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鼠肝Kupffer细胞的分离、培养和鉴定陆伦根;曾民德;范建高;李继强;华静;范竹萍【期刊名称】《胃肠病学》【年(卷),期】1998(000)002【摘要】目的:Kupffer细胞是固定于肝脏的吞噬细胞,Kupffer细胞的分离、培养对肝脏疾病发生机制中的有关细胞和分子生物学的研究具有重要意义。
方法:用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流,Nycodenz密度梯度离心分离大鼠Ku-pffer细胞,再经贴壁培养,并应用免疫组织化学、吞噬功能试验、电镜等方法进行鉴定。
结果:本法能成功地获得高纯度的Kapffer细胞,Kapffer细胞得率为3～5×10~6/肝,贴壁后呈典型的星形及多角形,免疫组化染色示溶菌酶阳性、胞浆内见吞噬的印度墨汁及乳胶珠颗粒,电镜观察细胞表面有发达的伪足、微绒毛,胞浆内含大量溶酶体及吞噬的乳胶珠颗粒。
结论:本实验所用的Kupffer细胞分离培养方法简单易行、可靠、细胞纯度高,可用于进一步研究Ku-pffer细胞的生物学功能。
【总页数】3页(P90-92)【作者】陆伦根;曾民德;范建高;李继强;华静;范竹萍【作者单位】上海第二医科大学附属仁济医院;上海市第一人民医院;上海第二医科大学附属仁济医院;上海市消化疾病研究所;200001;上海市消化疾病研究所;200001;上海市消化疾病研究所;200001【正文语种】中文【中图分类】R329.2【相关文献】1.分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞 [J], 蔡伟祥;方建凤;庄伟;李玉梅;2.分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞 [J], 蔡伟祥;方建凤;庄伟;李玉梅3.裸鼠肝窦内皮细胞的分离、培养及鉴定 [J], 王红霞;邓永键;蒋强;唐娜;胡纯婷;张江宇;丁彦青4.大鼠肝Kupffer细胞分离培养及鉴定 [J], 施鑫;李保仝;黎介寿5.适于膜片钳技术的大鼠肝Kupffer细胞急性分离和鉴定 [J], 刘亮;张宗明;张驰;姜楠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠肝Kupffer细胞分离方法探讨【摘要】目的探讨分离BALB/c小鼠肝Kupffer细胞(KC)的方法。
方法采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离KC，并比较链霉蛋白酶、Ⅳ型胶原酶及联用链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶等3种不同酶消化分离方法所得KC得率及纯度。
结果 3种不同酶消化分离方法细胞得率分别为(6.32±0.5)×106 g-1，(3.66±0.4)×106g-1，(10.3±0.7)×106 g-1；细胞纯度分别为(93.2±1.7)％，(90.7±1.5)％，(94.5±1.9)％。
结论联合链霉蛋白酶和Ⅳ型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠KC的较好方法。
【关键词】肝；枯否细胞；离心法，梯密度；小鼠，近交BABLc ；细胞分离肝Kupffer细胞（Kupffer cell，KC）为定居在肝窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞总数的80％～90％。
肝KC能吞噬、杀灭病原微生物，清除体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等免疫调节作用，同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮细胞的生物学功能[1]。
近期发现KC能诱导同种异体T淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥重要作用[2]。
如何获得较多数量和较高纯度的KC是研究其在机体中作用机制的首要条件。
而传统的分离方法往往因数量和纯度不足而影响实验结果。
本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续密度梯度、选择性贴壁三步法分离KC，探讨分离小鼠肝KC的较好方法。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物 BABL/c小鼠，雄性，10～12周龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中心提供（许可证号：046）。
试验前禁食12 h，自由饮水，随机分为3组。
