益肾填精法对摘除卵巢大鼠E2、FSH水平的影响

益肾续经汤延缓绝经过渡期大鼠卵巢功能衰老的实验研究的开题报告一、研究背景和意义随着女性寿命的延长和生活水平的提高，绝经期女性的数量正在逐年增加。

绝经过渡期是指从月经周期变化开始到停经期的过渡阶段，这个阶段持续时间不定，一般为3~5年，但也可以长达10年以上。

随着体内卵巢功能的逐渐衰退，导致大量激素水平的异常变化，如雌激素、孕激素的分泌减少，调节卵巢周期的促性腺激素FSH和LH水平升高等，这些不正常的生物化学变化导致机体出现一系列的生理和心理症状，如烘烤潮热、躁狂、失眠、情绪波动、阴道干燥等，从而对患者的生活质量和健康产生不良影响。

中药具有疗效确定、毒副作用小、疗效持久的特点，其中益肾续经汤是经过临床验证，具有滋阴润燥、调节内分泌的功效，适用于治疗绝经期妇女的相关症状。

因此，通过动物实验，进一步研究益肾续经汤对绝经过渡期大鼠卵巢功能衰老的影响，为其临床应用提供科学依据，具有重要的应用价值。

二、研究内容及目标本实验拟采用大鼠作为研究对象，分别采用益肾续经汤和生理盐水进行灌胃治疗，观察和记录治疗前后的大鼠体重、血清激素水平、卵巢组织病理变化等指标差异，评估益肾续经汤的疗效及作用机制。

具体实验目标包括：1. 探究益肾续经汤对绝经过渡期大鼠卵巢功能衰老的影响；2. 观察益肾续经汤对大鼠体重、血清激素水平等指标的影响；3. 分析益肾续经汤的作用机制，为其临床应用提供科学依据。

三、研究方法1.实验动物选择雌性SD大鼠，体重200±20g，购自动物实验中心，饲养在温度22℃，湿度60%，24h灯光周期的环境下，并提供足够的食物和水。

2.实验设计我们将大鼠随机分为两组，每组10只。

其中实验组灌胃益肾续经汤，对照组灌胃生理盐水。

每周进行2次干预，连续6周。

3.主要测定指标（1）体重：每周测量一次大鼠体重，记录其变化情况。

（2）血清激素水平：采用ELISA法测定血清促性腺激素（FSH）、卵泡刺激素（LH）、雌二醇（E2）、孕激素（P）的水平。

益肾填精法对摘除卵巢大鼠E2、FSH水平的影响
魏俊英;傅金英;孙红
【期刊名称】《中医研究》
【年(卷),期】2010(23)9
【摘要】目的:观察益肾填精中药对摘除卵巢的大鼠雌激素(E2)及促卵泡激素(FSH)水平的影响.方法:选择雌性成年未孕SD大鼠, 3～4月龄,随机分为正常对照组、模型对照组、中药组.摘除模型对照组和中药组大鼠双侧卵巢,术后分组给予不同的药物,连续灌胃至术后2月处死动物,检测血清E2及FSH水平的变化.结果:模型对照组和正常对照组相比,E2水平下降,FSH水平升高,差别有统计学意义(P＜0.05, P＜0.01).中药组和正常对照组相比E2水平下降,差别有统计学意义(P＜0.01),和模型对照组比较E2水平升高,FSH水平降低,但差别无统计学意义(P＞0.05).结论:益肾填精中药有提高摘除卵巢大鼠体内E2水平,降低FSH水平的作用.
【总页数】2页(P20-21)
【作者】魏俊英;傅金英;孙红
【作者单位】河南省直属机关第二医院,河南,郑州,450003;河南省中医院,河南,郑州,450002
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
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研究补肾填精法调理卵巢早衰的效果如何？卵巢早衰以肾精亏耗为基本病机。

阿胶黄精丸是补肾填精的代表方，阿胶黄精丸中的主要成份：阿胶，制黄精，羊胎素，白芷提取物，木瓜提取物，荷叶提取物，百合提取物，枸杞提取物,茯苓,蚕蛹,益智仁，胶原蛋白。

全方具有补气、补血、补肾、养血、养肝、养肾、养心，并有化瘀祛斑，调理气血等作用。

研究表明，阿胶黄精丸可提高POF小鼠外周血始基卵泡生长因子——生长分化因子一9水平，对其卵泡凋亡吲、卵巢超微结构嘲均有一定的改善作用。

本研究以补肾填精法的代表方阿胶黄精丸为基础方调理11例POF患者及2l例DOR患者，观察其临床疗效。

研究对象，2011年11月至2014年3月在广州中医药大学第一附属医院妇科门诊就诊、符合POF诊断标准的患者11例，年龄23—39岁，平均30．04岁，同时选取21例DOR患者作为对照组，年龄22—39岁，平均30．67岁。

两组患者的发病年龄比较无统计学差异(P>0．05)。

调理方法，阿胶黄精丸基础方：阿胶黄精丸中的主要成份：阿胶，制黄精，羊胎素，白芷提取物，木瓜提取物，荷叶提取物，百合提取物，枸杞提取物,茯苓,蚕蛹,益智仁，胶原蛋白。

全方具有补气、补血、补肾、养血、养肝、养肾、养心，并有化瘀祛斑，调理气血等作用。

服用方法，一日三次，每次30粒，或40粒，饭后温服，经期停用，连服6个月。

分别于调理前、后月经来潮的第2-3天空腹抽血查性激素五项，如调理期问均无月经来潮，则调理结束后第2天空腹抽血查性激素五项。

结合调理前后患者的月经情况及主要症状行Kupperman评分，判定其疗效。

研究结果，痊愈：调理后月经周期、经期、经量均恢复正常，月经积分改善≥95％；显效：调理后月经来潮2次以上，月经周期接近正常(40天以内)、经期恢复至2—7天、经量基本正常，70％≤月经积分改善<95％；有效：调理后月经来潮1次，月经周期、经期、经量较调理前有所改善，30％≤月经积分改善<70％；无效：调理期间及调理后月经均未来潮，月经周期、经期及经量均无改善，月经积分改善<30％。

