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畜牧兽医学报 ２０１６，４７（７）：１３１６－１３２３Ａｃｔａ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ ｅｔ Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃａ Ｓｉｎｉｃａｄｏｉ：１０．１１８４３／ｊ．ｉｓｓｎ．０３６６－６９６４．２０１６．０７．００３ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术的应用性研究舒磊磊１，甲芝莲２，吴勇浒２，索 伦３＊，贾丽玲２＊（１．上海交通大学生命科学技术学院，上海２００２４０；２．上海交通大学系统生物医学研究院，上海２００２４０；３．上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海２０００１１）摘 要：旨在探索ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术的新应用，本研究通过在小鼠遗传操作（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）中使用该技术，创建了一种在活体组织内研究基因功能的方法。
通过胚胎电转、免疫组化和ＰＣＲ分析等手段，结果发现，针对ＤＣＸ基因进行编辑，再现了ＤＣＸ下调导致神经元迁移障碍的表型，说明该技术能够用于小鼠遗传操作中下调基因表达；其次，该技术还成功应用于Ｐｃｄｈα基因簇的编辑并研究了基因簇恒定区的功能；最后，通过基因型鉴定发现，胚胎电转中使用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９会导致目的基因的敲除、反转和重复事件的发生。
综上所述，在小鼠胚胎电转中使用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术，能够成功编辑目的基因，从而实现活体组织内研究基因的在体功能。
关键词：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；遗传操作；基因敲除；基因反转；基因重复中图分类号：Ｓ８１３．３ 文献标志码：Ａ 文章编号：０３６６－６９６４（２０１６）０７－１３１６－０８收稿日期：２０１６－０１－２１基金项目：国家自然科学基金（３１２００８２５）作者简介：舒磊磊（１９９０－），男，安徽六安人，硕士生，主要从事分子和遗传生物学方面的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｅｉｌｓｈｕ＠１６３．ｃｏｍ＊通信作者：索 伦，副研究员，硕士生导师，主要从事基因在体功能研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｏｙｕｎｆｅｉ＠１２６．ｃｏｍ；贾丽玲，实验师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｌｌｍａｏ＠１２６．ｃｏｍＴｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＳＨＵ Ｌｅｉ－ｌｅｉ １，ＪＩＡ Ｚｈｉ－ｌｉａｎ２，ＷＵ Ｙｏｎｇ－ｈｕ２，ＳＵＯ Ｌｕｎ３＊，ＪＩＡ Ｌｉ－ｌｉｎｇ２＊（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０，Ｃｈｉｎａ；３．ＳｈａｎｇｈａｉＮｉｎｔｈ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００１１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｎｅｗ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏｓｔｕｄｙ ｇｅｎｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ ｂｙ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａ－ｔｉｏｎ．Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｚｉｎｇ，ｗｅ ｆｉｒｓｔ ｖａｌｉｄａ－ｔｅｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＣＸａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕ－ｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｌｓｏ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｅｘｏｎｓ ｏｆ Ｐｃｄｈαｃｌｕｓｔｅｒ．Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｈａｔ ｌｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｈｅ－ｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔｓ ｂｙ ＤＣＸ，ｗｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｏｕｌｄ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｅｌｅｔｉｏｎ，ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｕｐｌｉ－ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｄｉｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ａｎ ｉｄｅａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ；ｄｅｌｅｔｉｏｎ；ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ；ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９是一种ＲＮＡ指导的ＤＮＡ内切酶，依靠ＲＮＡ－ＤＮＡ的互补识别并切割特异基因序列从而达到精确的基因组编辑和基因修饰的目的。
/science?_ob=ArticleURL&_udi=B8SV2-4R7VJ06-1N8&_user=10&_coverDate=10％2F22％2F2009＆_alid = 1428302819＆_rdoc = 18＆_fmt =高＆_orig =搜索= 48642＆＆_cdi _st = 13＆_docanchor =＆_ct = 173＆_acct = C000050221＆_version = 1＆_urlVersion = 0＆_userid = 10＆md5的= e6e7a6940f3e1d0da9f5ae2bb4a4e6cf个人主页：10.1016/B978-008055232-3.62317-7 |奥曲肽布赖恩属FurmanaaStrathclyde生物医学科学研究所，格拉斯哥，英国抽象奥曲肽是一种合成的，生长抑素8肽模拟...命名法名称的临床表醋酸奥曲肽相关名称来源：EMTREE奥曲肽，醋酸奥曲肽，善宁（贸易）;长效奥曲肽站（贸易）;复合201995; dextrophenylalanylcysteinylphenylalanyl右旋; dextrophenylalanylcysteinylphenylalanyl右旋tryptophyllysylthreonyl ñ [2羟基; longastatin; longastatina，醋酸奥曲肽，善宁，sandostatina;奥曲肽拉尔; sandstatin，磺胺嘧啶201995;短信201 995;短信201-995，短信201995;右旋phenylalanylcysteinylphenylalanyl右旋tryptophyllysylthreonyl ñ [2羟基1（羟甲基）丙基二硫化物cysteinamide 2,7];右旋phenylalanylcysteinylphenylalanyl右旋tryptophyllysylthreonylcysteinylthreoninol二硫;奥曲肽pamoate; oncolar; samilstin; sdz201995，短信995; sms201 995; sms201 - 995; sms201995; sms995化学名称的D -苯丙- L型半胱氨酸- L型苯丙三维- tryptophyl - L型赖氨酰- L型threonyl -的N - [（1R的，2R的）-2羟基- 1 -（羟甲基）丙基] - L型cysteinamide循环（27 ）二硫化物醋酸CAS号83150-76-9/science?_ob=ArticleURL&_udi=B7582-4B9D7MN-2&_user=10&_coverDate=02％2F29％2F2004＆_alid =一十四亿二千八百三十万二千八百十九＆_rdoc = 46＆_fmt =高＆_orig =搜索= 12914＆＆_cdi _st = 13＆_docanchor =＆_ct = 173＆_acct = C000050221＆_version = 1＆_urlVersion = 0＆_userid = 10＆md5的= ca8cc63ee679cdc593d005cf182224f3个人主页：10.1016/j.dld.2003.11.018 |生长抑素受体：从基础科学到临床的方法，甲状腺米长扎泰利和E.长德利阿布鲁乌贝蒂，内分泌科，生物医学科学和先进疗法，费拉拉大学部，经萨沃纳罗拉9，44100，费拉拉，意大利可在线2003年12月24日。
