超滤法研究羌活提取物中异欧前胡素与人血清白蛋白的结合作用_龙怀聪

羌活药材活性成分的提取工艺研究石海利;蒋舜媛;徐凯节;张艳侠;周毅;宋美凤;彭树林【摘要】To optimize the extracting procedure for Notopterygium incisum,orthogonal design was carried out. Taking the amount of solvent, times of extraction and extraction duration as the test factors and the amount of extract, nodakenin, iso-imperatorin and notopterol as the test indexs,the L9(3+) orthogonal design was used to optimize the extraction technolo-gy of N. incisum. The results showed that the best extraction technology was as follows :refluxing extraction with 6 times of 95% alcohol for 3 times (1 h each time).%选择提取次数、溶剂倍数、提取时间为考察因素,以提取浸膏量及三种主要活性物质(紫花前胡苷、异欧前胡素、羌活醇)含量为考察指标,探讨羌活药材活性成分的乙醇加热回流提取工艺.在首先考察单因素对提取效果影响的基础上采用正交试验法,优选出羌活药材活性成分的最佳提取工艺参数:加6倍量95％乙醇,加热回流提取3次,每次提取时间为1h.【期刊名称】《天然产物研究与开发》【年(卷),期】2012(024)005【总页数】5页(P687-690,701)【关键词】羌活;提取工艺;正交试验;活性成分【作者】石海利;蒋舜媛;徐凯节;张艳侠;周毅;宋美凤;彭树林【作者单位】中国科学院成都生物研究所;四川省中医药科学院中药材品质与创新中药四川省重点实验室,成都610041;中国科学院成都生物研究所;中国科学院成都生物研究所;四川省中医药科学院中药材品质与创新中药四川省重点实验室,成都610041;四川省中医药科学院中药材品质与创新中药四川省重点实验室,成都610041;中国科学院成都生物研究所【正文语种】中文【中图分类】R284.2;Q946.91羌活(Notopterygium incisumTing ex H.T.Chang)为我国特有的伞形科草本植物，其根茎及根为羌活药材的主要来源，具有解表散寒、祛风除湿、止痛的功效，主要用于治疗风寒感冒、头痛项强、风湿痹痛、肩背酸痛等症［1］。

实验研究㊀基金项目:福建省自然科学基金项目(Ｎｏ.２０１７Ｊ０１５３９)㊀作者简介:杨策ꎬ男ꎬ研究方向:中药学ꎬＥ－ｍａｉｌ:２３３５７１３６３４＠ｑｑ.ｃｏｍ㊀通信作者:王英豪ꎬ男ꎬ博士研究生ꎬ副教授ꎬ研究方向:中药药效物质基础及其作用机制研究ꎬＴｅｌ:０５９１－２２８６１１３５ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｗｙｈｔｃｍ＠１６３.ｃｏｍ羌活醇及异欧前胡素对脂多糖诱导大鼠成纤维样滑膜细胞增殖抑制的影响杨策ꎬ高汉云ꎬ杨素芳ꎬ王英豪(福建中医药大学药学院ꎬ福建福州３５０１０８)摘要:目的㊀探讨羌活醇及异欧前胡素对大鼠成纤维样滑膜细胞增殖抑制的影响ꎮ方法㊀复制经脂多糖(ＬＰＳ)诱导的大鼠成纤维样滑膜细胞(ＣＩＡ－ＦＬＳ)模型ꎬ分别给予不同浓度的羌活醇(２５㊁５０㊁１００㊁２００㊁４００μｇ ｍＬ－１)㊁异欧前胡素(２５㊁５０㊁１００㊁２００㊁４００μｇ ｍＬ－１)及阳性药泼尼松龙(４００μｇ ｍＬ－１)ꎬ另设空白对照组ꎬ观察给药前后成纤维样滑膜细胞形态差异ꎻ采用噻唑蓝(ＭＴＴ)法测定不同给药时间㊁不同给药浓度下成纤维样滑膜细胞的抑制率ꎬ计算半数抑制浓度(ＩＣ５０)ꎻ硝酸还原酶法测定羌活醇和异欧前胡素对大鼠成纤维化滑膜细胞中一氧化氮(ＮＯ)水平的影响ꎻ酶联免疫吸附实验(ＥＬＩＳＡ)法测定肿瘤坏死因子α(ＴＮＦ－α)表达的影响ꎮ结果㊀造模细胞较正常细胞增殖力强ꎬ细胞粗大ꎬ纤维样ꎬ呈层叠状生长ꎻ羌活醇组给药后细胞增殖力减弱ꎬ生长良好ꎻ异欧前胡素给药后细胞增殖力锐减ꎬ生长状况不佳ꎮ给药１２ｈꎬ羌活醇未测出半数抑制浓度值ꎬ异欧前胡素半数抑制浓度值为１６０μｇ ｍＬ－１ꎻ给药３６ｈꎬ羌活醇㊁异欧前胡素半数抑制浓度值分别为１９０㊁１２０μｇ ｍＬ－１ꎻ给药６０ｈꎬ分别为８０㊁４５μｇ ｍＬ－１ꎬ异欧前胡素的增殖抑制能力强于羌活醇(Ｐ<０.０１)ꎮ给药羌活醇与异欧前胡素对一氧化氮总体含量和细胞因子肿瘤坏死因子α含量均有显著性降低(Ｐ<０.０１)ꎬ且异欧前胡素的降低更显著ꎮ结论㊀羌活醇及异欧前胡素对大鼠成纤维样滑膜细胞均有增殖抑制作用(Ｐ<０.０５)ꎬ均使一氧化氮含量和细胞因子肿瘤坏死因子α的含量显著减少(Ｐ<０.０１)ꎬ二者都有很好的增殖抑制能力ꎬ且异欧前胡素的抑制效果优于羌活醇ꎮ关键词:羌活醇ꎻ异欧前胡素ꎻ大鼠成纤维样滑膜细胞ꎻ增殖抑制中图分类号:Ｒ２８５.５㊀文献标识码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０１９)１１－０６２１－００７ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０１９.１１.