论㊀㊀著(基础研究)补肾助孕方对大鼠垂体细胞促性腺激素的调节刘㊀贝ꎬ周惠芳ꎬ周伯如ꎬ蒋小飞ꎬ徐建亚ꎬ谢㊀彤ꎬ单进军㊀㊀[摘要]㊀目的㊀目前黄体功能不全的机制尚不明确ꎬ文中观察补肾助孕方含药血清对大鼠垂体细胞促性腺激素(ＦＳＨ)和促黄体生成激素(ＬＨ)分泌功能的影响ꎬ探讨补肾助孕方干预垂体分泌促性腺激素的作用机制ꎮ㊀方法㊀用补肾助孕方水煎剂给雌性ＳＤ大鼠灌胃ꎬ制备补肾助孕方含药血清ꎮ采用ＣＣＫ￣８法检测注射用醋酸西曲瑞克㊁含药血清和垂体促性腺激素释放激素(ＧｎＲＨ)对细胞活性的影响ꎮ在最大无毒浓度的条件下ꎬ采用注射用醋酸西曲瑞克阻滞垂体细胞ＧｎＲＨ受体ꎬ用ＲＰＣ细胞建立受体拮抗模型(模型组)ꎬ另建立空白组(正常细胞)㊁西曲瑞克组(仅单纯注射醋酸西曲瑞克作用６ｈ)㊁补肾助孕方组(仅加含补肾助孕药血清作用２４ｈ)ꎮ使用２０ｎｍｏｌ/ＬＧｎＲＨ刺激细胞６ｈꎬ检测各组细胞上清液中ＦＳＨ和ＬＨ含量ꎬ以及ＦＳＨβ与ＬＨβ㊁ＧｎＲＨＲ的ｍＲＮＡ表达ꎮ㊀结果㊀与空白组比较ꎬ西曲瑞克组细胞上清ＦＳＨ降低[(３.９１ʃ０.３６)ｍＩＵ/ｍＬｖｓ(２.２６ʃ０.２２)ｍＩＵ/ｍＬꎬＰ<０.０５]㊁ＬＨ降低[(８.９４ʃ０.５７)ｍＩＵ/ｍＬｖｓ(３.３５ʃ０.５９)ｍＩＵ/ｍＬꎬＰ<０.０５]ꎬ补肾助孕方组细胞上清ＬＨ显著升高[(８.９４ʃ０.５７)ｍＩＵ/ｍＬｖｓ(１０.７９ʃ０.６０)ｍＩＵ/ｍＬꎬＰ<０.０５]ꎻ与西曲瑞克组相比ꎬ补肾助孕方组与模型组细胞上清ＦＳＨ㊁ＬＨ水平均明显升高(Ｐ<０.０５)ꎮ与空白组比较ꎬ西曲瑞克组ＦＳＨｍＲＮＡ显著降低[(０.９５ʃ０.２３)ｖｓ(０.５８ʃ０.１２)ꎬＰ<０.０１]㊁ＬＨｍＲＮＡ显著降低[(０.９８ʃ０.１４)ｖｓ(０.２７ʃ０.２１)ꎬＰ<０.０１]ꎬＧｎＲＨＲｍＲＮＡ表达升高[(０.９７ʃ０.１３)ｖｓ(１.７７ʃ０.２６)ꎬＰ<０.０１]ꎻ补肾助孕方组ＦＳＨｍＲＮＡ㊁ＬＨｍＲＮＡ升高(Ｐ<０.０５)ꎮ与西曲瑞克组比较ꎬ补肾助孕方组㊁模型组ＦＳＨβｍＲＮＡ㊁ＬＨβｍＲＮＡ表达均升高(Ｐ<０.０５)ꎬ而ＧｎＲＨＲｍＲＮＡ表达降低(Ｐ<０.０１)ꎮ㊀结论㊀补肾助孕方能显著提高大鼠垂体细胞ＧｎＲＨ受体拮抗模型的ＦＳＨ㊁ＬＨ分泌水平ꎬ降低异常升高的ＧｎＲＨ受体的ｍＲＮＡ及蛋白水平ꎮ补肾助孕方可改善ＧｎＲＨ受体表达功能ꎮ㊀㊀[关键词]㊀垂体细胞ꎻ含药血清ꎻ注射用醋酸西曲瑞克ꎻ下丘脑￣垂体￣卵巢生殖轴㊀㊀[中图分类号]㊀Ｒ７１１㊀㊀㊀[文献标志码]㊀Ａ㊀㊀㊀[文章编号]㊀１００８￣８１９９(２０１８)０７￣０７０３￣０６㊀㊀[ＤＯＩ]㊀１０.１６５７１/ｊ.ｃｎｋｉ.１００８￣８１９９.２０１８.０７.００７基金项目:国家自然基金(８１４７３７１３)ꎻ中国和欧洲的医疗保健业发展合作研究计划(ＦＰ７/２００７￣２０１３/ＰＩＲＳＥＳ￣ＧＡ￣２０１３￣６１２５８９)ꎻ江苏省自然基金(ＢＫ２０１４１４６３)作者单位:２１００２３南京ꎬ南京中医药大学第一临床医学院[刘㊀贝(医学博士研究生)㊁周惠芳㊁周伯如㊁蒋小飞]ꎻ２１００２３南京ꎬ南京中医药大学中医儿科研究所(徐建亚㊁谢㊀彤㊁单进军)通信作者:周惠芳ꎬＥ－ｍａｉｌ:３２８２０６４２０６＠ｑｑ.ｃｏｍＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＢｕＳｈｅｎＺｈｕＹｕｎＤｅｃｏｔｉｏｎｏｎｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎｉｎｒａｔｐｉｔｕｉｔａｒｙｃｅｌｌｓＬＩＵＢｅｉ１ꎬＺＨＯＵＨｕｉ￣ｆａｎｇ１ꎬＺＨＯＵＢｏ￣ｒｕ１ꎬＪＩＡＮＧＸｉａｏ￣ｆｅｉ１ꎬＸＵＪｉａｎ￣ｙａ２ꎬＸＩＥＴｏｎｇ２ꎬＳＨＡＮＪｉｎ￣ｊｕｎ２(１.ＴｈｅＦｉｒｓｔＣｌｉｎｉｃａｌＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００２３ꎬＪｉａｎｇｓｕꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃｓꎬＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＮａｎｊｉｎｇ２１００２３ꎬＪｉａｎｇｓｕꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀[Ａｂｓｔｒａｃｔ]㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌｕｔｅａｌｐｈａｓｅｄｅｆｅｃｔｒｅｍａｉｎｓｕｎｃｌｅａｒ.ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＢｕＳｈｅｎＺｈｕＹｕｎＤｅｃｏｃｔｉｏｎｏｎｔｈｅｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｔｈｅｐｉｔｕｉｔａｒｙｇｌａｎｄꎬｗｅｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｄｉｃａｔｅｄｓｅｒｕｍｏｆＢｕＳｈｅｎＺｈｕＹｕｎＤｅｃｏｔｉｏｎｏｎｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ￣ｆｏｌｌｉｃｌｅ￣ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ(ＦＳＨ)ａｎｄｌｕｔｅｏｔｒｏｐｉｃｈｏｒｍｏｎｅ(ＬＨ)ｉｎｒａｔｐｉｔｕｉｔａｒｙｃｅｌｌｓ.㊀Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＴｈｅＢｕＳｈｅｎＺｈｕＹｕｎＤｅｃｏｔｉｏｎｗａｓａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｔｏｔｈｅｆｅ￣ｍａｌｅＳＤｒａｔｓｂｙｇａｖａｇｅｔｏｐｒｅｐａｒｅｔｈｅｓｅｒｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＢｕＳｈｅｎＺｈｕＹｕｎＤｅｃｏｃｔｉｏｎ.ＴｈｅＣＣＫ￣８ｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘａｃｅｔａｔｅｐｏｗｄｅｒｆｏｒｉｎｊｅｃｔｉｏｎꎬｍｅｄｉｃａｔｅｄｓｅｒｕｍａｎｄｇｏｎａｄｏ￣ｔｒｏｐｉｎｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ(ＧｎＲＨ)ｏｎｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙ.Ｉｎｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｎｏｎ￣ｔｏｘｉｃｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬｗｅｕｓｅｄｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘａｃｅｔａｔｅｐｏｗｄｅｒｆｏｒｉｎｊｅｃ￣ｔｉｏｎｔｏｂｌｏｃｋｔｈｅＧｎＲＨｒｅｃｅｐｔｏｒ(ＧｎＲＨＲ)ｉｎｐｉｔｕｉｔａｒｙｃｅｌｌｓａｎｄｅｓ￣ｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｅＧｎＲＨＲａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｍｏｄｅｌ.Ｔｈｅｎｗｅｔｒｅａｔｔｈｅｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｗｉｔｈｍｅｄｉｃａｔｅｄｓｅｒｕｍ(ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ).Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐ(ｎｏｒｍａｌｐｉｔｕｉｔａｒｙｃｅｌｌｓ)ꎬｔｈｅｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘｇｒｏｕｐ(ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｅｄｗｉｔｈｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘｆｏｒ６ｈｏｕｒｓ)ꎬａｎｄｍｅｄｉｃａｔｅｄｓｅｒｕｍｇｒｏｕｐ(ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｅｄｗｉｔｈｍｅｄｉｃａｔｅｄｓｅｒｕｍｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ).２０ｎｍｏｌ/ＬＧｎ￣ＲＨｗａｓｕｓｅｄｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｃｅｌｌｓｆｏｒ６ｈ.ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＦＳＨａｎｄＬＨｉｎｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＳＨβꎬＬＨβａｎｄＧｎＲＨＲｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ.㊀Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｏｆｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｌｅｖｅｌｓｏｆＦＳＨａｎｄＬＨｉｎｔｈｅＣｅｔｒｏｒｅｌｉｘｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ[(３.９１ʃ０.３６)ｍＩＵ/ｍＬｖｓ(２.２６ʃ０.２２)ｍＩＵ/ｍＬꎬ(８.９４ʃ０.５７)ｍＩＵ/ｍＬｖｓ(３.３５ʃ０.５９)ｍＩＵ/ｍＬꎬＰ<０.０５)].ＩｎｃｏｎｔｒａｓｔꎬｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＬＨｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ[(８.９４ʃ０.５７)ｍＩＵ/ｍＬｖｓ(１０.７９ʃ０.６０)ｍＩＵ/ｍＬꎬＰ<０.０５)]ꎻＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＦＳＨａｎｄＬＨｉｎｂｏｔｈｍｅｄｉｃａｔｅｄｓｅｒｕｍｇｒｏｕｐａｎｄｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ(Ｐ<０.０５).ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｏｆＦＳＨａｎｄＬＨｉｎｔｈｅｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ[(０.９５ʃ０.２３)ｍＩＵ/ｍＬｖｓ(０.５８ʃ０.１２)ｍＩＵ/ｍＬꎬ(０.９８ʃ０.１４)ｍＩＵ/ｍＬｖｓ(０.２７ʃ０.２１)ｍＩＵ/ｍＬꎬＰ<０.０１)]ꎬａｎｄｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧｎＲＨＲｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘｇｒｏｕｐ[(０.９７ʃ０.１３)ｍＩＵ/ｍＬｖｓ(１.７７ʃ０.２６)ｍＩＵ/ｍＬꎬＰ<０.０１)]ꎻＴｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｏｆＦＳＨａｎｄＬＨｉｎｔｈｅｍｅｄｉｃａｔｅｄｓｅｒｕｍｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ<０.０５).ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｏｆＦＳＨβｍＲＮＡａｎｄＬＨβｗｅｒｅｂｏｔｈｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｍｅｄｉｃａｔｅｄｓｅｒｕｍｇｒｏｕｐａｎｄｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ(Ｐ<０.０５)ꎬｔｈｅｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧｎＲＨＲｄｅｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ<０.０１).㊀Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＩｔｉｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＢｕＳｈｅｎＺｈｕＹｕｎＤｅｃｏｔｉｏｎｍａｙｂｅｒｅ￣ｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＧｎＲＨｒｅｃｅｐｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.