1.1.2 主要试剂和仪器Ⅳ型胶原蛋白酶、DNAaseⅠ、Percoll及HEPES （美国Sigma公司）；兔抗人溶菌酶（lysozyme，美国DAKO公司）；链霉蛋白酶E（瑞士Roche公司）；RPMI��1640培养基（美国Gibco公司）。
一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法我折腾了好久原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，总算找到点门道。
一开始的时候，我真是瞎摸索，完全是在黑暗中前行。
我先说说取材这步吧。
从小鼠或者大鼠身上取软骨，这可真不是个容易事儿。
我一开始的时候啊，手法特别不熟练。
你想啊，找到准确的软骨部位就像在一堆电线里找到那根特殊颜色的线一样难。
有一次我不小心把周围的组织也切了不少，结果肯定是不理想的。
后来我就看了很多解剖的图，还专门找会的人请教了几次。
这才慢慢熟悉起来。
就是要很小心地沿着关节切，尽量只取到软骨组织。
取得软骨组织后就是消化了。
我试过好几种酶，像胰蛋白酶还有胶原酶什么的。
胰蛋白酶消化的时候，我发现时间特别难控制。
有一回消化时间长了一点，细胞都损伤了不少。
后来我就慢慢试，就像做饭试调料一样，一点一点找感觉。
胶原酶相对来说要温和一些，但也要注意浓度。
合适的浓度就像是刚好能开锁的钥匙，太浓或者太淡都不行。
分离完细胞下一步就是培养了。
培养条件真的是需要精心调整。
我在培养瓶的选择上也纠结了挺久。
普通的培养瓶感觉细胞的贴壁不是很理想。
后来换了那种专门对细胞贴壁有帮助的培养瓶，情况才好一些。
还有培养液，它得包含细胞生长需要的所有营养成分啊，像氨基酸、糖、维生素这些，那都是细胞的食物呢。
我一开始没把温度和二氧化碳浓度太当回事儿，结果细胞长得歪歪扭扭的。
后来严格把温度和二氧化碳浓度控制在合适的范围，细胞才比较茁壮地生长。
还有细胞每过一段时间就得看看它们的状态，就像看自己养的小宠物一样。
如果发现有污染了，那前面的努力可就白费了。
有一回就因为一点小小的疏忽，培养物被污染了，整个心血都付诸东流了，那个时候可沮丧了。
后来就很注意无菌操作，一切步骤都特别小心。
这培养原代软骨细胞啊，真的是个细致活儿，要不断尝试总结经验，每一个小的失误都可能导致失败。
我现在也不敢说就完全掌握了这方法，但好歹能有点成果出来。
我还想不断改进呢，也欢迎你有啥心得也跟我交流交流。
小鼠肝外胆管上皮细胞的分离、原代培养及鉴定方法一、引言。
小伙伴们，今天咱们来聊聊小鼠肝外胆管上皮细胞这个超有趣的话题呢。
研究这个细胞对于了解肝脏相关的生理机能还有疾病啥的可重要啦。
这就像是探索一个小世界里的小秘密一样。
那要研究它呀，就得先把细胞从老鼠身体里分离出来，然后进行原代培养，最后还得鉴定一下是不是咱们想要的那种细胞。
这一套流程可有点复杂，但超级酷哦。
二、小鼠肝外胆管上皮细胞的分离。
1. 准备工作。
咱得先准备好小老鼠啦。
这小老鼠的选择也有讲究呢，要健康的，这样它的细胞才健康嘛。
然后就是各种工具，像超精细的手术器械，这就像是给细胞做手术的手术刀一样。
还有那些特殊的试剂，比如说能让细胞保持活性的试剂，这就像给细胞喝的营养水。
2. 解剖获取胆管组织。
把小老鼠麻醉后，就小心翼翼地开始解剖。
这时候可得像个超级细心的工匠一样，沿着肝脏找到肝外胆管。
这个胆管小小的，但是在显微镜下看可神奇了。
要把胆管完整地取出来，可不能伤到周围的组织，不然就可能影响到细胞的质量啦。
3. 细胞的释放。
取出来的胆管组织，还要用一些特殊的酶来处理，让胆管上皮细胞从组织里释放出来。
这就像把小种子从果实里剥出来一样。
这些酶的浓度和处理时间都要把握好，浓度高了或者时间长了，细胞可能就被破坏了，那就前功尽弃啦。
三、小鼠肝外胆管上皮细胞的原代培养。
1. 培养环境的准备。
得给细胞准备一个舒适的小窝，也就是培养皿啦。
培养皿里要铺上合适的基质，就像给细胞铺床一样。
这个基质要能让细胞很好地附着生长。
然后还要调好培养箱的温度、湿度和二氧化碳浓度，这就像给细胞创造一个合适的小气候。
温度不能高也不能低，湿度也要刚刚好，二氧化碳浓度也是关键因素呢。
2. 细胞接种。
把分离出来的细胞小心翼翼地接种到培养皿里。
这就像把小种子种到土里一样。
接种的密度也很重要，如果太密了，细胞之间就会互相抢营养，长不好；要是太稀了，又浪费资源。
3. 培养过程中的观察和维护。
在细胞培养的过程中，要像照顾小宝宝一样，经常去观察它们。