００１Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｌｃｏｈｏｌａｎｄｉｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｒａｔｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＹＡＮＧＣｅꎬＧＡＯＨａｎｙｕｎꎬＹＡＮＧＳｕｆａｎｇꎬＷＡＮＧＹｉｎｇｈａｏ(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙꎬＦｕｊｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＦｕｚｈｏｕ３５０１０８ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｎｏｔｏｐｔｅｒｏｌａｎｄｉｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｆｉｂｒｏ￣ｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓｉｎｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒａｔｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ｔｈｅｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ(ＬＰＳ)－ｉｎｄｕｃｅｄｒａｔｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏ￣ｃｙｔｅｓ(ＣＩＡ－ＦＬＳ)ｍｏｄｅｌｗａｓｒｅｐｌｉｃａｔｅｄꎬａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｎｏｔｏｐｔｅｒｏｌｇｒｏｕｐ(２５ꎬ５０ꎬ１００ꎬ２００ꎬ４００μｇ ｍＬ－１)ａｎｄＩｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎｇｒｏｕｐ(２５ꎬ５０ꎬ１００ꎬ２００ꎬ４００μｇ ｍＬ－１)ꎬｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｄｒｕｇｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ(４００μｇ ｍＬ－１)ꎬａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ.Ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄ.ＭＴＴａｓｓａｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｔｉｍｅｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓꎬａｎｄｔｈｅｈａｌｆ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ(ＩＣ５０)ｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ.Ｔｈｅｈａｌｆ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ(ＩＣ５０)ｗａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄａｎｄａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｃｏｍｐａｒｅｄ.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｅｃｙｌａｌｃｏｈｏｌａｎｄｉｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎｏｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ(ＮＯ)ｉｎｆｉｂｒｏ￣ｂｌａｓｔｉｃｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓｏｆｒａｔｓｂｙｎｉｔｒａｔｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｍｅｔｈｏｄ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ(ＴＮＦ)－αｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙＥＬＩＳＡ.Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ.ｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｗｏｗｅｒｅｅｘｐｌｏｒｅｄａｎｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｔｗｏｗａｓｃｏｍ￣ｐａｒｅｄ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｍｏｄｅｌｉｎｇｃｅｌｌｓａｒｅｍｏｒｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｔｈａｎｎｏｒｍａｌｃｅｌｌｓꎬａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｓａｒｅｃｏａｒｓｅꎬｆｉｂｒｏｕｓꎬａｎｄｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ.Ａｆｔｅｒｔｈｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｏｔｏｐｔｅｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｗｅａｋｅｎｅｄａｎｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｗａｓｇｏｏｄꎬａｆｔｅｒｔｈｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａ￣ｔｉｏｎｏｆｉｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎꎬｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓｓｈａｒｐｌｙｒｅｄｕｃｅｄａｎｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｗａｓｐｏｏｒ.Ａｆｔｅｒａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｆｏｒ１２ｈꎬＩＣ５０ｖａｌｕｅｏｆｎｏｔｏｐｔｅｒｏｌｗａｓｎｏｔｄｅｔｅｃｔｅｄꎬａｎｄＩＣ５０ｖａｌｕｅｏｆｉｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎｗａｓ１６０μｇ ｍＬ－１.Ａｆｔｅｒａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｆｏｒ３６ｈꎬｔｈｅＩＣ５０ｖａｌｕｅｓｏｆｎｏｔｏｐｔｅｒｏｌａｎｄｉｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎｗｅｒｅ１９０μｇ ｍＬ－１ａｎｄ１２０μｇ ｍＬ－１.Ａｆｔｅｒａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｆｏｒ６０ｈꎬｔｈｅＩＣ５０ｖａｌｕｅｓｏｆｎｏｔｏｐｔｅｒｏｌａｎｄｉｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎｗｅｒｅ８０μｇ ｍＬ－１ａｎｄ４５μｇ ｍＬ－１.Ｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆｉｓｏｉｍｐｅｒａ￣ｔｏｒｉｎｗａｓｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｔｏｐｔｅｒｏｌ(Ｐ<０.０１).ＴｈｅｔｏｔａｌｃｏｎｔｅｎｔｏｆＮＯａｎｄｔｈｅｃｙｔｏｋｉｎｅＴＮＦ－αｃｏｎｔｅｎｔｏｆａｌｃｏｈｏｌａｎｄｉｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ<０.０１)ꎬａｎｄｔｈｅｒｅｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎｗａｓｍｏｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀Ｂｏｔｈｎｏｔｏｐｔｅｒｏｌａｎｄｉｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｒａｔｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ(Ｐ<０.０５)ꎬｂｏｔｈｔｈｅｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒＮＯａｎｄｔｈｅｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅＴＮＦ－αｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄ(Ｐ<０.０１)ꎬｂｏｔｈｏｆｗｈｉｃｈｈａｄｇｏｏｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙꎬａｎｄｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｉｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎｉｓｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｌｉｖｅｎｏｔｏｐｔｅｒｏｌ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＮｏｔｏｐｔｅｒｏｌꎻＩｓｏｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎꎻＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓｏｆｒａｔꎻＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ㊀㊀类风湿性关节炎(ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓꎬＲＡ)是一种以关节组织慢性病变为特征的自身免疫性疾病ꎬ在其整个病程中滑膜异常增殖反应起到重要的影响作用ꎬ目前西医尚无特效治疗方法[１]ꎮＲＡ属中医 痹证 范畴ꎬ中医对痹证的治疗有几千年的丰富经验ꎬ如羌活临床上擅治上肢痹痛ꎬ现代研究亦证实了羌活水提物㊁醇提物㊁挥发油提取物于在体研究中具有药理活性[２－４]ꎬ其活性成分为羌活醇㊁异欧前胡素等ꎬ«中国药典»２０１５年版中规定羌活醇和异欧前胡素作为羌活质量控制指标ꎬ总量不少于０.