柱以800rpm旋转时,频率超过13次/秒,流动相则不断地穿过固定相。
所以高速逆流色谱在一个较宽的流动相流速范围内,仍有相当高的分配效率。
图1 螺旋柱中两溶剂相流体动力学运动及分配高速逆流色谱应用:1. 旋转速度在逆流色谱中,留在柱中固定相的量是影响溶质峰分离度的一个重要因素,一般说来,高保留量会大大改进峰分离度。
高速逆流色谱技术目录介绍 (1)高速逆流色谱的原理 (1)1.系统描述 (2)1.1主机 (2)1.2恒流泵 (2)1.3紫外检测器 (3)1.4恒温循环器 (3)1.5色谱工作站 (3)2.主机描述 (3)2.1操作 (4)2.1.1传感器控制面板 (4)2.1.2电源开关 (4)2.1.3样品进样口及样品出样口 (4)2.1.4进口 (4)2.1.5出口 (4)2.2六通阀 (4)2.3进样步骤 (8)2.4控制面板 (9)2.4.1功能键介绍 (9)2.4.2控制面板的操作 (9)2.5TBE-300B高速逆流色谱的工作流程 (10)3.安装 (10)3.1检查包裹 (10)3.2安装环境 (10)3.3连接管 (10)3.4连接保温系统的管路 (11)3.5连接信号线 (12)4.操作 (12)4.1准备 (12)4.2操作程序 (12)4.3系统平衡 (13)4.3.1单泵平衡 (13)4.3.2双泵平衡 (14)4.4样品分离 (14)5.维护 (14)5.1清洗系统 (14)5.2警告 (15)6.系统特性及工作参数 (15)附录A (15)附录B (16)附录C (17)同田生物介绍逆流色谱(CCC)是一种无固体载体支持的液-液分配色谱技术。
与其他柱色谱相比,逆流色谱不会导致不可逆吸附,样品,变性,污染及等问题。
除此之外,它能够分离分子量从小变到大的化合物,甚至一些生物大分子。
高速逆流色谱(HSCCC)是逆流色谱中的最新的发展。
高速逆流色谱不仅减少的分离时间,而且也极大地提高了分离度和制备能力。
高速逆流色谱的应用:1、制备性地分离毫克到克规模的样品;2、从粗样品中分离目标化合物;3、分离放射性同位素。
高速逆流色谱在分离天然产物中的优势:1、更加方便和迅速;2、不需要对样品进行前处理;3、液-液分配容积系统的选择广泛;4、因为没有固体载体,所以无死吸附,无污染;5、高的重现性及重复性。
高速逆流色谱综述高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography,简称HSCCC),于1982年由美国国立卫生院Ito博士研制开发的一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术。
该技术由于不需要固体支撑体,物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现,因而避免了因不可逆吸附引起的样品损失、失活、变性等问题,具有传统的液-固色谱所不具备的独特优势,特别适合于天然生物活性成分的分离。
而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触,使得样品的制备量大大提高,是一种理想的制备分离手段,因此此项技术己被广泛应用于中药成分分离、保健食品、生物化学、生物工程、天然产物化学、有机合成、环境分析等领域[1]。
1 高速逆流色谱原理[1-2]图.1高速逆流色谱仪利用螺旋管的自转和公转同步同向行星式运动所产生的变化离心力场将固定相保留在螺旋管中,允许流动相快速流过螺旋管并与固定相进行连续高效的混合和分配,达到一种特殊的流体动力学平衡——单向流体动力学平衡,此时在螺旋柱中任何一部分,两相溶剂都反复进行着混合和静置的分配过程,这一过程频率极高,在800rpm转速下时,混合和分配的频率可以达到13次/s。
大大提高了两相溶剂的混合效率,可以极大地缩短分离时间,这就是高速逆流色谱分离效率高的原因。
如图.1。
2 高速逆流色谱(HSCCC)的特点及与制备型高效液相色谱(prep-HPLC)的比较[3-4]目前制备出高纯度的天然产物的方法中,制备型高效液相色谱是使用最为广泛的。
与其相比,高速逆流色谱具有以下一些突出的优点。
(1)HSCCC回收率高:由于HSCCC不需要固体支撑体,避免了样品在分离过程中的不可逆吸附、分解、变性等问题。
理论上,滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱方式予以完全回收;实验中只要调整好分离条件,一般都有很高的回收率。
粗样可以直接上样而不会对柱内固定相造成任何损害。
而prep-HPLC在样品吸附过程中会出现死吸附的现象,在制备高纯品的过程中,必然会以牺牲得率为代价,这是prep-HPLC不可避免的。