132细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Immunol)2021 , 37(2)•论著.文章编号：1007-8738(2021 )02七13248抑制Wnt/p-catenin信号和NOX4表达阻碍二氧化硅诱导肺上皮细胞损 伤的修复马佳li2,杨丹丹u2，杨佳丽“2,刘晓明K2!k，蔡倩r宁夏大学生命科学学院，2西部特色生物资源保护与利用教育部 重点实验室，宁夏银川750021; 3宁夏医科大学公共卫生学院环境因素与慢性病控制重点实验室，宁夏银川750004)[摘要]目的探究Wnt/p联蛋白（p-catenin)信号和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4 (N0X4)相互作用对二氧化 硅（Si02)诱导的肺脏上皮细胞增殖的影响。
方法采用二氧化硅气道滴灌C57BIV6小鼠制备小鼠矽肺模型，免疫组织化学染 色法检测矽肺模型小鼠肺组织N0X4的表达；二氧化硅刺激BEAS-2B人肺上皮细胞制备上皮细胞氧化损伤细胞模型，W m信号 活化的条件培养基（Wnt3a-CM)及W m信号抑制剂XAV939改变W n t信号活性，表达N0X4短发夹RNA(N0X4 shRNA)的腺病 毒感染人肺上皮细胞敲低细胞N0X4水平。
Western b lo t法检测肺组织和人肺上皮细胞Wnt3a、活化p联蛋白（ABC)、转录因子 4(TCF4)、N0X4和细胞周期蛋白D l(C ydin D1)的蛋白表达；CCK-8法检测不同剂量二氧化硅刺激人肺上皮细胞24 h和48 h 对细胞存活率及敲低N0X4的表达对细胞增殖的影响；CellROX®荧光探针负载法检测二氧化硅作用下人肺上皮细胞活性氧 (R0S)的水平。
结果成功制备小鼠矽肺模型和氧化损伤细胞模型。
二氧化硅刺激肺脏上皮细胞可显著激活Wnt/p-catenin信 号和诱导N0X4表达，使R0S大量释放，而R0S清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC)与二氧化硅共同作用可抑制R0S的释放，进 而抑制Wnt/p-catenin信号A B C蛋白表达；Wnt3a-C M诱导的W n t信号激活可上调N0X4的表达；反之，W n t信号抑制剂 XAV939则抑制N0X4的表达；而敲低NOX4表达后，可显著抑制Wnt/p-catenin信号A BC蛋白和c y c lin D l的表达，抑制细胞增 殖。
结肠肿瘤前细胞系的建立及应用曹海龙;许梦雀;鄢芳;王邦茂【摘要】结肠肿瘤前细胞即永生化结肠上皮细胞系（IMCE），来源于 Immorto 小鼠和腺瘤性结肠息肉病基因（Apc）min／＋小鼠杂交后子代小鼠的结肠上皮细胞，其表型正常，可发生恶性转化，已成为肠道肿瘤发生发展相关研究较为理想的细胞模型。
此文主要就该细胞系的建立及其在肠道肿瘤发生机制和筛选防治药物等领域中的应用进展作一综述。
【期刊名称】《国际消化病杂志》【年(卷),期】2016(036)001【总页数】4页(P31-33,53)【关键词】结直肠癌;结肠肿瘤前细胞;腺瘤性结肠息肉病基因【作者】曹海龙;许梦雀;鄢芳;王邦茂【作者单位】300052 天津医科大学总医院消化科;300052 天津医科大学总医院消化科;300052 天津医科大学总医院消化科;300052 天津医科大学总医院消化科【正文语种】中文·综述·近年来，结直肠癌(CRC)的发病率明显增加。
现有研究已发现与CRC发生密切相关的一些重要的基因突变，如腺瘤性结肠息肉病基因(Apc)、K-ras、p53以及错配修饰基因等[1]。
目前仍有必要探讨这些基因突变如何影响正常结肠上皮细胞的表型，含有基因突变的肿瘤前细胞如何发生恶性转化，以及阐明已知CRC中发生变化的分子之间协同作用等。
由于体外分化的人正常结肠上皮细胞的培养非常困难，目前国内外研究仍多以结肠癌细胞作为相关研究模型[2-3]，显然这些肿瘤细胞并不完全符合上述研究要求。
结肠肿瘤前细胞即永生化结肠上皮细胞系(IMCE)，来源于Immorto小鼠和Apcmin/+小鼠杂交后子代小鼠的结肠上皮细胞，其表型正常，可发生恶性转化，已成为肠道肿瘤发生发展相关研究较为理想的细胞模型[4]。
本文主要就该细胞系的建立及其应用进展作一综述。
Immorto小鼠及Apcmin/+小鼠的建立为结肠肿瘤前细胞系的建立提供了可能。
Immorto小鼠携带了一种温度敏感的猴病毒40(SV40)大T抗原基因(tsA58)的突变形式，使之可置于干扰素-γ(IFN-γ)诱导的H-2Kb启动子(H-2Kb-tsA58)控制下。
-实验研究-基于流式细胞术快速定量分析小鼠角膜组织中嗜中性粒细胞方法的建立薛芸霞刘俊李志杰暨南大学眼表疾病国际协同创新研究中心再生医学教育部重点实验室，广州510632通信作者：李志杰,Email:zhijielee@yyhov.dm【摘要】目的建立一种基于流式细胞术快速定量分析小鼠角膜组织中嗜中性粒细胞的技术和方法'方法选取6〜8周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠15只，使用高尔夫样刀机械性刮除小鼠角膜上皮细胞层,生成直径2mm的创面，在创伤后18h切除带有完整角膜缘的小鼠角膜,采用胶原酶I和DNA酶联合消化法获得单细胞悬液，采用FACSCato流式细胞分析仪画门技术分选角膜细胞中嗜中性粒细胞的数量0另取6只小鼠，应用随机数字表法分为创伤组和正常组，每组3只，使用抗CD45、Ly6G和CD11b荧光抗体进行角膜细胞染色，计数并比较未创伤和创伤角膜中嗜中性粒细胞的数量变化'结果建立流式细胞仪检测角膜组织中嗜中性粒细胞的分析流程0CD45+细胞占角膜组织所有细胞的比例为(20.93±1.72) %,在角膜CD45+细胞群中可分选出Ly6G m CD11b+双阳性嗜中性粒细胞群，Ly6G m和CD11b+细胞在CD45+细胞中所占比例分别为(75.50±3.25) %和(93.40±4,53) %,Ly6G+和CD11b+共阳性细胞占角膜组织CD45+细胞的比例为(67.33±2.80) %。