４％[５]ꎬ但羌活醇和异欧前胡素的活性研究鲜见报道ꎮ而对体外活性研究多以细胞增殖情况及细胞分泌因子或介质展开ꎬ如王子成等[６]采用细胞增殖水平来考察药效的研究ꎻ张希峣等[７]通过测定细胞因子(肿瘤坏死因子αꎬＴＮＦ－α)分泌量来考察脂多糖诱导对细胞增殖抑制的影响ꎻ石廷雨等[８]以一氧化氮(ＮＯ)分泌量考察对人主动脉血管内皮细胞损伤ꎮ因此ꎬ本文就羌活醇及异欧前胡素这两种活性物质对大鼠成纤维样滑膜细胞的增殖抑制作用ꎬ对胞体内和上清液中的介质ＮＯ水平的测定ꎬ以及对ＴＮＦ－α的表达影响来探究其对大鼠成纤维样滑膜细胞的增殖抑制ꎮ现研究报道利用脂多糖(ＬＰＳ)激活免疫系统诱发滑膜异常增生进行临床药物疗效的确定[９]ꎬ故本研究是采用ＬＰＳ作为诱导因子刺激正常大鼠滑膜细胞(ＦＬＳ)ꎬ建立胶原诱导性大鼠成纤维样滑膜细胞(ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓｏｆｃｏｌｌｅｇｅｉｎｄｕｃｅｄａｒ￣ｔｈｒｉｔｉｓꎬＣＩＡ－ＦＬＳ)[１０]ꎬ探讨羌活醇及异欧前胡素对大鼠成纤维样滑膜细胞增殖的抑制作用ꎬ并通过噻唑蓝(ＭＴＴ)比色法测定模型细胞给药后的半数抑制率(ＩＣ５０)ꎬ硝酸还原酶法测定羌活醇和异欧前胡素对大鼠成纤维化滑膜细胞介质ＮＯ水平的影响ꎻ酶联免疫实验(ＥＬＩＳＡ)法测定羌活醇和异欧前胡素对大鼠成纤维化滑膜细胞分泌的ＴＮＦ－α表达的影响ꎬ为中药羌活及其活性成分的应用提供实验依据ꎮ１㊀材料１.１㊀细胞㊀大鼠滑膜细胞购于上海齐氏生物科技有限公司ꎬ取材于正常ＳＤ大鼠滑膜组织ꎬ培养条件为ＤＭＥＭ/Ｆ１２＋１０％胎牛血清＋１％双抗ꎮ１.２㊀仪器㊀十万分电子天平(ＭＳ１０５ＤＵꎬＭｅｔｔｌｅｒＴｏ￣ｌｅｄｏ公司)ꎻ倒置式系统显微镜(ＴＳ－１００Ｆꎬ日本Ｏｌｙｐｕｓ公司)ꎻＣｏｕｎｔｓａｒ自动细胞计数仪(ＩＣ１０００ꎬ上海睿钰生物科技有限公司)ꎻＥＸＬ－８００酶标仪(Ｎ１２６３９－０１ꎬ塞默飞世尔仪器有限公司)ꎻ恒温水浴锅(ＤＫ－４２０ꎬ上海精宏实验设备有限公司)ꎻ低速台式离心机(ＴＤＺ４Ａ－ＷＳꎬ湖南湘仪实验室仪器有限公司)ꎻ洁净工作台(ＳＷ－ＣＪ－１ＦＤꎬ苏州安泰空气技术有限公司)ꎻ超声波细胞粉碎仪(ＪＹ９２－２Ｄꎬ宁波新芝生物科技股份有限公司)ꎻ低温高速台式离心机(５４１８Ｒꎬ德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ生命科技公司)ꎮ１.３㊀药品与试剂㊀羌活醇(批号:７２８Ａ０２２ꎬＳｏｌａｒｂｉｏ公司)ꎻ异欧前胡素(批号:１２２９Ａ０２２ꎬＳｏｌａｒｂｉｏ公司)ꎻ醋酸泼尼松龙滴眼液(１％醋酸泼尼松龙ꎬ进口药品注册账号:Ｈ２０１３０１３１ꎬ５ｍＬ:５０ｍｇ)ꎻ脂多糖(ＬＰＳꎬ美国Ｓｉｇｍａ公司)ꎻ四甲基偶氮唑盐(ＭＴＴꎬ美国Ｓｉｇｍａ公司)ꎻ二甲基亚砜(批号:２０１４０９０４ꎬ美国Ｓｉｇｍａ公司)ꎻＤＭＥＭ/Ｆ１２基础培养液(批号:ＡＤ２１５７３２７３ꎬＨｙｃｌｏｎｅ公司)ꎻ０.２５％胰蛋白酶(批号:Ｊ１７００４９ꎬＨｙｃｌｏｎｅ公司)ꎻ磷酸盐缓冲液(批号:ＡＤ１８１０８２７９ꎬＨｙｃｌｏｎｅ公司)ꎻ一氧化氮(ＮＯ)测试试剂盒(批号:Ａ０１２ꎬ南京建成生物工程研究所)ꎻ大鼠ＴＮＦ－αＥＬＩＳＡ试剂盒(批号:ＫＥ２０００１ꎬ美国Ｐｒｏｔｅｉｎ￣ｔｅｃｈ公司)ꎮ２㊀方法２.１㊀药物配制㊀精密称取羌活醇及异欧前胡素各约５.０ｍｇꎬ加入二甲基亚砜(ＤＭＳＯ)１２.５μＬ(含量ɤ１ɢ总药液量)ꎬ震荡并超声处理使其融为黏稠状液体ꎬＤＭＥＭ/Ｆ１２完全培养液定容到１２.５ｍＬꎬ０.２２微孔滤膜过滤ꎬ即得羌活醇㊁异欧前胡素液ꎬ浓度均为４００μｇ ｍＬ－１ꎬ４ħ放置备用ꎮ醋酸泼尼松龙滴眼液含有１％醋酸泼尼松龙ꎬ用ＤＭＥＭ/Ｆ１２培养液稀释浓度至４００μｇ ｍＬ－１ꎬ０.２２微孔滤膜过滤ꎬ４ħ放置备用ꎮ２.２㊀大鼠滑膜细胞(ＦＬＳ)的培养㊀ＦＬＳ细胞培养于含１０％灭菌胎牛血清(ＦＢＳ)及１％双抗的ＤＭＥＭ/Ｆ１２培养基中ꎬ３７ħ㊁５％ＣＯ２的培养环境孵育ꎮ２~３ｄ传代一次ꎬ传代方式为一传二ꎮ待细胞生长达培养瓶底部８０％~９０％面积时ꎬ弃去培养液ꎬＰＢＳ清洗两次后加入０.２５％胰蛋白酶消化液１ｍＬꎬ细胞消化时间约为１ｍｉｎꎮ１５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎꎮ弃去上清液ꎬ按１ʒ２传代培养或１ｍＬ冻存液冻存备用ꎮＦＬＳ细胞经传至３~５代最佳ꎮ２.３㊀大鼠成纤维样滑膜细胞模型(ＣＩＡ－ＦＬＳ)的建立㊀将对数生长期的ＦＬＳ细胞常规消化离心后ꎬ调整细胞悬液浓度为５ˑ１０４个/ｍＬꎬ以细胞悬液２００μＬ/孔加入９６孔板中ꎬ实验组别设置:ＬＰＳ药物组(１００μＬ正常细胞培养基＋０.１㊁１㊁５㊁１０㊁５０μｇ ｍＬ－１ＬＰＳ溶液)㊁空白对照组(１００μＬ正常细胞培养基)ꎮ每组６个平行孔ꎮ加入不同浓度ＬＰＳꎬ于３７ħ㊁５％ＣＯ２培养箱内孵育２４ｈ后ꎬ加入１００μＬＭＴＴ溶液/孔培养基ꎬ随后将９６孔板置于培养箱内继续孵育４ｈꎬ酶标仪５７０ｎｍ处测各孔ＯＤ值ꎮ按下式计算细胞抑制率(ＩＲ)ꎬ以ＩＲɤ１０％为标准来确定ＬＰＳ的最佳浓度ꎮＩＲ＝(ＯＤ空白－ＯＤ模型)/ＯＤ空白ˑ１００％ꎮ２.４㊀给药及分组㊀将造模后的ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞调至５ˑ１０４个/ｍＬ的细胞浓度ꎬ以２００μＬ/孔加入９６孔板中ꎬ于３７ħ㊁５％ＣＯ２培养箱内孵育２４ｈ后给药ꎮ实验组别设置为:阴性组(ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞)㊁阳性对照组(ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞＋１％醋酸泼尼松龙制备液)㊁药物组(ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞＋羌活醇/异欧前胡素２５㊁５０㊁１００㊁２００㊁４００μｇ ｍＬ－１)ꎬ每组６个复孔ꎮ２.５㊀对不同浓度㊁不同干预时间下ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞增殖的影响㊀将ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞培养至传代ꎬ按 ２.４ 项下分组于９６孔板上以２００μＬ/孔进行铺板ꎬ同条件下铺３板ꎮ２４ｈ后观察细胞生长状况ꎬ细胞数８０％~９０％即可ꎮ吸弃培养液ꎬ３板ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞依次给药每孔均１００μＬ处理１２㊁３６㊁６０ｈꎮ避光条件下加入ＭＴＴ(０.