Primary human/mouse lung fibroblast isolation人类/小鼠原代肺成纤维细胞分离方法参考文献(H: 1.Katharina Heinzelmann et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018; 2. Claudia A Staab-Weijnitz et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015. FK506-Binding Protein 10, a Potential Novel Drug Target for Idiopathic Pulmonary Fibrosis; M: Isolation and characterization of mouse fibroblasts, Benjamin L. Edelman and Elizabeth F. Redente)Materials:材料：1. Digestion solution: a).Liberase TM (5401119001, Merck) solution,2.5mg/ml (HBSS);b).DNAse (D4263-5VL, Sigma), 2000U/ml(PBS)消化液：a) Liberase TM 溶液（5401119001, Merck）：溶于HBSS（终浓度2.5mg/ml）b) DNAse溶液（D4263-5VL, Sigma）：溶于PBS（终浓度2000U/ml）2. Nylon filters 40/70 µm3. Complete medium (Mouse: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B + 1% Glu; Human: DMEM/F12 + 20% FBS + 1%Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B)4. Knife (disposable)5. Syringe6. PBSDigestion solution:Steps: (Mouse from 1-13, Human from 7-13)步骤：1. Weight the mouse, calculate the amount of anesthesia, Xylazin : Kelamin : NaCl =1:4:5, 100ul/10g weight;称重小鼠后麻醉2. Inject and wait 10min till the mouse sleep腹腔注射后等待10分钟3. Open abdomen and cut the artery of the kidney打开腹腔切断肾动脉4. Use syringe insert the heart and rinse with 15ml PBS until it’s white注射器灌注15ml PBS后插入心脏冲洗至肺部变白5. Take out the lung and heart in the tube with ice将心脏和肺取出置于冰盒中保存6. Wash with 80% ethanol in 10s在80%酒精中漂洗10秒7. Wash with PBS 3 times, 10min (Mouse); PBS 3 times, 30min (Human)PBS洗3次，每次10分钟（老鼠），每次30分钟（人），清洗时保存于冰盒中8. Dissected into pieces of 1cm2 in size and digested by digestion solution at 37°C for 1hours (shake vigorously every 15min)使用一次性无菌刀片将组织切成小块，并加入消化液在37度水浴锅中静置1小时（每15分钟猛烈上下摇晃试管）9. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 70 µm使用70微米过滤器过滤标本10. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium400 g, 4°C, 离心5分钟，离心后加入完全培养基重悬11. Samples were filtered through nylon filters with a pore size of 40 µm使用40微米过滤器过滤标本12. Centrifuged at 400 g, 4°C for 5 minutes, resuspended in complete medium400 g, 4°C, 离心5分钟，离心后加入完全培养基重悬13. Medium was changed after 2 days (first check) and cells were split after reaching aconfluence of 80–90%. For the present study, phLF were used in passages 4-9.2天后检查细胞状态并换液，当密度达到80–90%时可传代，原代成纤维细胞最佳使用为4-9代。
