去卵巢致大鼠腰椎间盘退变模型初探

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去卵巢致肾虚的腰椎间盘退变模型的实验研究

腰椎间盘退变组大鼠在去除双前肢３个月后，再去除双卵巢。８个月后，通过Ｍｉｃｒｏ — ＣＴ扫描观察椎体骨密度，藏红０一快绿染色法观测椎间盘组织形态学改变，免疫组织化学法观察 Ⅱ、Ｘ胶原在椎间盘中的蛋白表达，实时荧光定量聚合酶链式反应（ｒｅａｌ — ｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ－ＰＣＲ）法检测细胞外基质相关基因的表达，以评价去除双前肢和双
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｎｌｕｍｂａｒｉｎｔｅｒｖｅｔｅｂｒａｌｄｉｓｃｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｗｉｔｈｋｉｄｎｅｙｄｅｉｃｆｉｅｎｃｙｂｙｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｉｎｇ
意义（０．０００，０．ｏｏ０）；腰椎间盘退变组和肾虚型腰椎间盘退变组聚集蛋白聚糖降解酶２（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ一２，ＡＤＡＭＴＳ一
５）基因的表达较正常对照组高，差异有统计学意义（０．００６，Ｐ－＝０．００８）。结论：采用去双前肢和去卵巢的方式建立的大鼠腰椎间盘退变模型，出现了肾虚 “ 骨象” —— 骨质疏松，并在组织形态学、分子细胞生物学等方面的表现与临床肾虚

三种方法建立大鼠腰椎间盘退变模型

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2018)16-02514-06 2514www.CRTER .org·研究原著·白荣飞，男，1992年生，山西省吕梁市临县人，汉族，广州中医药大学在读硕士，主要从事中医药治疗脊柱退行性疾病研究。

通讯作者: 张震，博士，医师，广州医科大学附属深圳沙井医院，广东省深圳市 518000中图分类号:R318 文献标识码:B稿件接受：2018-03-12Bai Rong-fei, Master candidate, the Third Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Zhang Zhen, M.D., Physician, Shajing Hospital of Shenzhen Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China三种方法建立大鼠腰椎间盘退变模型白荣飞1，张震2，林一峰3，原超3，汪盛玉1，方胜1，迟立业1 (1广州中医药大学第三临床医学院，广东省广州市 510405；2广州医科大学附属深圳沙井医院，广东省深圳市 518000；3广州中医药大学附属骨伤科医院, 广东省广州市 510240)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0221 ORCID: 0000-0002-3939-417X(白荣飞)文章快速阅读：文题释义：针刺纤维环法：采用21 G 针头全层针刺L 5/6椎间盘纤维环，穿刺深度2.3 mm ，针刺纤维环法是较成熟的造模方法，诱导椎间盘退变效果明确。

建立大鼠腰椎间盘针刺退变模型的实验研究的开题报告

建立大鼠腰椎间盘针刺退变模型的实验研究的开题报告一、研究背景腰椎间盘是脊椎的重要组成部分，其主要作用是缓冲和分散脊椎的压力，但是受到外力或内因素的刺激可能导致间盘退变，进而引起椎间关节疼痛、椎间盘突出、腰椎管狭窄等疾病。

当前临床上主要采用手术或保守治疗来缓解腰椎疼痛，但是手术具有较高的风险和费用，而保守治疗效果有限，因此需要寻找一种有效的治疗方法。

针刺是中医生物疗法中常用的方法之一，具有独特的优势和疗效。

已有研究表明，针刺可以通过改善局部微循环、调节细胞因子和神经递质的水平、促进成纤维细胞增殖和基质合成等多种途径来促进腰椎间盘的再生与修复。

因此，本研究将探究针刺治疗大鼠腰椎间盘退变的疗效及其机制，为临床应用提供依据。

二、研究目的1. 建立大鼠腰椎间盘针刺退变模型；2. 探究不同针刺方案对大鼠腰椎间盘退变的治疗效果；3. 分析针刺对局部微循环、细胞因子和基质合成等方面的影响，揭示其作用机制。