５μｇ ｍＬ－１)１００μＬ/孔ꎮ于３７ħ㊁５％ＣＯ２培养箱内孵育４ｈ后ꎬ吸弃上清液后加入二甲基亚砜１００μＬ/孔ꎮ震荡１０ｍｉｎ后ꎬ５７０ｎｍ下检测ＯＤ值ꎬ结果以６个复孔均数表示ꎮ２.６㊀硝酸还原酶法测定胞内及细胞液中炎症介质ＮＯ水平㊀将ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞培养至传代ꎬ根据分组(阴性组ꎬ羌活醇组ꎬ异欧前胡素组)进行１传３传代ꎬ培养至８０％~９０％细胞数即可ꎮ羌活醇组和异欧前胡素组给药浓度１００μｇ ｍＬ－１ꎬ给药时间１２ｈꎬ空白组给予同时间的培养液处理ꎮ待１２ｈ后ꎬ则吸取培养瓶中上清液离心处理ꎬ离心条件２５００ｒｐｍꎬ１０ｍｉｎꎬ取离心后的上清液ꎬ备用ꎮ培养瓶中细胞磷酸盐缓冲液(ＰＢＳ)清洗干净ꎬ各加入０.５ｍＬＰＢＳ刮取细胞ꎬ吸取瓶中ＰＢＳ进行超声破碎细胞ꎬ２５００ｒｐｍꎬ１０ｍｉｎ离心处理ꎬ取离心后的上清液ꎬ备用ꎮ２.７㊀ＥＬＩＳＡ法测定ＣＩＡ－ＦＬＳ分泌炎症因子ＴＮＦ－α含量㊀将ＣＩＡ－ＦＬＳ按５ˑ１０４个/孔接种于９６孔板ꎬ培养２４ｈꎬ弃去上清液ꎬ依次加入培养液ꎬ５０μＬ ｍＬ－１羌活醇ꎬ５０μＬ ｍＬ－１异欧前胡素ꎬ均１００μＬ于模型组ꎬ羌活醇组ꎬ异欧前胡素组ꎬ每组３个复孔ꎬ并设置空白组加入等量的培养液处理ꎬ孵育１２ｈꎮ取细胞培养液离心处理ꎬ离心条件２５００ｒｐｍꎬ１０ｍｉｎꎮ吸取上清液ꎬ用ＥＬＩＳＡ试剂盒检测上清液中ＴＮＦ－α的含量ꎮ２.８㊀统计学处理㊀采用ＳＰＳＳ２０.０处理实验数据ꎬ结果以ｘʃｓ表示ꎬ组间比较若符合正态性且方差齐性ꎬ采用ＬＳＤ法ꎬ否则采用独立样本非参数检验ꎮＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ３　结果３.１㊀对细胞形态改变的影响㊀正常大鼠滑膜细胞见图１Ａꎬ多呈规则短梭状ꎬ中间宽ꎬ两头细ꎬ大小形态均一ꎬ梭端由细丝状连接胞间ꎻ造模后损伤大鼠滑膜细胞见图１Ｂꎬ多呈长梭状ꎬ形态明显大于正常大鼠滑膜细胞ꎬ胞体呈纤维样ꎬ有少量空泡ꎬ增殖能力增强ꎬ同时间段下细胞代谢物增多ꎬ且有集落性和层叠性生长特征ꎻ造模并给羌活醇ꎬ培养２４ｈ后的损伤大鼠滑膜细胞见图１Ｃꎬ细胞略皱缩呈长梭状ꎬ少数呈短梭状ꎬ仍有纤维样及空泡ꎬ核呈圆状或椭圆状ꎬ细胞量略微减少ꎬ观察通透性提高ꎬ即细胞层叠性减少ꎻ造模并给异欧前胡素ꎬ培养２４ｈ后损伤大鼠滑膜细胞见图１Ｄꎬ细胞明显皱缩呈长条状ꎬ仍有纤维样及空泡产生ꎬ细胞抑制率较羌活醇组更强ꎬ少见细胞层叠ꎻ造模并给阳性药ꎬ培养２４ｈ后损伤大鼠滑膜细胞见图１Ｅꎬ细胞量明显锐减ꎬ核显圆状或椭圆状且明显突出ꎬ胞间无层叠ꎮ㊀Ａ.正常组细胞ꎻＢ.模型组细胞ꎻＣ.造模后的羌活醇组细胞ꎻＤ.造模后的异欧前胡素组细胞ꎻＥ.阳性组细胞图１㊀给药前后大鼠成纤维化滑膜细胞的变化３.２㊀ＬＰＳ诱导大鼠滑膜细胞模型的剂量优选㊀由表１可知ꎬＬＰＳ对正常大鼠滑膜细胞的增殖抑制程度随浓度增加而升高ꎮ１０μｇ ｍＬ－１ＬＰＳ对正常大鼠滑膜细胞的增殖抑制率为９.７１％ꎬ接近于１０％ꎬ损伤的大鼠滑膜细胞呈现薄片并不规则宽大状形态ꎬ如图１Ｂ所示ꎮ即确定该浓度下造模成功ꎬ并可进行下一步实验研究ꎮ表１㊀ＬＰＳ对正常大鼠滑膜细胞增殖的影响(ｘʃｓꎬｎ＝６)组别浓度/μｇ ｍＬ－１ＯＤ值抑制率(％)阴性组００.３０９ʃ０.００２９０加药组０.１０.２９７ʃ０.００９１３.８８１０.２９４ʃ０.００７３４.８５％５０.２８７ʃ０.００８２７.１２％１００.２７９ʃ０.０１０４９.７１％∗５００.２５６ʃ０.００６９１７.１５％∗∗㊀注:与阴性组比较∗Ｐ<０.０５ꎬ∗∗Ｐ<０.０１３.３㊀羌活醇对ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞增殖的影响㊀如图２所示ꎬ同一时间下ꎬ随浓度增长羌活醇对ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞的增殖抑制能力呈正相关关系ꎬ且与阴性组比较ꎬ差异均有统计学意义(Ｐ<０.０１)ꎮ同一浓度下ꎬ随时间增长羌活醇对ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞的增殖抑制能力越强ꎬ１２㊁３６㊁６０ｈ组间两两比较均具有显著性差异(Ｐ<０.０１或Ｐ<０.０５)ꎬ同条件下的给药组均低于阳性药组的抑制力ꎮ实验给药１２ｈ未测出羌活醇ＩＣ５０值ꎬ给药３６ｈ时ＩＣ５０值１９０μｇ ｍＬ－１ꎬ给药６０ｈ时ＩＣ５０值８０μｇ ｍＬ－１ꎮ图２㊀不同浓度及不同时间给药羌活醇对ＣＩＡ－ＦＬＳ增殖能力的影响㊀注:与阴性组比较ꎬ∗Ｐ<０.０５ꎬ∗∗Ｐ<０.０１ꎻ组间两两比较ꎬ＃Ｐ<０.０５ꎬ＃＃Ｐ<０.０１３.４㊀异欧前胡素对ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞增殖的影响㊀如图３所示ꎬ同一时间下ꎬ随浓度增长异欧前胡素对ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞的增殖抑制能力呈正相关关系ꎬ且与阴性组比较ꎬ差异均具有统计学意义(Ｐ<０.０１)ꎮ同一浓度下ꎬ随时间增长异欧前胡素对ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞的增殖抑制能力越强ꎬ１２㊁３６㊁６０ｈ组间两两比较均具有显著性差异(Ｐ<０.０１或Ｐ<０.０５)ꎬ同条件下高浓度异欧前胡素抑制率高于阳性药组ꎮ实验给药１２ｈ时测得异欧前胡素ＩＣ５０值１６０μｇ ｍＬ－１ꎬ给药３６ｈ时ＩＣ５０值１２０μｇ ｍＬ－１ꎬ给药６０ｈ时ＩＣ５０值４５μｇ ｍＬ－１ꎮ３.５㊀ＣＩＡ－ＦＬＳ胞体及细胞液中ＮＯ含量㊀由表２可知ꎬＣＩＡ－ＦＬＳ细胞模型组在细胞液上清和细胞上清ＮＯ的含量均是最高ꎮ给药羌活醇或异欧前胡素后ꎬＮＯ的含量在胞液上清及胞内上清均有所下降ꎬ且都是异欧前胡素组下降水平更多ꎮ在细胞液上清ＮＯ含量统计中ꎬ与模型组相比ꎬ羌活醇下降少ꎬ无统计意义ꎬ异欧前胡素显著下降ꎬ具有统计学意义(Ｐ<０.