下载文档原格式
第35讲克隆技术浙江［学考＋选考]考纲确认考点知识内容加试二、克隆技术5.植物的克隆b 6。
动物的克隆a考点一| 植物的克隆技术1．植物细胞的全能性和组织培养方法（1)植物组织培养的原理：植物细胞具有全能性，即植物体的每个生活细胞都具有发育成完整植株的潜能。
（2)植物组织培养程序：配制培养基：配制含有适当营养物质和植物生长调节剂↓的半固体培养基.↓切取外植体：从消毒的根、茎、叶上切取一些小组织块。
↓获得愈伤组织：将组织块置于半固体培养基中培养，切口处细胞在创伤的刺激下发生脱分化,在创口表面形成一种由相对未分化的薄壁细胞团组成的新组织。
↓再生新植株:以适当配比的营养物质和植物生长调节剂诱导愈伤组织,直到再生出新植株.将含有愈伤组织的试管放在摇床上，通过液体悬浮培养,可以分散成单细胞（胚性细胞：细胞质丰富、液泡小、核大),这种单细胞可发育成胚状体，再继续发育可以形成植株。
2．植物细胞的全能性体现(1）相对于动物细胞，植物细胞的全能性更容易（填“难”或“容易"）体现。
（2）不同种类的植物或同种植物的不同基因型个体的细胞全能性表达程度不同。
（3）在长期培养中，培养物的胚胎发生和器官形成能力下降的可能原因：染色体畸变、细胞核变异或非整倍体产生；细胞或组织中的激素平衡被打破;细胞对外源生长物质的敏感性发生改变等.3．细胞培养和器官培养器官发生和形态建成主要是通过平衡植物激素配比进行调控:适量的生长素和细胞分裂素配比,可诱导芽的分化;适量的吲哚乙酸及适当减除某些其他激素，可诱导生根。
4．原生质体培养和植物细胞工程（1）原生质体的培养①制备原生质体的原因：植物细胞壁的存在，使植物组织培养与克隆有一定难度。
②制备原生质体的方法：在0。
5~0。
6 mol/L的甘露醇溶液环境下，用纤维素酶和果胶酶混合液处理。
（2）植物细胞工程：1．植物组织培养关键过程总结名称过程形成体特点培养基光脱分由外植体脱分排列疏松、高生长素与细胞避光（1)取材：含形成层（分生组织)的部分易于诱导形成愈伤组织。
植物基因克隆的策略与方法基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。
基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。
通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。
我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。
1 功能克隆(functional Cloning)功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。
其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。
功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。
Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hain 等,1985)。
Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。
周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。
拟南芥基因克隆的策略与途径拟南芥〔Arabidopsis thaliana〕是一种模式植物，具有基因组小〔125 Mbp〕、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成〔The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000〕。
同时，拟南芥属十字花科〔Cruciferae〕，具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene)是遗传物质的最根本单位,也是所有生命活动的根底。
不管要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning,firstproposedby Alan Coulson of theUniversity of Cambridge in 1986,Geneisolatedby this methodis based onfunctional genesin the genomehas arelativelystableloci,in the use ofgenetic linkageanalysisor chromosomalabnormalities of separategroupswillqueueinto the chromosomeofaspecific location,By constructinghigh-densitymolecularlinkage map, to findmolecular markerstightly linked with the aimed gene, continued to narrow thecandidate regionand thenclonethe geneand to clarifyits functionandbiochemical mechanisms.图位克隆〔map-based clonig〕又称定位克隆〔positoinal cloning〕，1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。