三、研究内容1. 大鼠腰椎间盘退变模型的建立。

在大鼠腰椎间盘周围注射5%酒精、牛磺酸或低温刺激等方法制备腰椎间盘退变模型，并进行MRI扫描、生化指标检测等验证。

2. 针刺治疗实验的设计。

根据模型建立的结果，将大鼠分为模型组、针刺组和假手术组，针刺组按照不同的针刺方案进行治疗，如常规针刺、电针、穴位联合针刺等，模型组和假手术组分别不给予治疗。

3. 治疗效果的评估。

观察大鼠的行为学表现、MRI和生化指标等，比较不同方案的针刺治疗对腰椎间盘退变的疗效，并探究其可能的作用机制。

四、研究意义本研究旨在探究针刺治疗腰椎间盘退变的疗效及其作用机制，为临床提供一种新的治疗手段，降低患者的治疗风险和费用。

同时，也对深入理解针刺治疗机制和促进中西医结合的发展具有重要的意义。

椎间盘退变模型研究进展

椎间盘出现纤维化、髓核破裂及结构紊乱等改变。
Ｎｅｍｏｔｏ
模型。模型的局限性主要是：①研究结果可能由于动
物种类、饲养环境的不同而产生差异。例如：同种类的两组小鼠可能由于饲养环境不同．其椎间盘的解
Ｙ等［孔］的研究也提示吸烟可能与椎间盘退
变有关。２体外椎间盘退变模型２．１单层培养椎间盘细胞模型
Ｉｃｈｉｍｕｒａ
细胞和纤维细胞的培养。ＨｅｌｅｎＨＥ等㈨单层培养
人纤维环细胞。分析体外单层培养人纤维细胞的增
殖能力与年龄、性别、椎间盘退变程度的关系。发现女性、高龄及退变后期椎间盘均不利于细胞增殖。
Ｐｒｅｒａｄｏｖｉｃ
变模型中可能无法模拟出人慢性退变的椎间盘存在的营养问题、胶原分解、基质破坏以及细胞凋亡等变化；⑤无法模拟由椎间盘退变而引起的疼痛表现。疼
能和形态学改变。发现受压迫的神经纤维中。较大的
神经纤维较较小的神经纤维更早发生损伤。１．６营养障碍模型现在普遍认为椎间盘的营养供应障碍也会导致椎间盘退变。于是出现了营养障碍模型．其对于评估新的椎间盘退变和修复的生物学干预措施也有重要意义。Ｗｅｄ
Ｍ
Ｊ等［１８］建立羊椎间盘营养障碍诱导椎
间盘退变模型。结果显示此种干预措施可严重影响
痛往往是患者寻求治疗的主要原因，虽然通过对神经形态以及功能的观察．可以得到部分研究结果。但
Ａ等㈣进行人髓核细胞单层培养。发现传
Ａ
代细胞的Ｉ型胶原ｍＲＮＡ表达水平持续降低。Ⅱ型胶原及蛋白聚糖ｍＲＮＡ水平保持稳定。Ｃｈｏｕ
Ｉ等
【麓Ｊ单层培养羊内、外层纤维环细胞，发现细胞传至第２代时，外层细胞的Ｉ型胶原表达水平高，而内层细
ＧｒｅｇＡｎｄｅｒｓｏｎ
等［：］构建静态加压模型。结果显示模型大鼠尾椎间盘的厚度、轴向顺应性葡糖胺聚糖含量明显升高。

大鼠肾虚型椎间盘软骨终板退变病证结合模型的构建与评价

中医正骨2021年5月第33卷第5期JTrad Chin Orthop Trauma,2021,Vol.33,No.5（总321）-1--基础研究•大鼠肾虚型椎间盘软骨终板退变病证结合模型的构建与评价夏炳江，沈兴潮,胡松峰，韦金忠，许杨(绍兴市中医院，浙江绍兴312002)摘要目的:探讨采用切除双侧卵巢结合阻断软骨终板营养供应法构建大鼠肾虚型椎间盘软骨终板(cartilage endplate,CEP)退变病证结合模型的可行性。