０１)ꎻ在细胞上清ＮＯ含量统计中ꎬ与模型组相比ꎬ羌活醇和异欧前胡素均显著下降ꎬ具有统计学意义(Ｐ<０.０１)ꎮ图３㊀不同浓度及不同时间给药异欧前胡素对ＣＩＡ－ＦＬＳ增殖能力的影响㊀注:组内与阴性组比较ꎬ∗Ｐ<０.０５ꎬ∗∗Ｐ<０.０１ꎻ组间两两比较ꎬ＃Ｐ<０.０５ꎬ＃＃Ｐ<０.０１表２㊀给药羌活醇及异欧前胡素对促炎因子ＮＯ含量的影响(ｘʃｓꎬｎ＝６)组别ＮＯ含量细胞液中ＮＯ含量/μｍｏｌ Ｌ－１细胞内ＮＯ含量/μｍｏｌ ｇ－１模型组１６０.７２８ʃ６.４９８１５９.８７６ʃ１１.５３３羌活醇组１５８.２６７ʃ１.２１９１２６.２７６ʃ６.１８５∗∗异欧前胡素组１３９.４６８ʃ１.５２８∗∗１２５.４２５ʃ８.９８６∗∗㊀注:与模型组比较ꎬ∗Ｐ<０.０５ꎬ∗∗Ｐ<０.０１３.６㊀ＣＩＡ－ＦＬＳ分泌细胞因子ＴＮＦ－α的含量㊀由图２所知ꎬＣＩＡ－ＦＬＳ细胞模型组分泌的细胞因子ＴＮＦ－α水平最多ꎬ加药羌活醇和异欧前胡素后ꎬＴＮＦ－α水平均有显著性降低(Ｐ<０.０１)ꎬ且异欧前胡素组下降幅度远大于羌活醇组ꎮ３.７㊀羌活醇与异欧前胡素的增殖抑制力比较㊀羌活醇与异欧前胡素均对ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞有一定的增殖抑制能力ꎬ如图４所示ꎬ１２㊁３６㊁６０ｈ时间点下给药不同浓度的异欧前胡素对ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞的增殖抑制能力明显强于羌活醇(Ｐ<０.０１或Ｐ<０.０５)ꎮ同条件下ꎬ除在６０ｈ给药浓度１００㊁２００μｇ ｍＬ－１的二者差异无统计学意义外ꎬ其他比较结果统计学意义差异(Ｐ<０.０１或Ｐ<０.０５)ꎮ结果提示异欧前胡素对ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞的抑制能力明显强于羌活醇ꎮ表３㊀给药羌活醇及异欧前胡素对炎性细胞因子ＴＮＦ－α含量的影响(ｘʃｓꎬｎ＝３)组别ＴＮＦ－α/ｐｇ ｍＬ－１空白组０.７７９ʃ０.６５２∗∗模型组４９.２４１ʃ２１.１０７羌活醇组１８.３０１ʃ２.４２３∗∗异欧前胡素组６.６８３ʃ２.２１０∗∗㊀注:与模型组比较ꎬ∗Ｐ<０.０５ꎬ∗∗Ｐ<０.０１图４㊀羌活醇与异欧前胡素增殖抑制力比较㊀注:羌活醇组与异欧前胡素组比较ꎬ∗Ｐ<０.０５ꎬ∗∗Ｐ<０.０１４　讨论ＲＡ是一种慢性㊁自身免疫性疾病ꎬ滑膜异常增生并导致关节畸形和功能障碍ꎮ它被列为世界性疑难杂症ꎮ而临床上滑膜组织的过度增殖ꎬ必然导致关节性肿大ꎬ并伴随着疼痛影响到患者的正常生活ꎬ久而久之ꎬ出现畸形ꎬ更有甚者会瘫痪在床ꎮ然而ꎬ现对于ＲＡ型疾病并无特效药ꎮ近年来ꎬ多有学者表明滑膜成纤维细胞(ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ－ｌｉｋｅｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ)在整个病理变化中起到重要作用ꎮＦｉｒｅｓｔｅｉｎ等[１１]认为类风湿性关节炎中滑膜细胞具有转化细胞的特性ꎬ在关节病理中ꎬ过度生长的滑膜细胞功能改变起着至关重要的作用ꎮ还认为ＲＡ关节组织滑膜异常增生可能是因为滑膜细胞凋亡机制障碍所引起ꎮ在ＲＡ中ꎬＦＬＳ可通过可溶性因子和细胞表面相互作用ꎬ细胞因子或介质(ＴＮＦ－α㊁ＮＯ等)被激活ꎬ随而ꎬ大量分泌导致关节畸形[１２－１４]ꎮ本实验采用羌活中两大活性成分ꎬ即羌活醇和异欧前胡素ꎬ探讨对大鼠成纤维样滑膜细胞增殖的抑制作用ꎮ这两种成分在中国特有属种植物羌活中含量高ꎬ也是其主要的药效成分ꎬ被广泛应用ꎬ一直以来也被国内外学者所青睐ꎮ至今ꎬ国外研究注重羌活治疗疼痛机制ꎬ而国内研究多体现在含量测定㊁质量标准以及水提液或醇提液的药理作用上ꎬ如周毅等[１５]对羌活中的挥发油及异欧前胡素进行含量测定ꎬ陈智煌等[１６]提取羌活挥发油并致炎症小鼠模型观察抗炎㊁镇痛作用ꎮ本实验明确药效物质基础ꎬ旨在运用ＬＰＳ诱导的成纤维样大鼠滑膜细胞ꎬ探讨活性成分羌活醇和异欧前胡素对其的增殖抑制作用ꎬ研究发现１０μｇ ｍＬ－１ＬＰＳ对正常大鼠滑膜细胞的增殖抑制率为９.７１％时ꎬ倒置电子显微镜下观察细胞形态发生变化ꎬ呈现纤维样ꎬ具有空泡ꎬ个体明显粗大于正常滑膜细胞ꎬ并集落性和层叠性生长ꎬ即确定造模成功ꎮＭＴＴ法检测羌活醇及异欧前胡素对大鼠成纤维化滑膜细胞增殖抑制的影响ꎬ实验中设置宽范围的浓度梯度(２５㊁５０㊁１００㊁２００㊁４００μｇ ｍＬ－１)及时间长度(１２㊁３６㊁６０ｈ)ꎬ以ＩＣ５０值为指标点ꎬ探讨俩活性成分的增殖抑制力度ꎮ结果发现ꎬ１２ｈ时ꎬ低浓度２５μｇ ｍＬ－１的羌活醇有明显的差异性(Ｐ<０.０５)ꎬ异欧前胡素有极明显的差异性(Ｐ<０.０１)ꎮ且羌活醇和异欧前胡素可剂量依赖性和时间依赖性抑制ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞过度增殖反应ꎬ并干扰细胞异常凋亡状况ꎬ恢复细胞凋亡与细胞增殖的平衡机制ꎮ３６㊁６０ｈ时ꎬ羌活醇ＩＣ５０在１９０㊁８０μｇ ｍＬ－１ꎻ１２㊁３６㊁６０ｈ时ꎬ异欧前胡素１６０㊁１２０㊁４５μｇ ｍＬ－１ꎮ硝酸还原法测ＮＯ水平ꎬ结果发现ꎬ与模型组相比ꎬ加药羌活醇(２５μｇ ｍＬ－１)或异欧前胡素(２５μｇ ｍＬ－１)均能显著降低ＮＯ介质的总体含量ꎬ且异欧前胡素组的ＮＯ含量更低ꎮＥＬＩＳＡ测ＴＮＦ－α含量ꎬ结果发现ꎬ与模型组相比ꎬ加药羌活醇(２５μｇ ｍＬ－１)或异欧前胡素(２５μｇ ｍＬ－１)均能显著降低细胞因子ＴＮＦ－α含量ꎬ且异欧前胡素组的ＴＮＦ－α含量更低ꎮ由此也表明ꎬ异欧前胡素抵抗ＣＩＡ－ＦＬＳ细胞增殖的能力更强ꎮ本实验研究证实了羌活活性成分羌活醇和异欧前胡素对大鼠成纤维样滑膜细胞均有增殖的抑制作用ꎬ且异欧前胡素抑制力优于羌活醇ꎬ但这两种活性成分通过何种机制来实现其抑制滑膜细胞凋亡异常的作用ꎬ还有待于进一步加以阐释ꎮ参考文献:[１]㊀钟毓娟ꎬ李丽ꎬ李勇文ꎬ等.白花丹醌对ＣＩＡ大鼠滑膜细胞增殖及ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β和ＭＭＰ－３表达的影响[Ｊ].