创伤后18h，角膜中角膜缘募集嗜中性粒细胞数量为(151.47±10,82) %,多于正常角膜的(15.36土1.02)%，差异有统计学意义(e21.689,R<0.01)o结论流式细胞检测方法可快速、准确地定量分析创伤角膜中嗜中性粒细胞群，为进一步评价不同原因造成角膜炎症反应中嗜中性粒细胞的数量变化提供了一种快速定量分析方法0【关键词】角膜；流式细胞术；嗜中性粒细胞基金项目：国家自然科学基金项目(81770962、81700808)；广东省自然科学基金项目(2018A030310605)；广东省医学科研基金项目(A2020318)DOI:10.3760/115989-20200429-00297Protocol for the rapid quantitative analysit of neuhophilt ic mouse cornea by flow cytometryXue Yunxia,Lit Jun, Li ZhijiiOcular Surface Diseass Research Center,Jinan Universpy School o Medine,Guangzhou510632,ChinaCorrespooding author：Li Zhijii, Emait：e0ijiele e@y ahoo,com[Abstract]Objective To provide a standard protocol for the rapid quantitative analysis of neutrophils ininfamed ccrnees with Oow cytomety.Methods The ccrneet epithelium layer of15C57BL/6micc(6-8weeksold)was mechaniccl l y scraped off using a golf-like knife to generate a2mm wound region.The mouse ccrneas withintact liebus were cut out at18hour after abrasion.After mechanical shredding,the single ccl l suspension wasobtained by ccnaaenase I and DNase dieestion.Then,the number of neutrophils in the ccrneet co H s was sorted under theFACSCantofeow cetometeeu)ingthegatetechnique.Anothee6miceweeetaken and eandomized intowoundedgeoup and noemaegeoup accoedingtoaeandom numbeetabeemethod,with3micein each g eoup.Co en ea ec e e stainingwas performed using nuoresccnt-ccnjugated anti-mouse CD45,Ly6G,and CD11b antibodies.The number ofneutophiesin theconeasofthetwogoupsweeenumeated and compaed.Theuseand caeoftheanimaescompeiedwith the Statement of the Association for Reseerch in Vision and Ophthalmolocy(ARVO).The study protoccl wasapproved by the Animal Ethicc Committee of Medical Colleee of Jinan University( No.JN-A-2002-01).Reselts Astandard proccdure for detecting neutrophils in the ccrnee by fow cctomety was established.The ratio of CD45+ccllsin th etota eco en ea etissu ec e e popu eation was(20.93±1.72) %.TheLe6G+and CD11b+doub eepositi een eut eophi epopulation was sorted in the wounded ccrneet cel l population.The ratios of Ly6G+and CD116+cclls in the CD45+ce e s weee( 75.50±3.25) %and( 93.40±4.53) %,eespectieeee,and th e eatio oSth eL