㊀㊀[Ｋｅｙｗｏｒｄｓ]㊀ｐｉｔｕｉｔａｒｙｃｅｌｌｓꎻｍｅｄｉｃａｔｅｄｓｅｒｕｍꎻｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘꎻｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ￣ｐｉｔｕｉｔａｒｙ￣ｏｖａｒｙａｘｉｓ０㊀引㊀㊀言㊀㊀黄体功能不全(ｌｕｔｅａｌｐｈａｓｅｄｅｆｅｃｔꎬＬＰＤ)是黄体发育和功能异常ꎬ雌㊁孕激素分泌紊乱及月经失调的综合征ꎬ其临床特点是不孕和反复早期流产ꎮ补肾助孕方是临床验方ꎬ该方采用鹿角片为君药补肾助阳ꎬ菟丝子平补肾阴肾阳ꎬ炒白芍㊁淮山药和山萸肉等补肾中阴精共为臣药ꎬ佐柴胡以疏肝解郁㊁鼓舞阳气ꎬ方中八味中药相合ꎬ在经前期(确定排卵之后)使用ꎬ能够起到使 阳长至重 ꎬ调节心肝气机ꎬ安定心肝魂魄的功效ꎬ从而纠正心(脑)￣肾￣子宫生殖轴的功能ꎬ有利于调经助孕种子ꎮ课题组前期对ＬＰＤ模型大鼠进行了整体动物研究ꎬ发现补肾助孕方能影响垂体促性腺激素释放激素(ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ￣ｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅꎬＧｎＲＨ)和其受体(ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ￣ｒｅｌｅａｓｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒꎬＧｎＲＨＲ)及关键信号转导分子的表达ꎬ改善ＬＰＤ大鼠促性腺激素的分泌[１－３]ꎮ本实验通过体外细胞实验进一步对补肾助孕方干预垂体细胞促性腺激素分泌进行研究ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀材料１.１.１㊀实验细胞系、动物及相关主要细胞试剂㊀大鼠垂体细胞(ＲＰＣ)购于美国Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ公司(货号Ｒ１２００ꎬ批号７２０９)ꎬ神经细胞生长液(ＮＧＳ)购于美国Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ公司(货号１５６２ꎬ批号１７４０２)ꎬ青霉素/链霉素溶液(Ｐ/ＳＳｏｌｕｔｉｏｎ)购于美国Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ公司(货号０５０３ꎬ批号１８４８０)ꎻ胎牛血清(ＦＢＳ)ꎬ购于Ｇｉｂｃｏ公司(批号１１３３０６７)ꎮ１.１.２㊀实验动物㊀ＳＰＦ级雌性ＳＤ大鼠ꎬ５０只ꎬ８周龄ꎬ体重(２００ʃ２０)ｇꎬ由南京中医药大学实验动物中心提供ꎬ许可证号:ＳＹＸＫ(苏)２０１３￣０００３ꎮ饲养于南京中医药大学实验动物中心ＳＰＦ环境ꎮ分笼饲养ꎬ其饲养条件:室内温度为２２~２５ħꎬ相对湿度为４０％~７０％ꎬ光照和黑暗１２ｈ交替进行ꎬ大鼠自由的摄食㊁饮水ꎬ保持安静的饲养环境ꎮ１.１.３㊀主要试剂和仪器㊀ＧｎＲＨ购于美国Ｓｉｇｍａ公司(批号ＷＸＢＢ７８９９Ｖ)ꎮ注射用醋酸西曲瑞克(德国ＢａｘｔｅｒＯｎｃｏｌｏｇｙＧｍｂＨ公司ꎬ批号Ｐ００１６３Ａ)ꎮ大鼠促卵泡生成素(ｆｏｌｌｉｃｌｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅꎬＦＳＨ)㊁促黄体生成素(ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅꎬＬＨ)ＥＬＩＳＡ试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司ꎬ批号ＡＫ００１６ＡＰＲ１３００９等)ꎬＲＮＡｉｓｏＰｌｕｓ总ＲＮＡ提取液(日本Ｔａｋａｒａ公司ꎬ批号ＡＡ２４０８￣１)ꎬＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘｃＤＮＡ逆转录试剂盒(日本Ｔａｋａｒａ公司ꎬ批号ＡＫ３９０２)ꎬＳＹＢＲ ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭⅡ荧光定量ＰＣＲ试剂盒(日本Ｔａｋａｒａ公司ꎬ批号ＡＫ６８０２)ꎬ大鼠ＨＰＲＴ１内参引物(上海生工生物工程股份有限公司ꎬ批号为１３０９２４５７Ｚ)ꎬＢＣＡ蛋白定量试剂盒(美国Ｔｈｅｒｍｏｐｉｅｒｃｅ公司ꎬ批号ＭＫ１６４２３０)ꎬ兔多克隆ＧｎＲＨＲ抗体(美国Ａｂｃａｍ公司ꎬ批号ＧＲ１５９１９８￣１)ꎮ１.１.４㊀主要仪器㊀多功能酶标仪(Ｍ２００ＰＲＯꎬ瑞士ＴＥＣＡＮ公司)ꎬ蛋白核酸分析仪(德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司)ꎬ实时荧光定量ＰＣＲ系统(ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７Ｆｌｅｘꎬ美国ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司)ꎬ高速冷冻离心机(５４２７Ｒꎬ德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司)ꎬ泳槽ꎬ半干转膜仪ꎬＣｈｅｍｉＤＯＣＴＭＭＰ蛋白印迹￣多功能成像系统(美国ＢＩＯＲＡＤ公司)ꎬ高速冷冻离心机(５４２７Ｒꎬ德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司)ꎬ二氧化碳培养箱(ＭＣＯ￣２０ＡＩＣꎬ购自日本三洋公司)ꎬ生物安全柜(ＡＣ２￣３ＳＩꎬ新加坡ＥＳＳＣＯ公司)ꎮ１.２㊀方法１.２.１㊀细胞培养㊀ＲＰＣ细胞培养于含１％ＮＧＳ生长液㊁１０％胎牛血清㊁１％Ｐ/ＳＳｏｌｕｔｉｏｎ的高糖ＤＭＥＭ培养基中ꎬ在３７ħꎬ５％ＣＯ２ꎬ饱和湿度的培养箱中静置培养ꎮ待细胞密度接近８５％~９０％时ꎬ胰酶消化㊁传代培养ꎮ取对数生长期细胞进行实验ꎬ以细胞密度１ˑ１０５个/ｍＬ接种于９６㊁１２㊁６孔培养板中ꎬ继续培养２４ｈ后进行实验ꎮ１.２.２㊀补肾助孕方含药血清的制备㊀补肾助孕方(ＢＳＺＹＤ)由淮山药㊁山茱㊁炒白芍㊁醋炒柴胡㊁菟丝子和鹿角片等中药构成ꎬ中药饮片均购自于南京中医药大学的百草堂ꎬ上述药物的水煎浓缩为浓度２ｇ/ｍＬ的药液ꎬ适应性饲养３ｄ以后ꎬ按剂量１ｍＬ/ｋｇ每日早晚２次给正常ＳＤ大鼠连续灌胃２ｄꎬ末次给药１ｈ后ꎬ以１０％水合氯醛按０.３５ｇ/ｋｇ经腹腔注射麻醉ꎬ在无菌条件下ꎬ腹主动脉采血ꎬ室温静置２ｈ后ꎬ离心半径１８ｃｍꎬ以３０００ｒ/ｍｉｎ速度离心１０ｍｉｎꎬ取血清ꎬ５６ħ灭活６０ｍｉｎ后(含药血清或空白对照血清)ꎬ用０.２２μｍ滤器过滤ꎬ－８０ħ冰箱保存备用ꎮ１.２.３㊀细胞分组㊀ＲＰＣ细胞加含药血清作用１８ｈꎬ再加入注射用醋酸西曲瑞克继续作用６ｈꎻ弃上清液ꎬ再给予ＧｎＲＨ刺激６ｈꎬ此为模型组ꎮ同时设西曲瑞克组(单纯注射用醋酸西曲瑞克作用６ｈ)ꎬ补肾助孕方组(只加含药血清作用２４ｈ)和空白组(正常细胞)ꎮ最后收集细胞及上清液ꎬ检测ＦＳＨ和ＬＨ分泌水平ꎬ以及ＦＳＨ㊁ＬＨ和ＧｎＲＨＲ受体的ｍＲＮＡ水平ꎬ各测６次ꎮ１.