方法：将128只12周龄SPF级雌性SD大鼠随机分为空白组、CEP退变模型组、病证结合模型组，每组36只。

CEP退变模型组大鼠于椎间盘CEP下方骨质处注射无水酒精，病证结合模型组大鼠摘除双侧卵巢并于椎间盘CEP下方骨质处注射无水酒精，空白组大鼠不做任何处理。

造模后观察并记录大鼠表观特征，测定肾虚症状体征量化评分。

分别于造模后4周、8周，从各组随机抽取6只大鼠，先摄尾椎X线片，测算尾椎骨密度;再处死大鼠，取出尾椎，行Micro-CT扫描测算骨小梁数目(trabecular number,TN)、骨小梁分离度(tradecrlar reparation,TS)、骨小梁厚度(tradecrlar thickness,TT);再从各组随机抽取6只大鼠，切取造模椎间盘，采用HE染色观察各组大鼠椎间盘CEP组织退变情况，采用实时定量聚合酶链反应法检测椎间盘CEP组织聚集蛋白聚糖和含I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(a Pisintesrin and metalloprotease with thrombospondin type I motifs,AD A MTS)-5基因表达量。

结果:①一般情况。

在造模过程中，所有大鼠均无意外死亡发生。

CEP退变模型组1只大鼠术后3P出现尾部切口愈合不良、坏死现象,换药后1周左右切口愈合;其余大鼠尾部切口均愈合良好。

②大鼠表观特征。

造模后，病证结合模型组大鼠逐渐出现毛发枯槁易脱落、饮食增多、精神倦怠、两眼无神、大便干结变硬、活动减少、反应迟钝等肾虚表现，空白组与CEP退变模型组大鼠无上述表现。

椎间盘退变动物模型研究进展

椎间盘退变动物模型研究进展【关键词】椎间盘退变常用于研究椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IVDD)的发生机制和检测介入治疗手段有效性的动物实验模型可分为体内、体外和计算机模拟实验三种。

体外实验模型和计算机模拟实验模型研究IVDD有明显的局限性，所以常用的实验方法仍然是体内研究。

体内椎间盘退变模型可分为自发性和诱导性两种。

自发性椎间盘退变模型是通过系统方法引起动物遗传改变，或通过改变喂养食物引起动物行为方式改变而引起IVDD发生。

诱导性椎间盘退变模型又可分为机械性损害模型和结构性损害模型。

为了更好地了解各种动物模型的优缺点，本文对椎间盘退变动物模型进行了比较，分析其与人类可能的相关性。

1 动物模型的要求及动物选择关于IVDD动物模型的方法已经有多种报道，所选择的动物和方法的可靠性、可重复性亦存在较大差异［1］。

建立的动物模型要求与人类的IVDD具有相似性和可比拟性。

应包括以下几个方面：a)能再现椎间盘退行性病变的客观规律；b)模型重复性好；c)所选的动物解剖和生理特点尽可能与人类近似。

动物模型制备已经有近75年的历史。

Lob等(1933)损伤兔的纤维环后观察到椎间盘产生与人类椎间关节病相似变化。

Key等(1948)首先报道实验动物椎间盘退行性改变。

灵长类在生物进化方面同人类的亲缘关系比较密切，解剖生理特点与人类最为近似，如恒河猴是用于制作人椎间盘退变模型最为理想的动物，但是由于经济因素，其应用受到一定限制。

近十几年来，倾向于选用猪、狗、羊等传统动物制作模型。

目前大鼠是最常用的实验动物，具有价格低廉，饲养方便，可适用大规模实验等优点，而且其椎间盘在解剖和生化结构上与人类椎间盘非常相似［2］。

2 椎间盘退变动物模型的建立诱发性椎间盘退变模型机械模型应力改变致椎间盘退变模型流行病学研究显示IVDD与应力有关。

生物力学因素在IVDD中的作用非常突出，首先异常的应力可直接损伤椎间盘结构。

MMP-13在去势大鼠退变腰椎间盘组织中的表达及意义

MMP-13在去势大鼠退变腰椎间盘组织中的表达及意义摘要】目的探讨MMP-13在去势大鼠退变腰椎间盘组织中的表达及临床意义。

方法 30只3月龄Sprague-Dawley (SD)大鼠，随机均分为3组，每组10只：基础对照组(BL组)；双侧卵巢切除（OVX）手术组；手术对照组（Sham组）；BL组在手术开始前处死，其余2组术后三个月处死，取L4-5腰椎及椎间盘进行HE常规染色及运用免疫组化检测椎间盘MMP-13的表达。