e6G+and CD11b+doubee positieeneuteophiesin thetotaenumbeeo CD45+ce e s was(67.33±2.80) %.In addition,thenumbeeo neuteophiesrecruited to the cornea at18hourr after ccrneet abrasion was(151.47±10.82) %,which was higher than(15.36±1.02) %in the normal cornea( h21.689,P<0.01).Conclusions Flow cctomety can quickly and accurately quantitatieeeeanaeezetheneuteophiepopueation in thewounded coenea.Itpeoeidesaeapid quantitatieeanaeesismethodto further evaluate the changes of neumophns in corneal in—ammation caused by different reesont.[Key words]Cornea；Flow cytometra；NeutrophiisFund program:National Natural Science Foundation of China(81770962,81700808)；NaturaS Science Foundation of Guangdong Province of China(2018A030310605)；The Medicai Sciencc and Technology Research Fund of Guangdong Grant(A2020318)DOI:10.3760/115989-20200429-00297角膜约占整个视觉系统屈光力的1/3,其正常结构和透明状态的维持是正常视觉功能的重要保障+一3」。
IPS Daniel章节z细胞潜能性与应用z IPS发展历程z鉴定方法z小鼠IPS制备方法细胞分化潜能性ES 应用前景ES临床应用的潜在问题Graft-versus-host disease Immune rejection新的突破-诱导性多潜能干(iPS)细胞系IPS的发展历程z2006. 日本科学家Yamanaka 首次通过使用逆转录病毒转导Oct4, Sox2,c-myc 和Klf4到小鼠Fbx5+成纤维细胞，将其诱导成为IPS细胞。
IPS的发展历程z2007年六月，Yamanaka 和来自哈佛、MIT、加利福利亚、洛杉矶大学的其他两个小组将Nanog替代Fbx5后成功诱导出能够形成嵌合体小鼠的IPS。
IPS的发展历程2007James Tmoson OCT4SOX2 z年11月，James Tmoson使用慢病毒转导OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 到人成纤维细胞，成功诱导出IPS细胞；z同一个月，Yamanaka使用逆转录病毒转导Oct3/4, Sox2, Klf4,和c-Myc到人成纤维细胞，也成功诱导出IPS细胞IPS的发展历程Hochedlingerz Hochedlinger 研究小组使用腺病毒载体将相同的4个基因转导到小鼠的皮肤和肝脏细胞，成功诱导出IPS细胞。
z Yamanaka重复转染携带Oct3/4, Sox2, and Klf4的一个质粒和另外个表达Myc的质粒到小鼠胚胎成纤维个质粒和另外一个表达细胞，成功诱导出IPS细胞，没有整合现象。
IPS 的发展历程z2009, Sheng Ding 使用poly argine 重组蛋白成功诱导,g g p y g 出小鼠IPS 细胞z 直接使用FGF2和低氧也同样能够诱导出IPS 细胞接使用低氧样能够诱胞IPS相关基因的作用z Oct-3/4和Sox 家族的几个个成员(Sox1, Sox2, Sox3, and Sox15) 已经被认为是体细胞Sox2,Sox3,and Sox15)诱导成为IPS的关键转录调控因子。
Doxycycline诱导表达Msx2-GFP的鼠晶状体上皮Alpha-TN4细胞株的建立
张娇;于紫燕;赵江月 【摘 要】目的 利用基因开关调节系统(Tet-on),拟建立由doxycycline调控表达的Msx2诱导细胞株,经与SWISS-2DPAGE DATA比对,发现差异蛋白点.方法 向鼠晶状体上皮细胞(Alpha-TN4)中稳定转染质粒Msx2-GFP-M2和TAP-GFP-M2,转染后的细胞经过G418筛选,挑出doxycycline诱导Msx2-GFP表达且具有较低背景的诱导细胞株M8,将空载体细胞株T9作为阴性对照细胞株.并对2组细胞行二维凝胶电泳(2-DE)及基因表达微阵列进行分析.结果 从二维凝胶电泳图谱上获得蛋白质斑点.对照组T9检测到5 389个斑点,实验组M8检测到5 460个斑点.经与SWISS-2DPAGE DATA比对,发现差异蛋白点.经基因表达微阵列分析发现,与晶状体及白内障疾病相关的差异基因为Col3α1,并在RNA水平进行了验证.结论 Msx2基因过表达对Alpha-TN4蛋白质表达谱有影响,其中差异基因Col3α1与晶状体及白内障疾病相关.