２.４㊀ＣＣＫ￣８法检测最佳药物浓度㊀实验采用注射用醋酸西曲瑞克造模ꎬ含药血清给药方式ꎮＣＣＫ８法观察补肾助孕方含药血清不同浓度(８０％ꎬ５０％ꎬ３０％ꎬ２０％ꎬ１０％)㊁注射用醋酸西曲瑞克(１２５㊁２５㊁５㊁１㊁０.２ｎｍｏｌ/Ｌ)及ＧｎＲＨ(５０００㊁５００㊁５０㊁２０㊁０.５ｎｍｏｌ/Ｌ)不同剂量对ＲＰＣ细胞活性的影响ꎬ分别选择最大无毒浓度进行以下细胞实验ꎮ将密度为１ˑ１０５个/ｍＬ的ＲＰＣ细胞接种于９６孔板中ꎬ每孔１００μＬ加入不同浓度含药血清㊁注射用醋酸西曲瑞克及ＧｎＲＨꎬ每个浓度设３个复孔ꎬ作用２４ｈꎻ用ＰＢＳ洗涤３次ꎬ后加入１００μＬ培养和１０μＬＣＣＫ￣８的混合溶液ꎬ经孵箱培育４ｈ后ꎬ用酶标仪于４５０ｎｍ波长处测定各孔吸光度值ꎬ并按下式来计算细胞活力ꎮ试验重复３次ꎮ㊀㊀细胞的存活率(％)＝[Ａｓ－Ａｂ]/[Ａｃ－Ａｂ]ˑ１００％㊀㊀Ａｓ:实验孔(待测物质㊁含有细胞的培养基㊁ｃｃｋ￣８)ꎻＡｃ:对照孔(无待测物质㊁含有细胞的培养基㊁ｃｃｋ￣８)ꎻＡｂ:空白孔(不含有细胞和待测物质的培养基㊁ｃｃｋ￣８)ꎮ㊀㊀结果表明ꎬ补肾助孕方含药血清３０％的浓度对细胞增殖活性最大ꎬＧｎＲＨ以２０ｎｍｏｌ/Ｌ浓度对垂体细胞增殖最为适宜ꎬ注射用醋酸西曲瑞克的药物浓度在２５ｎｍｏｌ/Ｌ时对垂体细胞增殖率达到最高ꎮ１.２.５㊀ＥＬＩＳＡ检测㊀按大鼠ＦＳＨ㊁ＬＨ双抗夹心法ＥＬＩＳＡ试剂盒(购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)按操作说明将大鼠血清样本振荡摇匀并稀释ꎬ制备标准品ꎬ将样品加入９６孔板中㊁孵育一抗㊁孵育二抗㊁酶标㊁显色等步骤ꎬ使用多功能酶标仪系统检测并采集分析数据ꎮ１.２.６㊀荧光定量ＲＴ￣ＰＣＲ检测㊀检测垂体细胞中的ＦＳＨ㊁ＬＨ及ＧｎＲＨ受体的ｍＲＮＡ表达①垂体细胞总ＲＮＡ的提取:垂体细胞经ＢＳＺＹＤ含药血清作用１８ｈ后ꎬ弃去上清液ꎮ用预冷的ＰＢＳ将细胞洗涤３次后ꎬ每孔加入０.５ｍＬＴＲＩｚｏｌ置于冰上１５ｍｉｎ裂解细胞ꎬ将裂解液加入１.５ｍＬＥＰ管中ꎬ静置５ｍｉｎꎻ每管移加０.２ｍＬ氯仿ꎬ涡旋仪上剧烈振荡２０ｓꎬ常温静置２ｍｉｎꎬ４ħꎬ以离心半径１８ｃｍ㊁１２０００ｒ/ｍｉｎ速度离心１５ｍｉｎꎬ取上层水相转移至新的ＥＰ管中ꎬ再加入０.５ｍＬ预冷的异丙醇ꎬ颠倒反转数次ꎬ常温静置１０ｍｉｎꎬ以４ħꎬ离心半径１８ｃｍ㊁１２０００ｒ/ｍｉｎ的条件离心１０ｍｉｎꎻ弃上清ꎬ加入１ｍＬ７５％的乙醇(用ＤＥＰＣ水配制)来洗涤ＲＮＡ的沉淀ꎻ再次以４ħꎬ离心半径１８ｃｍ㊁１００００ｒ/ｍｉｎ条件的离心５ｍｉｎꎻ弃上清ꎬ将ＥＰ管倒置于操作台ꎬ室温干燥１５ｍｉｎꎻ每管加入２０μＬ的ＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ沉淀ꎮ测定所提取ＲＮＡ的浓度和纯度ꎬ含量:１.５~２.０ｇ/ＬꎻＡ２６０/Ａ２８０值在１.８~２.０之间ꎮ②逆转录:按照试剂盒说明书进行操作逆转录合成ｃＤＮＡꎮ按照ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥＸＴａｑＴＭⅡ试剂盒说明书进行Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＲＴ￣ＰＣＲ反应ꎬ引物见图１ꎮ反应条件如下:９５ħ３０ｓ后ꎬ完成４０个循环的９５ħ变性５ｓ并在６０ħ扩增３４ｓꎬ各样本均设３组副孔ꎬ并重复３次ꎮ采用ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７Ｆｌｅｘ系统进行数据采集与分析ꎮ数据分析采用相对定量法(ΔΔＣｔ)ꎬ以ＨＰＲＴ１为内参对数据统一换算(２－ΔΔＣｔ)并做统计分析ꎮ表１㊀引物序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ引物名称上游引物(５'￣３')下游引物(５'￣３')ＦＳＨβｍＲＮＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＡＧＡＣＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＴＡＬＨβｍＲＮＡＣＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧｎＲＨＲｍＲＮＡＧＴＧＧＴＧＡＴＴＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＧＡＴＡＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＡＡＡＧ１.２.７㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测大鼠垂体细胞ＧｎＲＨＲ蛋白表达㊀加入混有浓度为１ｍｍｏｌ/ＬＰＭＳＦ的ＲＩＰＡ裂解液ꎬ置于４ħꎬ以离心半径１８ｃｍ㊁１２０００ｒ/ｍｉｎ离心１０ｍｉｎꎮ按ＢＣＡ蛋白浓度试剂盒说明书对蛋白含量进行测定ꎬ配平后１００ħ变性ꎮ采用ＢｉｏＲａｄ垂直电泳槽进行ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ凝胶电泳ꎬＰＶＤＦ膜半干法转膜ꎬ洗膜㊁封固㊁孵育一抗(按相应抗体说明书推荐浓度范围的中间值采用５％ＢＳＡ配置)㊁二抗ꎬＣｈｅｍｉＤＯＣＴＭＭＰ蛋白印迹￣多功能成像系统进行显影ꎬ采用Ｉｍ￣ａｇｅＬａｂ㊁Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ等软件处理图像ꎬ获得光密度数据ꎮ１.３㊀统计学分析㊀采用ＳＰＳＳ１９.０软件进行统计分析ꎬ各组定量的资料进行正态性检验ꎬ符合正态分布的数据采用均数ʃ标准差(ｘʃｓ)形式表示ꎬ服从方差齐性的多组均数比较则采用单因素方差分析ꎬ两两比较以ＬＳＤ检验ꎻ若方差不齐则应用ＤｕｎｎｅｔｔＴ３法分析ꎮ以Ｐɤ０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结㊀㊀果２.１㊀垂体细胞的ＦＳＨ㊁ＬＨ分泌水平的比较的比较与空白组比较ꎬ西曲瑞克组细胞上清ＦＳＨ㊁ＬＨ降低(Ｐ<０.０５)ꎬ补肾助孕方组细胞上清ＬＨ显著升高(Ｐ<０.０５)ꎻ与西曲瑞克组相比ꎬ补肾助孕方组与模型组细胞上清ＦＳＨ㊁ＬＨ水平均明显升高(Ｐ<０.０５)ꎮ见表２ꎮ２.２㊀垂体细胞ＦＳＨ㊁ＬＨ及ＧｎＲＨＲ的ｍＲＮＡ表达水平的比较㊀与空白组比较ꎬ西曲瑞克组ＦＳＨｍＲＮＡ㊁ＬＨｍＲＮＡ显著降低(Ｐ<０.０１)ꎬＧｎＲＨＲｍＲＮＡ表达升高(Ｐ<０.０１)ꎻ补肾助孕方组ＦＳＨｍＲＮＡ㊁ＬＨｍＲＮＡ升高(Ｐ<０.０５)ꎮ与西曲瑞克组比较ꎬ补肾助孕方组㊁模型组ＦＳＨβｍＲＮＡ㊁ＬＨβｍＲＮＡ表达均升高(Ｐ<０.