大鼠Kupffer细胞分离、培养及永生化实现毛德文;裴燕燕;王明刚【摘要】枯否细胞(Kupffer Cells,KC)是肝脏免疫防御的第一道防线,其与多种肝脏疾病密切关联.Kupffer细胞分离纯化技术要求较高,且该细胞分化增殖能力极弱,成为开展大规模细胞实验的主要障碍.课题组简化了Kupffer细胞分离纯化步骤,构PDS152_pLenti-GFP-IRES-SV40LT表达载体,包装形成慢病毒颗粒侵染Kupffer 细胞,侵染后细胞生长速度变快,能多次传代,细胞状态稳定,巨噬细胞特异性标志F4/80呈阳性表达.将SV40LT片段导入Kupffer细胞可实现细胞永生化,且转染后的kupffer细胞仍维持巨噬细胞的功能特性.【期刊名称】《大众科技》【年(卷),期】2017(019)012【总页数】3页(P35-37)【关键词】Kupffer细胞;SV40-LT片段;永生化;特性【作者】毛德文;裴燕燕;王明刚【作者单位】广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023;广西中医药大学第一附属医院,广西南宁 530023【正文语种】中文【中图分类】Q2;R57枯否细胞（Kupffer cells，KC）是定植在肝脏的巨噬细胞，是肝脏非实质细胞的重要组成部分。
Kupffer细胞在肝脏固有免疫系统中发挥关键作者，是肝脏免疫防御的第一道防线。
Kupffer细胞与慢性肝炎、肝硬化及肝癌等多种肝脏疾病密切关联。
有效、快速分离Kupffer细胞，针对性开展功能与机制研究是探明不同致病因素对 Kupffer细胞影响及其与疾病相关性的基石。
但Kupffer细胞分离纯化技术要求较高，且关键在于Kupffer细胞分化增殖能力极弱，成为开展大规模细胞实验的主要障碍，课题组在实验中分离纯化了Kupffer细胞，且构建了一种永生化的细胞模型。
相关报道如下。
Wistar大鼠，SPF级，雄性，200～250g购于广西医科大学动物实验中心提供（SCXX桂2003-0001）。
一种改良大鼠肝脏Kupffer细胞分离方法张哲;赵曙光;倪阵;刘震雄;唐华;李慧艳;闻勤生【摘要】目的观察改良大鼠肝脏Kupffer细胞 (KCs) 分离方法获取KCs的效果.方法参照Akira提供的方法进行以下改进:① 前灌注液在体灌注,Ⅳ型胶原酶离体灌注消化;② Percoll分离液不连续密度梯度离心;③台盼蓝染色检测分离细胞的活度;④选择性贴壁法纯化获取的细胞;⑤ 吞墨实验、DAB染色及CD163细胞免疫荧光法鉴定所分选细胞.结果肝脏KCs的获得量为(3±1.5)×105/g鼠肝,细胞活度＞92%;光镜下细胞呈圆形,培养24 h后呈梭形或多角形;具有较强的吞噬能力,DAB染色呈"煎蛋"样,荧光显微镜下＞99%为KCs.结论改良的大鼠肝脏KCs分离方法较Akira法能够获取更高纯度的KCs,简捷经济,值得推广.%Objective To observe the isolation effect of kupffer cells (KCs) by an improved isolation method of KCs from a single rat liver. Methods The isolation method was based on Akira' s method with some improvements as followed : ① After primarily perfused in vivo, the liver was perfused with collagens type Ⅳ and digested in vitro; ② Discontinuous density gradient centrifugation in Percoll was used; ③ The viability of isolated cells were determined by trypan blue staining; ④ The purification of isolated cells by selective cell adherence; ⑤ Phagocytosis test , DAB dyeing and CD163 immunofluorescence staining were used to identified isolated KCs. Results The number of acquired cells was (3 ±1.5) x 105 per gram rat liver, and the viability of cells was more than 92%. The morphology of cells was roundness, and became spindle or polygonal after 24 h cultured. The cell had strong phagotrophic ability, and appeared "fried eggs" by DAB dyeing.More than 99% cells were identified as KCs by immunofluorescence staining. ConclusionrnThe improved isolation method of KCs is more productive of high purity of KCs, it is simple and economic.