【期刊名称】《中国医科大学学报》 【年(卷),期】2019(048)006 【总页数】4页(P499-501,506) 【关键词】Msx2;Col3α1;Tet-on系统;晶状体上皮细胞;诱导细胞株 【作 者】张娇;于紫燕;赵江月 【作者单位】中国医科大学附属第四医院眼科,中国医科大学眼科医院,辽宁省晶状体学重点实验室,沈阳110005;中国医科大学附属第四医院眼科,中国医科大学眼科医院,辽宁省晶状体学重点实验室,沈阳110005;中国医科大学附属第四医院眼科,中国医科大学眼科医院,辽宁省晶状体学重点实验室,沈阳110005
【正文语种】中 文 【中图分类】R776.4
肌节同源盒基因同系物2（msh homobox 2，Msx2）作为肌节同源框基因家族的一员，其编码的转录抑制蛋白可调控细胞的存活与凋亡［1］。它多表达在间充质细胞与上皮细胞的交界处以及细胞增殖的区域，在体内控制着细胞的增殖和分化，与心血管、骨骼、眼耳鼻等组织发育密切相关，Msx2的表达异常或突变会对机体产生不良影响［2-3］。 在眼发育学研究领域，国外有研究［4］结果显示，在Msx2转基因鼠中发现小眼球畸形及视网膜发育缺陷。先前的研究［5］中也发现Msx2表达异常，通过抑制FoxE3基因并上调Prox1的表达来调控晶状体的发育。同时，敲除Msx2基因可通过激活Casp3/Casp8凋亡信号通路，引起晶状体组织中凋亡增加［6］。晶状体细胞凋亡是导致白内障发生的机制之一，因此，把Msx2作为靶因子导入晶状体上皮细胞，抑制细胞增殖和分化，触发凋亡，可能成为基因治疗晶状体及白内障相关疾病的一个突破性进展。 本研究利用基因开关调节系统（Tet-on），拟建立由doxycycline调控表达的Msx2诱导细胞株，探索其差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），为进一步的临床研究奠定基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 细胞：实验组选取doxycycline诱导表达Msx2的Alpha-TN4细胞株M8；空载体细胞株T9作为对照。 1.2 细胞培养及诱导 细胞株M8空载体T9在含胎牛血清的细胞培养液（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）过夜培养。经doxycycline（1 μg/mL）处理后，24 h后共聚焦荧光显微镜观察，并收集细胞。 1.3 蛋白提取及浓度测定 培养的细胞用预冷的PBS洗3遍，加入适量（200 μL/60 mm皿）裂解液，细胞刮收取蛋白至EP管每次超声15 s，重复5次，放置30 min，4 ℃离心12 000 r/min，15 min，取上清。考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（北京吉美生物有限公司）测定样本液蛋白浓度。 1.4 二维凝胶电泳 配制CyDye DIGE工作液（400 pmol/μL），根据蛋白定量结果，标本及1份混合内标各取50 μg加入1 μL浓度为400 pmol/μL的CyDye DIGE染料，避光。漩涡震荡，彻底混合，12 000 g 4 ℃离心10 min，收集底部标记混合物，在黑暗中冰上反应30 min。加入1 μL 10 mmol/L赖氨酸终止标记反应。充分混合，在黑暗中置于冰上10 min。每份样品加入同体积的补充液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、2%DTT、2% IPG Buffer），用再水化液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、18 mmol/L DTT、2% CHAPS、0.5% IPG Buffer）将样品体积补至340 μL，将18 cm IPG胶条（pH 3～pH 10，NL）置于胶条槽内，上样后在IPGphor固相pH梯度等电聚焦仪上行等电聚焦。整个过程避光。灌制12%SDS-PAGE胶，脱氧并保证胶面平齐。将IPG胶条置放在两低荧光玻璃板间的凝胶面上，用0.5%低融点琼脂糖溶液包埋。恒温20 ℃，行SDS-PAGE电泳（15 mA/胶，30 min；30 mA/胶，4 h）。整个过程避光，最后行考马斯亮蓝染色。 1.5 扫描及图像分析 电泳所得凝胶用MilliQ冲洗后用Typhoon 9400荧光扫描仪在不同激发光下扫描成像，所使用波长如 下：Cy2-488/520，Cy3-532/580，Cy5-633/679。所 得的蛋白质组图谱用DeCyder 2-D凝胶图像分析软件进行检测、自动分析，光斑体积的差异作为实验组与对照组蛋白表达水平变化的衡量指标，采用Mann Whitney U-test进行统计学检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 建立由doxycycline诱导稳定表达Msx2的鼠晶状体上皮细胞株 经过扩增培养后，G418筛选出明显由doxycycline调控诱导表达Msx2-GFP的Alpha-TN4细胞株，为M8克隆。同时，以空载体细胞株T9作为阴性对照。