０５)ꎬ而ＧｎＲＨＲｍＲＮＡ表达降低(Ｐ<０.０１)ꎮ见表３ꎮ表２㊀垂体细胞上清ＦＳＨ和ＬＨ水平比较(ｘʃｓꎬｍＩＵ/ｍＬ)Ｔａｂｌｅ２㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＦＳＨａｎｄＬＨｌｅｖｅｌｓｉｎｐｉｔｕｉｔａｒｙｃｅｌｌｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ(ｘʃｓꎬｍＩＵ/ｍＬ)组别ｎＦＳＨ(ｍＩＵ/ｍＬ)ＬＨ(ｍＩＵ/ｍＬ)空白组６３.９１ʃ０.３６８.９４ʃ０.５７西曲瑞克组６２.２６ʃ０.２２∗３.３５ʃ０.５９∗∗补肾助孕方组６４.４０ʃ０.３１＃１０.７９ʃ０.６０＃＃∗模型组６３.９５ʃ０.２８＃８.６６ʃ１.０７＃＃㊀㊀与空白组比较ꎬ∗Ｐ<０.０５ꎬ∗∗Ｐ<０.０１ꎻ与西曲瑞克组比较ꎬ＃Ｐ<０.０５ꎬ＃＃Ｐ<０.０１表３㊀大鼠垂体细胞性激素及其受体水平比较[(ｘʃｓ]Ｔａｂｌｅ３㊀Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｅｘｈｏｒｍｏｎｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｐｉｔｕｉｔａｒｙｃｅｌｌｓｏｆｒａｔｓ(ｘʃｓ)组别ｎＦＳＨβｍＲＮＡＬＨβｍＲＮＡＧｎＲＨＲｍＲＮＡ空白组６０.９５ʃ０.２３０.９８ʃ０.１４０.９７ʃ０.１２西曲瑞克组６０.５８ʃ０.１２∗∗０.２７ʃ０.２１∗∗１.７７ʃ０.２６∗∗补肾助孕方组６１.１５ʃ０.１９∗＃＃１.２７ʃ０.１１∗＃＃１.０７ʃ０.１５＃＃模型组６０.８５ʃ０.１７＃１.０７ʃ０.２４＃０.７７ʃ０.１３＃＃㊀㊀与空白组比较ꎬ∗Ｐ<０.０５㊁∗∗Ｐ<０.０１ꎻ与西曲瑞克组比较ꎬ＃Ｐ<０.０５㊁＃＃Ｐ<０.０１２.３㊀垂体细胞ＧｎＲＨＲ蛋白表达水平的比较㊀与西曲瑞克组比较ꎬ空白组㊁模型组㊁补肾助孕方组ＧｎＲＨＲ蛋白表达均增加(Ｐ<０.０５)ꎮ见图１ꎮ㊀㊀㊀１:空白组ꎻ２:西曲瑞克组ꎻ３:模型组ꎻ４:补肾助孕方组与西曲瑞克组比较ꎬ∗Ｐ<０.０５图１㊀ＧｎＲＨＲ表达水平比较Ｆｉｇｕｒｅ１㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＧｎＲＨＲｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌ３㊀讨㊀㊀论㊀㊀国内外研究表明ꎬ多种影响下丘脑￣垂体￣卵巢￣子宫生殖轴的疾病或因素均可导致ＬＰＤ[４]ꎮＬＰＤ所致的不孕㊁月经不调等不仅仅是卵巢或子宫单一器官功能失常所致ꎬ子宫只是靶器官ꎬ垂体处于中枢地位ꎬ经由垂体前叶促性腺激素细胞分泌的促性腺激素包括了ＦＳＨ和ＬＨꎬ在下丘脑分泌的ＧｎＲＨ的调控下ꎬ与垂体上的受体ＧｎＲＨＲ相结合后调控ＦＳＨ㊁ＬＨ共同调节性腺功能[５－８]ꎮ因为在生理情况下ꎬＬＨ峰决定了卵泡破裂和转变为黄体ꎬＬＨ能使颗粒细胞和卵泡膜细胞均转化成黄体细胞ꎮ失去ＬＨ支持将会导致黄体的退化ꎬＦＳＨ主要能够促进卵泡各种细胞的生长发育[９－１０]ꎮ本实验采取注射用醋酸西曲瑞克构建ＧｎＲＨＲ受体拮抗细胞模型ꎬ注射用醋酸西曲瑞克是ＬＨＲＨ的拮抗剂ꎬ能与内源性的ＬＨＲＨ竞争垂体细胞表面的膜受体ꎬ从而控制ＬＨ和ＦＳＨ的分泌ꎬ抑制ＨＰＯ生殖轴功能ꎬ是构建Ｇｎ￣ＲＨ竞争性拮抗模型的理想药物[１１]ꎮ中医学无 黄体功能不全 ㊁ 胚胎着床障碍 之说ꎬ根据其表现的症候群和病症ꎬ将其归属于 月经失调 ㊁ 不孕症 ㊁ 滑胎 ㊁ 胎漏㊁胎动不安 等范畴ꎮ肾藏精ꎬ肾气旺盛ꎬ经血充盈ꎬ月经方可如期而至ꎬ两精相博而受孕ꎮ国医大师夏桂成创立补肾调周法ꎬ意在调整心(脑)￣肾￣子宫生殖轴(与西医的ＨＰＯ轴说法基本一致)[１２]ꎮ夏老指出ꎬ心脑是神之所藏ꎬ精神相互依存ꎬ精能养神ꎬ神则能驭精ꎬ是以心脑神明方是驾驭排卵之所在ꎮ另外课题组前期已经证实并基本阐明了补肾助孕方对子宫和卵巢的作用与机制[２－３ꎬ１３－１５]ꎬ因此本研究着眼于补肾助孕方对垂体的调节作用ꎬ从体外研究补肾中药对ＧＴＨ表达分泌的调控作用ꎮ本研究通过注射用醋酸西曲瑞克拮抗作用ꎬ减轻了ＧｎＲＨ对其受体的抑制ꎬ导致了ＧｎＲＨＲ转录水平增高ꎮ与ＧｎＲＨ不同的是ꎬ注射用醋酸西曲瑞克没有ＧｎＲＨ作用ꎬ结合ＧｎＲＨＲ后ꎬ无法通过其信号转导机制激活ＦＳＨ㊁ＬＨ的转录表达ꎬ使垂体分泌ＧＴＨ的功能受到抑制ꎮ所以实验中ＦＳＨ㊁ＬＨ的转录水平低于正常组ꎬ分泌量显著下降ꎮ同时ꎬ实验结果也表明补肾助孕方含药血清能够显著改善注射用醋酸西曲瑞克对ＲＰＣ细胞ＧｎＲＨＲ的影响ꎬ提高ＦＳＨ㊁ＬＨ表达分泌水平ꎮ据此可以说明补肾助孕方能够通过影响垂体ＧｎＲＨＲ来调控ＦＳＨ㊁ＬＨ的分泌ꎬ初步揭示了补肾助孕方调控生殖轴紊乱㊁治疗ＬＰＤ性不孕症的作用机制ꎮ下丘脑分泌的ＧｎＲＨ以高度亲和力通过Ｇ￣蛋白耦联受体与垂体前叶上的ＧｎＲＨＲ相结合ꎮＧｎＲＨ与受体结合后主要经由三大信号转导系统(ｃＡＭＰ￣ＰＫＡ㊁ＰＫＣ￣ＥＲＫ１/２￣ＭＡＰＫ和Ｃａ２＋￣ＣＡＭ)来调控ＧＴＨ分泌ꎬ胞外刺激可由激活相关转录因子影响ＦＳＨ及ＬＨ的分泌[１６－１９]ꎮｃＡＭＰ信号通路通过激活其蛋白激酶体系可促进ＦＳＨ和ＬＨ的及分泌ꎬ并且与ＬＨβ分泌的关系较为密切[２０]ꎮＰＫＣ是细胞凋亡过程当中的一种重要负调节因子ꎬ可以通过来激活ＰＫＣ升高Ｃａ２＋的信号ꎬ诱导细胞从凋亡走向增殖ꎬ并且ＦＳＨ的分泌与ＰＫＣ的含量变化也有密切的关系ꎮＭＡＰＫ信号通路链式反应的发生需要胞质内Ｃａ２＋水平的上升ꎬＣａ２＋通过和钙调蛋白(ＣａＭ)结合后形成另一条信号通路ꎬＧｎＲＨ引起Ｃａ从细胞质迁移到细胞膜上ꎬ影响应答基因(ｃ￣ｆｏｓꎬｃ￣ｊｕｎꎬｊｕｎＢ)的表达ꎬ从而引起在ＬＨ分泌的过程中发挥作用[２１－２２]ꎮ综上ꎬ明确了垂体是补肾助孕方的有效作用靶点之一ꎬ通过影响ＧｎＲＨＲ进而调节ＦＳＨ㊁ＬＨ的分泌ꎮ而ＧｎＲＨＲ后３条通路关键因子均能够调节激素分泌ꎬ那么补肾助孕方具体是从哪条通路调节激素分泌的机制尚未明确ꎬ需要我们课题组进一步研究探讨ꎮʌ参考文献ɔ[１]㊀周伯如ꎬ戴佳轩ꎬ周惠芳ꎬ等ꎬ补肾助孕方对黄体功能不全大鼠促性腺激素及其关键调控因子的影响[Ｊ].医学研究生学报ꎬ２０１６ꎬ２９(１１):１１５３￣１１５７.[２]㊀孙光娟ꎬ周惠芳.补肾助孕方药对大鼠子宫内膜细胞ＭＭＰ￣９ｍＲＮＡ㊁Ｃａｓｐａｓｅ￣３ｍＲＮＡ及细胞上清液ＭＭＰ￣９ꎬＴＩＭＰ￣１水平表达的影响[Ｊ].时珍国医国药ꎬ２０１４ꎬ２５(７):１７８０￣１８０３. 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补肾方药对去卵巢大鼠骨密度及血清雌激素水平影响的实验研
究
王建华;尹智炜
【期刊名称】《河北中医药学报》
【年(卷),期】2003(018)003
【摘要】目的：探讨补肾方药对去卵巢大鼠骨质疏松的防治作用及其作用机制。