结果 OVX组与Sham组比较大鼠椎间盘中MMP-13表达明显升高（P<0.05）。

结论 MMP-13表达量的增加可能是椎间盘退变形成和发展中起重要作用。

【关键词】椎间盘退变腰椎免疫组化 MMP-13Role and change of mmp-13 during lumbar intervertebral disc degeneration in ovariectomized rats // ZHANG sheng-qiang,Li,Peng SunNa, Department of Orthopedics,the Tan Hai Hospitai of Tangshan, Hebei, 063200,China【Abstract】 [Objective] To investigated the effects of MMP-13on disc degenerationin the OVX rats．[Method] Thirty 3-month-old female Sprague-Dawley rats were randomized into three groups of ten animals each．The baseline control group (BL group)；Sham group；OVX group.in all rats killed 3 months of postsurgery.L4-5 lumbar spines and intervertebral disc sections wereStained with HEand immunostained with MMP-13. [Result] he immunostaine expression of MMP-13in the OVXgroup was higher than sham group and Sham group (P<0.05). [Conclusion] It implies that mmp-13 may play an important role in the development and progressionof the lumbar intervertebral disc degeneration.【Key words】intervertebral disc degeneration lumbervertebrae immunohistochemistry mmp-13椎间盘退行性疾患是脊柱常见病之一，其退变的确切机制至今仍不十分清楚，但研究证实：基质金属蛋白酶（Matrix Metall oproteinases,MMPS）的异常增高可能是椎间盘退行性变的重要原因[1]。

最新：椎间盘退变动物模型的研究

最新：椎间盘退变动物模型的研究摘要椎间盘退行性变（intervertbal disc degeneration，IDD）是指在多种因素作用下椎间盘组织发生生物力学和组织结构改变，使纤维环破裂，髓核组织突出，压迫脊髓和神经根，进而引起患者腰腿痛的疾病。

椎间盘退变是临床上的常见病和多发病，严重影响患者劳动能力和日常生活。

由于生活习惯和方式的改变，近年来椎间盘退变发病人群也逐渐倾向年轻化。

椎间盘退变的病因、发病机制及诊疗方法一直是脊柱外科研究的热点话题。

构建一种贴近于人体的椎间盘退变动物模型，对探究椎间盘退变的病因、病理机制以及非手术治疗方法有重要的临床意义。

目前对椎间盘退变模型的建立主要包括两大方面：体外模型和体内模型。

体外模型主要有两种：体外细胞培养和组织器官培养；而体内模型研究的较多，主要有七种两大类：自发性和诱发性两种模型。

其中自发性退变模型又称增龄性退变，而诱发性模型是指通过损伤动物的椎间盘结构、改变椎体生物力学结构、手术导致脊柱失稳或构建神经根压迫以及基因敲除等方法构建椎间盘退变动物模型。

虽然动物造模的制作方法及文献报道不少，但每种方法均有其各自的优缺点，在选择造模方法时要权衡利弊。

目前仍没有一种公认的、全面的模拟人类椎间盘退变的动物模型。

椎间盘退变是多种因素共同作用下形成的复杂性疾病，其发病机制一直是困扰临床的难题。

椎间盘退变主要引发患者的腰腿痛，据文献报道40%的腰腿痛是由椎间盘退变引起[1]。

腰痛已经成为影响人们生活、工作以及就医的主要原因，并给个人及社会带来巨大的经济负担[2]。

目前关于人类椎间盘退变的发病机制还不十分明确，而动物模型为研究椎间盘退变性疾病的病因、生理病理机制和治疗手段提供了一个良好的实验载体。

近年来国内外有关椎间盘退变模型的研究层出不穷。

利用不同种动物、采用多种方式来构建椎间盘退变模型，为研究椎间盘退变性疾病的发生机制和治疗提供了理论基础；但无论是哪一种造模方法都存在一定的优缺点，而且不能完全复制人类的椎间盘退变。

