下载文档原格式
实训亲和色谱纯化胰蛋白酶［任务描述］亲和色谱主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，在pH7.0～8.0的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH2.0～3.0时，又能被解离下来。
因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和色谱直接获得活力大于10000BAEE单位/毫克蛋白胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多，纯化效率可达到10～20倍以上。
本次实训任务为纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂-鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集亲和色谱纯化胰蛋白酶工作中必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备鸡蛋清，新鲜猪胰脏。
（2）试剂与仪器试剂：丙酮、三氯乙酸、HCl、NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、氯代环氧丙烷、乙腈、甲酸、Tris、CaCl2、KCl、DEAE-纤维素、Sepharose-4B、乙酸二氧六环二甲基亚砜。
主要贮存溶液：①鸡卵粘蛋白色谱液（1L）。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液。
②DEAE-纤维素处理液。
0.5mol/L HCl 300mL和0.5mol/L NaOH、0.5mol/L NaCl 各300mL。
③卵粘蛋白洗脱液。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液含0.3mol/L NaCl，150mL。
④标准胰蛋白酶溶液。
结晶胰蛋白酶以0.001mol/L HCl 配制成1mg/mL 。
⑤亲和色谱柱平衡液。
含0.5mol/LKCl 、0.05mol/L CaCl 2的0.1mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液500mL （配1000mL ：12.1g Tris ，37.5g KCl ，5.6g CaCl 2）。