方法：采用切除大鼠双侧卵巢的方法造成骨质疏松模型，然后给予补肾方药治疗。

结果：补肾方药可使卵巢切除大鼠骨密度(BMD)增加，血清雌激素水平(E2)增加。

结论：补肾方药可以防治卵巢切除大鼠所致的骨质疏松症，升高血清雌二醇可能是其作用机制之一。

【总页数】2页(P6-7)
【作者】王建华;尹智炜
【作者单位】河北医科大学药学院,石家庄,050017;河北医科大学基础医学院
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
【相关文献】
1.雌激素对去卵巢大鼠血清NO、NOS及ET-1水平的影响 [J], 张英;张波;王柏欣;和庆余;王淑秋
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中药补肾调冲方对卵巢早衰大鼠性激素水平及SCF、Cx-37蛋白表达的影响摘要】目的：观察补肾调冲方对大鼠卵巢早衰模型LH、FSH、E2、AMH水平及Cx-37、SCF蛋白表达的影响。

方法：70只SD 雌性大鼠随机分为：对照组,模型组,补肾调冲方低、中、高剂量（以生药计24、12、6g/kg）组,坤泰胶囊组（6g/kg）,结合雌激素片（阳性药）组。

除对照组以外,其他各组均连续应用ig雷公藤多苷片造模14d,在造模结束24h后,分别给予各组相应药物36d。

给药后,应用Elisa法检测血清FSH、LH、E2、AMH水平,免疫组化法检测Cx-37、SCF蛋白的表达。

结果：与对照组比较,模型组FSH、LH水平、SCF蛋白的表达均显著升高,E2、AMH水平、Cx-37蛋白的表达显著降低（P＜0.05）;与模型组比较,各给药组 FSH、LH水平、SCF蛋白表达均显著降低,E2、AMH水平、Cx-37蛋白表达显著升高（P＜0.01）。

结论：补肾调冲方可增强卵巢早衰大鼠的卵巢储备能力,促进卵泡发育,对卵巢早衰可能有治疗作用。

【关键词】中药补肾调冲方;卵巢早衰;卵泡刺激素、促黄体生成素、雌激素、抗缪勒管激素、卵巢干细胞因子SCF、缝隙连接蛋白Cx-37【中图分类号】R28 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）04-0036-03【Abstract】 Objective To observe Bushen Tiaochong Decoction on premature ovarian failure model rats serum FSH and LH, E2, AMH levels and SCF, Cx-37 protein expression influence.Methods 70 female SD rats were divided into 7 groups. Excpt the control group, the other groups were ig tripterygium glycosides tablets 14 d, the mold finished 24h, given the corresponding drug treatment 36d. After administration, Elisa was used to detect FSH, LH, E2 and AMH levels in rats, the expression of SCF and Cx-37 protein was detected by immunohistochemistry.Results Compared with the control group, the expression levels of FSH, LH and SCF protein levels were increased, the expression of E2, AMH, Cx-37 protein level was lower (P < 0.05); compared with the model group, the expression of each group FSH, LH and SCF protein levels were decreased, the expression of E2 and AMH and Cx-37 protein increased(P <0.01).Conclusion The recipe of Bushen and punching can improve the ovarian reserve capacity, promote development of follicle, and may have therapeutic effect on premature ovarian failure.【Key words】Traditional Chinese medicine Bushen recipe; Premature ovarian failure; follicle stimulating hormone, luteinizing hormone, estrogen, anti Mueller hormone, ovarian stem cell factor SCF, gap junction protein Cx-37卵巢早衰指40岁以下的女性持续闭经且性器官出现萎缩，LH、FSH升高，E2降低的综合征。

补肾复方对围绝经期卵巢衰老大鼠血清性激素水平的影响(作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ )作者：丁原全万绍晖王翠霞马乾章刘鹏【摘要】目的研究补肾复方对围绝经期卵巢衰老大鼠血清性激素的影响。

方法将实验大鼠随机分为模型组、补肾复方高、中、低3个剂量组、对照组。

另选4月龄大鼠为青年组，18月龄大鼠为老年组，连续15 d用药后取血，采用磁性分离酶联免疫测定法测定雌二醇(E2)、睾酮(T)、促卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、孕酮(P)。

结果补肾复方可使升高的T、FSH、LH水平下降，同时显著提高大鼠血清E2、P水平(P V 0.05 )。

与青年组比较，模型组、老年组及用药各组E2/T均降低(P V0.05);与模型组比较，补肾复方各剂量组均能使E2/T比值显著升高(P V 0.05 )，对照组有升高的趋势，差异不显著(P > 0.05 )。

结论补肾复方通过增强内源性雌激素效用，有效地调节多项生殖内分泌激素水平，对围绝经期卵巢早衰具有积极的防治作用。

【关键词】围绝经期；补肾复方；大鼠；卵巢衰老；性激素中医认为围绝经期综合征，是肾气渐衰，天癸将竭，肾阴阳失和，冲任二脉虚损而致。

肾为先天之本，元气之根，主藏精气，是人体生长发育和生殖的根本。

而精又为化血之源，直接为胞宫的行经、胎孕提供物质基础。

因此期妇女已历经经、孕、产、孚L，肾气逐渐衰退，阴精日益亏耗，不能灌溉五脏，滋养诸经，则易导致脏气不和，诸变迭起。

本研究观察补肾复方对围绝经期卵巢衰老大鼠血清性激素水平的影响。

1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物Wistar雌性大鼠，由沈阳医学院实验动物中心提供。

质量合格证号：SCXK (辽)2003^0016，微生物控制等级一级。

11〜12月龄大鼠50只，体重(321.36 i29.37)g，4月龄青年大鼠10只，体重(210 ±0.54)g ; 18月龄老年大鼠10只，体重(380 ±30.18)g。