大鼠腰椎间盘退变模型的建立及X线和病理学观察

大鼠腰椎间盘退变模型的建立及X线和病理学观察陈德胜;金群华;李燕;张伟【摘要】目的设计一种新的用于腰椎间盘退变相关研究的动物模型.方法选取32只SD大鼠,随机分为实验组和对照组,每组16只;实验组采用以L3为中心切除L1～L6棘突、关节突、棘上、棘间韧带,切断双侧竖棘肌的手术方法;对照组仅切开皮肤后即缝合.术后分别于第1、2、3个月随机选取5只大鼠行X线检查并处死后进行病理学观察.结果对照组大鼠X线检查无特异性改变,而实验组显示椎间隙狭窄、椎体不稳、软骨终板钙化;对照组病理学检查无明显变化,实验组表现为髓核细胞减少,外周纤维环纤维化样变.结论本方法科学、经济、实用性强,是研究腰椎间盘退变的比较理想的动物模型.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2006(028)003【总页数】4页(P199-201,封二)【关键词】大鼠;椎间盘退变;X线;病理学【作者】陈德胜;金群华;李燕;张伟【作者单位】宁夏医学院附属医院骨科,银川,750004;宁夏医学院附属医院骨科,银川,750004;宁夏医学院基础学院生物化学与分子生物学教研室,银川,750004;宁夏医学院附属医院放射科,银川,750004【正文语种】中文【中图分类】R6椎间盘退变是腰腿痛和下腰痛的重要原因之一，也是腰椎间盘突出症和其它腰椎疾患的病理基础。

一种可靠的腰椎退变模型不仅要为研究脊柱退变的发病机制提供资料,而且也要为椎间盘退变寻求一种新治疗模式的研究提供试验平台。

本文设计和建立一种新的腰椎间盘退变的动物模型，通过对腰椎间盘退变的不同时段进行椎间盘的病理学检查，提供相应的病理学基础，并为临床研究提供相关的实验依据。

1 材料和方法1.1 实验动物选取SD(Sprague-Dawley)大鼠32只，雄性，平均月龄2.5个月,平均体重(350±50)g，宁夏医学院实验动物中心提供。

随机分为实验组和对照组，每组各16只。

分别按标准饲养条件下单笼饲养，饲养室室温控制在25℃左右。

大鼠退变腰椎间盘组织的超微结构观察

大鼠退变腰椎间盘组织的超微结构观察【摘要】［目的］观察大鼠腰椎间盘退变动物模型中椎间盘组织的超微结构改变。

［方法］32只SD大鼠随机分为实验组和对照组，每组各16只。

实验组采用手术方法以L3为中心切除棘突、关节突、棘上、棘间韧带，切断双侧竖棘肌。

对照组仅切开皮肤后即缝合。

术后8周，应用电镜技术对SD大鼠椎间盘组织进行详细的超微结构观察。

［结果］对照组的椎间盘组织超微结构的病理改变不显著，而实验组表现为软骨样细胞减少，出现不同程度地退变、坏死，细胞器数目减少，细胞外周致密颗粒增多；基质中胶原纤维发生不同程度的变性、融合、扭结或钙化，胶原纤维束间裂隙增大；［结论］应用电镜观察腰椎间盘退变动物模型的超微病理改变，可为研究腰椎间盘疾患提供相关的实验依据。

【关键词】椎间盘退变超微结构动物模型Observation of ultrapathology in the rat model study of experimental lumbar intervertebral disc degeneration∥Abstract：［Objective］To observe the change of ultrapathology in the rat model study of experimental lumbar intervertebral disc degeneration.［Method］Thirty two Sprague Dawley（SD）rats were divided into two guoups atrandom,including in the experimental group and the control group.The experimental group was incised through posterior approach along spinous process,resected below erector spinal muscle,the supraspinal and interspinal ligament and the posterior of the zygapophysial joint at the center of the third lumbar spine for providing the rat degeneration of lumbar intervertebral induced by mechanical instability state.The control group was just incised the skin.All of th rats were examined after eight weeks by electronmicroscope.［Result］There was no special ultrapathological characterization after operation in the control group,while in experimented group most chonduocyte like cells were degenerated or necrotic and their number decreased markedly,collagenous fibrils appeared various kinds of degeneration including fusion,twist and calcification,and there were gaps between the collagen bundles.［Conclusion］Observing the change in the rat model study of experimental lumbar intervertebral disc degeneration by ultrapathology,it can offer the experimental data studying tile degeneration of lumbar intervertebral disc.Key words：intervertebral disc degeneration; ultrapathology; animal model椎间盘退变是腰腿痛和下腰痛的重要原因之一，也是腰椎间盘突出症和其他腰椎疾患的病理基础。

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去卵巢致大鼠腰椎间盘退变模型初探目的：观察去卵巢对大鼠腰椎间盘退变的影响，建立大鼠腰椎间盘退变模型。