安徽医科大学学报ꎬ２０１８ꎬ５３(３):３４３－３４７.[２]陈虹宇ꎬ尹显梅ꎬ陈玲ꎬ等.不同商品规格等级羌活的镇痛抗炎作用对比研究[Ｊ].中药与临床ꎬ２０１６ꎬ７(２):１５－１７.[３]王蓉蓉.中药羌活镇痛药性研究进展[Ａ].中华中医药学会２０１３第六次临床中药学学术年会暨临床中药学学科建设经验交流会论文集[Ｃ].中华中医药学会ꎬ２０１３:４.[４]张明发ꎬ沈雅琴.羌活药理学研究[Ｊ].中国执业药师ꎬ２００８(５):２８－３０.[５]张亚军ꎬ谢放ꎬ张育ꎬ等.羌活化学成分的研究进展[Ｊ].湖南农业科学ꎬ２０１７(４):１２４－１２６.[６]王子成ꎬ程立ꎬ吕同德ꎬ等.炎症因子预处理的脂肪干细胞可明显抑制外周血单个核细胞增殖[Ｊ].北京大学学报(医学版)ꎬ２０１８ꎬ５０(４):５９０－５９４.[７]张希峣ꎬ高志峰ꎬ王晓宇ꎬ等.右美托咪定通过ｃ－Ｆｏｓ/ＮＬＲＰ３/ｃａｓｐａｓｅ－１级联抑制脂多糖诱发的小胶质细胞炎症反应[Ｊ].实用医学杂志ꎬ２０１９ꎬ３５(２):２０５－２０８. 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[６]ＬＩＵＪꎬＱＩＮＣＫꎬＬＶＷꎬｅｔａｌ.ＯＳＵ－０３０１２ꎬａｎｏｎ－Ｃｏｘｉｎ￣ｈｉｂｉｔｉｎｇｃｅｌｅｃｏｘｉｂｄｅｒｉｖａｔｉｖｅꎬｉｎｄｕｃｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈａｐ５３/Ｂａｘ/ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ/ｃａｓｐａｓｅ－９－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].Ａｎｔｉ￣ｃａｎｃｅｒＤｒｕｇｓꎬ２０１３ꎬ２４(７):６９０－６９８.[７]ＺＨＡＮＧＪꎬＷＡＮＧＭꎬＺＨＡＮＧＺꎬｅｔａｌ.ＣｅｌｅｃｏｘｉｂｄｅｒｉｖａｔｉｖｅＯＳＵ－０３０１２ｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｈｅ￣ｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌｓｂｙｉｎｄｕｃｉｎｇｃｅｌｌｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ[Ｊ].ＭｏｌＭｅｄＲｅｐꎬ２０１５ꎬ１１(４):３０２１－３０２６.[８]ＫＩＫＵＣＨＩＨꎬＫＵＲＩＢＡＹＡＳＨＩＦꎬＭＩＭＵＲＯＨꎬｅｔａｌ.ＬａｃｋｏｆＧＣＮ５ｒｅｍａｒｋａｂｌｙｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔｐｒｏ￣ｌｏｎｇｅｄｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＢｃｌ－２ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏ￣ｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎꎬ２０１４ꎬ６３(４):８７０－８７５. 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HPLC法测定羌黄祛痹颗粒中异欧前胡素的含量目的建立羌黄祛痹颗粒中异欧前胡素含量测定的方法。

方法采用超声处理，高效液相色谱法，C18柱，以乙腈-水（60∶40）为流动相，检测波长为315 nm。

结果异欧前胡素在1.19～9.51 μg/ml范围内，呈良好线性（r=0.99995），加样回收率平均为97.00%，重复性RSD%为0.70%。

结论采用超声处理HPLC法测定羌黄祛痹颗粒中异欧前胡素方法可行。

Abstract：Objective To establish a method for the determination of the content of different components in the granules of Qiang Huang Huang Jie Tong.Methods Ultrasonic treatment，HPLC，C18 column，acetonitrile water（60：40）as mobile phase，detection wavelength of 315 nm.Results Isoimperatorin in 1.19～9.51 μg/ml range in a good linear（r=0.99995），the average recovery rate was 97.00%，the repeatability RSD% is 0.70%.Conclusion By ultrasonic treatment HPLC method for the determination of the Yellow Qubi granule isoimperatorin method is feasible.Key words：Qianghuang Qushu Granule；Isoimperatorin；High performance liquid chromatography羌黄祛痹颗粒由片姜黄、羌活、当归、赤芍、海桐皮、白术、甘草等七味药材组成，具有祛风除湿，散寒化瘀，通络止痛的作用。