细胞株M8在无doxycycline存在的条件下不表达Msx2-GFP，在加入doxycycline（1 μg/mL）10 h后，Msx2-GFP开始有微量表达，随着时间增加，Msx2-GFP的表达量随之增高。细胞株M8和T9在doxycycline（1 μg/mL）处理24 h后，以共聚焦显微镜检测可见细胞株M8有Msx2-GFP明显表达，见图1。 图1 Doxycycline处理24 h后诱导细胞株M8及T9 ×100Fig.1 Induction of M8 and T9 cell lines by a 24-h doxycycline treatment ×100A and B，M8 cell line；C and D，T9 cell line of the control group. 2.2 二维电泳分析M8及T9细胞株蛋白质 由诱导的细胞株M8和空载体T9阴性对照样品分别获得二维凝胶电泳图谱，每组样品重复3次。经图像分析分别在实验组M8检测到5 460个点，对照组T9检测到5 389个点。其中M8与T9之间差异点有31个，见图2。 图2 二维电泳分析晶状体上皮细胞蛋白质Fig.2 Two-dimensional gel electrophoresis of lens epithelial cell proteinsA，M8；B，T9. 2.3 RNA微阵列分析和array结果的分析 对M8及T9 2组细胞进行了基因表达微阵列分析。通过SAS统计软件筛选DEGs。结果显示，在Alpha-TN4细胞系中存在712个多于2倍的表达变化的DEGs，其中454个基因被上调，258个基因被下调。在下调的基因中，Col3α1基因下调明显，见图3。对2组细胞进行实时PCR分析，检测到M8组mRNA的相对表达量为7.91±0.35，T9组mRNA的相对表达量为4.08±0.26。Col3α1表达量明显下降，此结果与上述结论保持一致。 图3 M8及T9细胞株DEGsFig.3 Differentially expressed genes in M8 and T9 cells 3 讨论 Msx2是新近发现的参与调控细胞凋亡的关键蛋白。以往研究［7-8］多集中在Msx2对心血管、骨骼等组织发育的影响上，本研究利用基因开关调节系统（Tet-on），首次建立由doxycycline调控表达的Msx2诱导晶状体上皮细胞株。该系统利用改良的大肠杆菌E.coli的调节系统，靶基因的表达受四环素的衍生物doxycyclin精确调节，故具有低毒性、特异性、高敏感性，且不影响细胞内其他基因活性的特点［9］。在诱导细胞株中，Msx2受doxycycline的精确调节，使诱导细胞株建系成功。Msx2诱导细胞株的建立为研究Msx2功能提供了良好的细胞模型。 本研究采用比较蛋白质组学的理论和方法，对诱导细胞株M8和阴性对照细胞株T9蛋白质组进行分析和比较，检测差异明显的蛋白质。经过基因表达微阵列分析，分析出明显下调及上调的基因。并对其中在Msx2过表达细胞株M8中下调明显的Col3α1进行实时PCR分析验证，结果显示，过表达Msx2基因的晶状体上皮细胞与正常细胞相比，Col3α1的表达量明显下降，该结果与基因表达微阵列分析结果保持一致。 Col3α1作为一种Ⅲ型胶原，主要存在于细胞外基质中，尤其在人的血管内膜、肌肉等结缔组织中含量丰富［10］。在晶状体中，胶原纤维的异常增生会加速晶状体上皮细胞纤维化，加速细胞移行，从而导致晶状体浑浊。已知后发性白内障（posterior capsular opacification，PCO）的发生与晶状体囊膜的纤维化和基质的积聚和收缩有关［11］。其中晶状体囊膜由晶状体上皮细胞核纤维产生，富含Ⅳ型胶原蛋白，也含有Ⅰ型和Ⅲ型胶原及细胞外基质成分。研究发现正常情况下Ⅳ型胶原纤维均匀分布于晶状体囊全层，同时还存在Ⅰ型和Ⅲ型胶原，其中Ⅲ型胶原因具有特异性而使晶状体囊区别于眼球内其他基底膜组织［12-13］。而胶原纤维以及细胞外基质的异常沉积是PCO发生的重要病理机制［14］。本研究中Msx2过表达引起的Col3α1下调可能是晶状体上皮细胞发生凋亡的一个潜在机制，这一发现为PCO的基因治疗提供了新的研究思路。但Msx2与Col3α1之间是否存在直接联系，以及Col3α1如何影响Msx2，从而促发细胞凋亡，仍需进一步研究。 参考文献：
【相关文献】 ［1］张登勇，鲁正.MSX2基因与肿瘤关系的研究进展［J］.中华临床医师杂志（电子版），2013，7（17）：138-139.DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2013.17.063. ［2］SHAO JS，CHENG SL，PINGSTERHAUS JM，et al.Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals ［J］.J Clin Invest，2005，115（5）：1210-1220.DOI：10.1172/JCI24140. ［3］SATOKATA I，MA L，OHSHIMA H，et al.Msx2 deficiency in mice causes pleiotropic defects in bone growth and ectodermal organ formation ［J］.Nat Genet，2000，24（4）：391-395.DOI：10.1038/74231.