益肾调周法对卵巢早衰模型大鼠卵巢储备能力的影响王浩【摘要】目的观察益肾调周法对卵巢早衰大鼠的卵巢储备能力的影响,探讨其量效关系及作用机制.方法将大鼠模型随机分为空白组(A)、模型组(B)、克龄蒙组(C)、滋肾填精汤高(D1)、汤低剂量组(D2)、温肾填精汤高剂量组(E1)、温肾填精汤低剂量组(E2)、益肾调周法高剂量组(F1)、法低剂量组(F2),A,B组给予每日灌胃两次蒸馏水,各给药组每日灌胃1次.连续用药20 d.于实验末次给药后,各组大鼠断头采血,取血清测定血清中E2值、FSH水平；检测AMH,INHB.结果 (1)各个治疗组的血清E2水平均较模型组有提高,血清FSH的水平均有降低； (2)与模型组比较,各组的AMH水平均有提高,INHB的表达均增强,组间对比差异有统计学意义.结论益肾调周法可以宏观的调整血清中FSH、LH、E2、AMH、INHB的含量,增强卵巢的敏感性并改善卵巢的储备能力,其高剂量组的疗效显著.%Objective Observation the effect of Yishen tune-periods method to ovarian reserve capacity in POF model rats in order to discusse dose-effect relationship and interaction mechanism,it can provide the scientific basis in prevention.Methods The rats were randomly divided into blank group (A),the rest of animal subjects are given by the injection of cyclophosphamide to establish POF model.POF model rats were randomly divided into namely model group (B),climen group (C),zishentianjing soup highdose group (Dl),zishentianjing soup lowdose group(D2),wenshentianjing soup highdose group (El),wenshentianjing soup lowdose group(E2),yishen tune-periods method highdose group(Fl) ,yishen tune-periods method lowdose group (F2).A,B group werepoured distilled water into stomach twices daily,each group was poured once daily,consecutive medication last 20 days.After the last medication ,all rats were taken blood in decollation for blood serum,detect the serum levelof E2,FSH; detect the serum levelof AMH,INHB.Result 甧ach treatment group of serum level of E2 were increased compared with model group; Each treatment group of serum level of FSH were decreased; 〆ach treatment group of serum level of AMH were increased compared with model group,each treatment group of INHB expression were enhanced compared with model group.Among groups had significant difference; Conclusion Yishen tuneperiods method can adjustment macro serum level of FSH,LH,E2,AMH,INHB and strengthen to improve ovarian reserve capacity,the high dose group of curative effect is distinct.【期刊名称】《湖南中医药大学学报》【年(卷),期】2012(032)004【总页数】4页(P13-15,61)【关键词】POF;益肾调周法;E2;FSH;AMH;INHB【作者】王浩【作者单位】湖南中医药大学研究生院,湖南长沙410208【正文语种】中文【中图分类】R711.75卵巢功能早衰（premature ovarian failure, POF）是妇科的常见病之一，在一般人群中患病率为1%～3%，在40岁之前的发病率为1%，30岁之前为1‰，且发病率呈逐年上升的趋势[1]。

补肾益精方对去卵巢骨质疏松大鼠皮质骨生物力学性能的改善作用及机制探讨朱太咏;石印玉;张戈;王健智;沈培芝;赵咏芳;徐宇【期刊名称】《中华临床医药杂志》【年(卷),期】2001(002)005【摘要】目的:探讨补肾益精方对去卵巢骨质疏松模型大鼠皮质骨(股骨)生物力学性能的作用及其相关的机制.方法:将40只10月龄Wistar雌性大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、补肾益精方组和倍美力组,每组10只.正常对照组做假手术,其余4组做卵巢切除术.术后正常饲养90天,第91天开始给药,连续用药90天,处死,测定股骨的骨矿密度和几何尺寸及股骨的生物力学性能.结果:模型大鼠股骨的生物力学性能明显下降,骨强度降低;股骨干外径变细,股骨中段骨皮质面积减少,骨矿密度有所减少.补肾益精方组大鼠股骨的生物力学性能明显提高,骨强度增加;股骨中段外径增粗,骨皮质面积增加,骨矿密度有所增加.结论:补肾益精方能明显改善去卵巢骨质疏松模型大鼠皮质骨(股骨)的生物力学性能.其主要作用机制是:补肾益精方能够提高大鼠皮质骨(股骨)宏观结构的生物力学应答调节机能,使股骨干外径增粗,皮质骨面积增加,骨矿密度有所提高.【总页数】5页(P3-7)【作者】朱太咏;石印玉;张戈;王健智;沈培芝;赵咏芳;徐宇【作者单位】河南省洛阳正骨研究所471002;上海中医药大学附属曙光医院200021;上海市中医药研究院骨伤科研究所200032;河南省洛阳正骨研究所471002;上海市中医药研究院骨伤科研究所200032;上海市中医药研究院骨伤科研究所200032;上海市中医药研究院骨伤科研究所200032【正文语种】中文【中图分类】R28【相关文献】1.补肾中药复方对去卵巢骨质疏松大鼠皮质骨生物力学性能的改善作用及机制的实验研究 [J], 朱太咏;石印玉;张戈;王健智;沈培芝;赵咏芳;徐宇2.补肾益精方对切除卵巢大鼠骨质疏松模型腰椎骨生物力学性能的影响 [J], 朱太咏;石印玉;张戈;王健智;沈培芝;赵咏芳;徐宇;史万忠3.补肾中药复方改善骨质疏松模型大鼠皮质骨生物力学性能的实验 [J], 朱太咏;杜天信;张国梁;周亚;杜志谦;李根林;刘又文4.补肾中药复方改善去卵巢骨质疏松模型大鼠松质骨骨生物力学性能的作用及机制探讨 [J], 朱太咏;石印玉;张戈;赵咏芳;王健智;沈培芝;徐宇5.补肾益精方对卵巢切除后骨质疏松大鼠皮质骨截面几何结构、骨密度和生物力学性能的影响 [J], 张戈;石印玉;朱太咏;沈培芝;徐宇;郑昱新因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

补肾复方对围绝经期卵巢衰老大鼠血清性激素水平的影响（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：丁原全万绍晖王翠霞马乾章刘鹏【摘要】目的研究补肾复方对围绝经期卵巢衰老大鼠血清性激素的影响。

方法将实验大鼠随机分为模型组、补肾复方高、中、低3个剂量组、对照组。

另选4月龄大鼠为青年组，18月龄大鼠为老年组，连续15 d用药后取血，采用磁性分离酶联免疫测定法测定雌二醇(E2)、睾酮(T)、促卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、孕酮(P)。

结果补肾复方可使升高的T、FSH、LH水平下降，同时显著提高大鼠血清E2、P水平（P＜0.05）。

与青年组比较，模型组、老年组及用药各组E2/T均降低（P＜0.05）；与模型组比较，补肾复方各剂量组均能使E2/T比值显著升高（P＜0.05），对照组有升高的趋势，差异不显著（P＞0.05）。

结论补肾复方通过增强内源性雌激素效用，有效地调节多项生殖内分泌激素水平，对围绝经期卵巢早衰具有积极的防治作用。

【关键词】围绝经期；补肾复方；大鼠；卵巢衰老；性激素中医认为围绝经期综合征，是肾气渐衰，天癸将竭，肾阴阳失和，冲任二脉虚损而致。

肾为先天之本，元气之根，主藏精气，是人体生长发育和生殖的根本。

而精又为化血之源，直接为胞宫的行经、胎孕提供物质基础。

因此期妇女已历经经、孕、产、乳，肾气逐渐衰退，阴精日益亏耗，不能灌溉五脏，滋养诸经，则易导致脏气不和，诸变迭起。

本研究观察补肾复方对围绝经期卵巢衰老大鼠血清性激素水平的影响。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物Wistar雌性大鼠，由沈阳医学院实验动物中心提供。

质量合格证号：SCXK（辽）20030016，微生物控制等级一级。

11～12月龄大鼠50只，体重(321.36±29.37)g，4月龄青年大鼠10只，体重(210±10.54)g；18月龄老年大鼠10只，体重(380±30.18)g。