方法：采用8个月龄健康雌性SD大鼠30只，随机分为空白组、假手术组、模型组，每组各10只。

模型组行双侧卵巢切除术，假手术组在其双侧卵巢旁边分别取和卵巢同等大小的脂肪组织，空白组不做任何处理。

造模后所有实验大鼠在同等条件下喂养，13周后全部处死，观察其腰椎间盘组织形态学、脊索细胞数量及髓核细胞超微结构的变化。

结果：组织形态学评分及脊索细胞数量改变：模型组和空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05），空白组和假手术组比较差异无统计学意义（P>0.05）；透射电镜观察其髓核细胞的退变程度：模型组>空白组，空白组和假手术组退变程度相当。

结论：采用去卵巢的方式能初步建立大鼠腰椎间盘退变模型。

椎间盘退变引起的腰椎间盘突出、腰椎失稳、滑脱等均是临床上的常见病。

国内外关于椎间盘退变的病因和发病机制尚无定论，构建能模拟人椎间盘退变的动物模型是研究的关键，既往多采用直接或间接对椎间盘进行损坏制作腰椎间盘退变模型，本研究改变既往造模方法，采用去卵巢方法，试图建立女性绝经后腰椎间盘退变的动物模型。

1 材料与方法1.1 实验动物SPF级8个月龄健康雌性SD大鼠（购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司）30只，体重350～400 g。

1.2 实验方法1.2.1 试验分组及动物模型的建立30只大鼠按照随机数字表法分为三组：空白组（A组）、假手术组（B组）、模型组（C组），每组各10只。

采用摘卵巢手术制造去势大鼠模型方法：C组用氯胺酮（50 mg/kg）行腹腔注射麻醉，在无菌条件下从距离大鼠第一胸腰椎外侧1 cm处纵向切开皮肤及两侧肌肉，摘除双侧卵巢[1]，B组则切除等同于卵巢体积大小的脂肪，止血后分两层缝合，术后连续3 d大腿肌肉注射青霉素，每只大鼠10万U单位/d，A组不做任何处理。

1.2.2 模型成功的判断依据阴道细胞涂片：术后24 h开始行阴道细胞涂片，连续5 d。

用小滴管吸生理盐水少许，滴于大鼠阴道口内，吸出少量阴道分泌物，涂于载玻片上，立即置于95%的乙醇中固定30 min后取出晾干，做苏木精-伊红染色，光镜下观察。

去卵巢后大鼠表现为动情间期，无或者有少量角化上皮细胞，表示去势成功。

1.2.3 观察指标与检测第13周后处死所有大鼠，取出大鼠腰椎部分，剔除椎体周围软组织，经L5/6、L6/S1椎间隙取出椎间盘组织。

L5/6椎间盘组织放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，显微镜下对其椎间盘组织进行观察，利用Wang等制定的椎间盘组织学评分系统对大鼠椎间盘髓核、纤维环及骨赘的形态学退变程度进行评分，根据退变程度的加剧其得分增加（髓核0～3分，纤维环0～2分，骨赘0～2分），一个椎间盘的得分为这3项得分的总和。

同时每个标本随机1个400倍高倍标准视野，进行脊索细胞计数。

将所取L6/S1椎间盘组织立即放入2.5%戊二醛溶液中固定24 h；2%的锇酸固定2 h，0.1M 二甲砷酸钠冲洗3次，间隔2 h进行一次后过夜；0.1M二甲砷酸钠冲洗2次，间隔2 h进行一次；乙醇梯度脱水，环氧树脂-环氧丙烷混合液浸泡24 h，Epon 812包埋；切片、染色，LKB-Ⅲ超薄切片机进行超薄切片，厚度约500埃，醋酸铀、硝酸铅双重染色，透射电子显微镜观察、摄片：各标本在不同视野和放大倍数下进行观察椎间盘髓细胞数目和体积、胞浆内容物（细胞核、线粒体、内质网等）形态改变情况，并摄片，用MICROTEK3600 扫描仪扫描负片，图像输入计算机。