【期刊名称】《胃肠病学和肝病学杂志》【年(卷),期】2012(021)011【总页数】5页(P1060-1064)【关键词】Kupffer细胞;细胞分离;原代培养;细胞鉴定【作者】张哲;赵曙光;倪阵;刘震雄;唐华;李慧艳;闻勤生【作者单位】第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038;第四军医大学唐都医院消化内科,陕西,西安710038【正文语种】中文【中图分类】R575.5肝脏细胞包括实质细胞和非实质细胞，非实质细胞约占肝脏细胞总数的10%，其中肝脏巨噬细胞(kupffer cells，KCs)的比例约为33%。
小鼠原代细胞分离提取实验技术介绍
原代细胞（Primary cells）是指来源活体组织，经特定分离方法制备而成的初始细胞。
原代细胞离体时间短且不经过永生化过程，其生物学特性未发生很大变化，仍保持原有的遗传特征，可更好地反映细胞在体内的生长状态，从而获得与体内生理功能更接近的数据。
基因敲除小鼠原代细胞提取的应用
从某个特定基因敲除（Knock out，KO）小鼠的特定组织中提取原代细胞，则可直接得到目的基因不表达的原代细胞模型，且与我们在KO小鼠上的研究具有更好的承接性，从而让我们想要证实的实验目的更具有说服性。
近年来，多个发表在高分期刊如Scientific Reports的文章均有采用KO小鼠的原代细胞进行实验验证的案例。
另外，KO小鼠的原代细胞还可用于细胞水平的药物筛选、药物评价等方面。
1、小鼠肝脏Kupffer 细胞分离、纯化
参照Tetsuya Abe等的方法并加以改进。
腹腔注射2%戊巴比妥钠
（40mg/kg），沿腹部正中做一约2cm 的切口，完全暴露门静脉，经门静脉置
入18G 套管针，置入位置约距离肝门1cm，插入约0.8cm，4-0 丝线固定后，
立即剪开下腔静脉，用无钙灌注液进行灌注，灌注速度约为10ml/min,同时剪
开上腔静脉，灌注过程见图 1.1、图1.2。
灌注5min，共灌注无钙灌注液50ml/
只，灌注后肝脏体积膨大、颜色变浅，解剖剪分离取下肝脏，去除结缔组织及胆囊，在75%的酒精里漂洗5s，然后用PBS 漂洗三次，以防污染。
放到盛
有PBS 的50ml 无菌瓶中，每批细胞需要灌注3-5 只小鼠。
待所有小鼠肝脏
灌注好之后，一起放到细胞培养皿中，用眼科剪剪碎，加入0.1% 四型胶原
酶，每只约需5ml，放至37℃CO
2
培养箱，消化一小时，摇匀一次/15 min，
并用移液枪轻轻吹打1min。
待组织块消化完全，细胞基本散落形成细胞悬液
后，过350 目滤网2 次，以去除未消化的组织块和结缔组织。
用15ml 离心管收集细胞悬液，300 rpm×3 min，离心两次，收集上清，
可以去除大部分的小鼠肝脏细胞。
然后，1500 rpm×5 min，弃上清，收集沉
淀，用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 培养基悬浮细胞沉淀。
Percoll不连续密度梯度离心，2000g×20min，4℃；各层为上：细胞悬液2ml，中：25%Percoll 3ml，下：50%Percoll 3ml（用15ml 离心管，2-3 管/只）。
先将50%
的Percoll液3ml 置于离心管底部，再沿着离心管管壁缓慢加入25%Percoll3ml
在50%Percoll 液上面，最后沿着管壁缓慢加入细胞悬液2ml 于最上层，见图
1.3 。
离心后可见四层区带：最上一层为细胞碎片；第二层为富含肝窦内皮
细胞的区带；第三层为富含Kupffer 细胞的区带；第四层为积于管底的沉淀，
主要是红细胞，见图1.4 。
将25%与50%Percoll 之间富含Kupffer 细胞的第
三层小心吸出，收集后PBS 漂洗两次以去除Percoll 液。
将盛有漂洗过的细胞
沉淀的离心管插入到冰屑中，冰上作用40 min，以免影响细胞活力。
Trypan
blue 染色检查，细胞活率达85%-90%。
行细胞计数并调整细胞浓度为1×10
6
个/ml ，接种到24 孔板（每孔1ml 培养液）。
10% RPMI 1640 混悬细胞后，
铺板贴壁，30 min，37℃。
PBS 洗两次去除非贴壁细胞后，所得细胞即为小
鼠肝脏Kupffer 细胞，放至37℃CO
2
细胞培养箱继续培养。