欧前胡素衍生物的合成与血管舒张活性研究黄立敏;李友佳;侯亚静;王程;魏迪;贺怀贞【期刊名称】《西北药学杂志》【年(卷),期】2018(033)001【摘要】目的合成欧前胡素衍生物,考察所得化合物的血管舒张活性.方法在保留欧前胡素(I M P)母核结构的基础上,设计合成4个欧前胡素衍生物;采用多通道微血管张力测定法,对所得化合物的活性进行考察;应用计算机辅助药物设计软件,对所得化合物与可能靶标蛋白的相互作用进行分析.结果所得欧前胡素衍生物在不同动脉血管上均有不同程度的舒张效应.结论通过优化Williamson醚化反应条件,合成4个欧前胡素衍生物,反应步骤简单,条件温和.其中化合物5的3种血管舒张效应最好.进一步分子对接研究表明,化合物5与可能作用受体有较好的亲和力,为欧前胡素衍生物的结构优化提供理论依据.%Objective Imperatorin derivatives were designed ,synthesized and screened for their vasodilatationactivity .Methods 4 im-peratorin derivatives were designed and synthesized based on the structure modification of imperatorin .Their vasodilatory activities were screened by multichannel microvascular strain determination method .The interactions between compounds and potential tar-get proteins were analyzed by computer aided drug design software .Results Imperatorin derivatives exhibited different degrees of vasodilatation activity in different blood vessels .Conclusion In this research ,the imperatorin derivatives were synthesized by opti-mizing the Williamson reaction with simple procedure and mild conditions .4compounds all exhibited certain vasodilatation activi-ty .Amongthem ,compound 5 possessed the best activity .Further molecular docking research also indicated that compound 5 had a better affinity with the potential target proteins .This study provided theoretical basis for optimizing the structure of imperatorin in the future research .【总页数】5页(P87-91)【作者】黄立敏;李友佳;侯亚静;王程;魏迪;贺怀贞【作者单位】西安交通大学药学院,西安 710061;西安交通大学第二附属医院,西安710004;西安交通大学药学院,西安 710061;西安交通大学药学院,西安 710061;西安交通大学药学院,西安 710061;西安交通大学药学院,西安 710061【正文语种】中文【中图分类】R914.2【相关文献】1.欧前胡素和异欧前胡素对小鼠肝CYP450的影响 [J], 王笃军;王硕;严峰;王国斌;许海玉;欧阳臻;魏渊2.HPLC法测定辛芳鼻炎胶囊中新橙皮苷、柚皮苷、欧前胡素和异欧前胡素的含量[J], 袁步娟;张红玉;邓晓文;赵连中;3.HPLC 法测定辛芳鼻炎胶囊中新橙皮苷、柚皮苷、欧前胡素和异欧前胡素的含量[J], 袁步娟;张红玉;邓晓文;赵连中4.欧前胡素与异欧前胡素同牛血清白蛋白相互作用研究∗ [J], 张宇洁;樊珊珊;张裕沛5.LC-MS/MS法同时测定欧前胡素与异欧前胡素血药浓度 [J], 柯璐琳; 冯先铨; 黄品芳; 刘亦伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

HPLC法测定羌活中紫花前胡苷的含量黄育生;袁贤琳;钟瑜;王汝俊【摘要】目的:建立HPLC法测定羌活中紫花前胡苷含量的方法.方法:HPLC条件:色谱柱为Agilent HC-C18柱(5μm,4.6×250mm),流动相为甲醇-水(32:68),流速为1.0ml·min-1,检测波长为335nm,柱温为35℃.结果紫花前胡苷范围为4.00μg·ml-1～100.00μg·ml-1,平均回收率为99.90％,RSD为1.50％.结论:该法操作简单,重现性好,结果准确,可作为羌活中紫花前胡苷的含量测定方法提供参考依据.【期刊名称】《中国民族民间医药》【年(卷),期】2013(022)010【总页数】2页(P14-15)【关键词】羌活;紫花前胡苷;HPLC【作者】黄育生;袁贤琳;钟瑜;王汝俊【作者单位】广州中医药大学脾胃研究所,广东广州510405;广东省广州花海药业股份有限公司,广东广州510370;广东省广州花海药业股份有限公司,广东广州510370;广州中医药大学脾胃研究所,广东广州510405【正文语种】中文【中图分类】R284.1羌活为伞形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang或宽叶羌活Notopterygium franchetii H.de Boiss.的干燥根茎和根。

本品具有解表散寒，祛风除湿，止痛的功效，常用于治疗风寒感冒，头痛项强，风湿痹痛，肩背酸痛［1］。

其主要成分有香豆素类成分（如紫花前胡苷、羌活醇及异欧前胡素等）、挥发油、阿魏酸等［2］。

有研究表明紫花前胡苷是羌活的有效成分，具有镇痛、抗炎作用［3］。

但是2010年版药典第一部只收载了羌活醇和异欧前胡素总量的含量测定方法，且目前对于HPLC法测定羌活中的紫花前胡苷含量的报道很少。

本文研究建立了HPLC法测定羌活中的紫花前胡苷含量，为羌活的质量控制及复方制剂中羌活的有效成分转移率提供新的参考依据。