1.3 统计学处理所有数据采用SPSS 17.0统计学软件进行处理，计量资料以（x±s）表示，组间比较若方差齐时选择LSD法，方差不齐时选择Dunnett T3法进行方差分析和两两比较，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果2.1 光镜下椎间盘组织形态学表现及退变程度评分空白组和假手术组腰椎间盘纤维环与髓核排列基本规则，软骨细胞单层排列与纤维胶原层交替分层，髓核中脊索细胞相对其他组丰富（见图1、2）；模型组腰椎间盘纤维环胶原纤维层和软骨细胞多分布不规则，胶原纤维减少或有裂隙，软骨细胞增多，逐渐取代纤维成分或基本为软骨成分，髓核成分减少或消失，可见骨化，皱缩，脊索细胞明显减少或消失（见图3）；喂养第13周后的退变程度评分比较：空白组（1.90±0.99）分，假手术组（2.10±1.10）分，模型组（5.00±1.10）分。

假手术组与空白组比较差异无统计学意义（P=0.691）；模型组与空白组比较差异有统计学意义（P=0.000）。

2.2 400倍光镜下脊索细胞计数治疗第13周时随机1个400倍高倍标准视野下脊索细胞数量：空白组（16.80±4.04）个，假手术组（16.20±4.13）个，模型组（10.30±4.06）个。

模型组脊索细胞计数较空白组及假手术组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组与假手术组比较差异无统计学意义（P=0.720），表明去卵巢后加速了大鼠椎间盘内脊索细胞的消失，加速了椎间盘的退变。

见图4、5。

图4 脊索细胞数量较少（HE染色×400）2.3 髓核细胞超微结构观察空白组和假手术组类软骨细胞少，细胞稍有退变，细胞核呈卵圆形或圆形，核膜完整、光滑，异染色质比较丰富，细胞质内粗面内质网比较丰富并且有小的线粒体，散在分布糖原颗粒及少量的脂肪滴，细胞外常见细突起，其外有基质包围，未有明显的巢样结构（见图6、7）；模型组类软骨细胞更少见，退变程度明显加重，和空白组比较差异较为显著，周围有大量细胞周间质，形成鲜明的巢样结构。

细胞内溶酶体明显增多，胞核扭曲变形，常染色质凝集成块，分布于核膜下或散在分布，胞浆基质密度加深、线粒体空泡化加重，整个细胞体积明显缩小，凋亡细胞核固缩成团或碎裂成多块，散在于胞质中，胞质模糊不清，在致密的无定形基质中见一些粗颗粒状物或空泡，胞膜缺如（见图8）。

图5 脊索细胞较多（HE染色×400）3 讨论椎间盘由软骨、外层的纤维环和内部凝胶样的髓核构成，椎间盘细胞由髓核细胞及纤维环细胞组成，脊索细胞存在于椎间盘髓核组织内，起源于内胚层。

相关研究表明脊索细胞随着人类年龄增长其数量会逐渐较少甚至消失，并逐步被软骨细胞代替[2-3]。

Wang等[4-5]发现髓核内脊索细胞凋亡是椎间盘退变的起始点，是退变的主要病理基础。

从Guehring等[6]认为，随年龄的增长，脊索细胞的消失甚至被取代可能原因是椎间盘失去血运所致。

吴靖平等[7]发现增龄和应力都能加速大鼠脊索细胞减少，从而加速椎间盘退变，其变化规律与人类一致。

椎间盘纤维环破裂、髓核突出的组织病理学基础是髓核细胞数量的减少以及其生理活性下降[8]。

椎间盘退变会导致一系列的脊柱类疾病，而其原因现未完全明确，从现有研究来看是多种因素作用的结果[9]。

椎间盘退变始于髓核内部细胞的凋亡和基质的重建。

外层纤维环随退变的发展改变了它正常的板层排列结构，降低了椎间盘承重的机械强度，随退变程度增加，内层纤维环出现放射状裂隙，并向外层延伸，致椎间盘完整性的丧失，并逐随之出现有椎间盘退变引起的腰椎间盘突出症、腰椎椎体不稳、腰椎侧弯、腰椎旋转畸形等疾病。

椎间盘退变机制主要包括：家族遗传，椎间盘营养供应减少，细胞凋亡失衡，基质酶活性改变，生物力学机制的改变，细胞因子的作用及自身免疫反应等[10-11]。

目前常用于研究椎间盘退行性疾病的模型可分为体内、体外模型，体内椎间盘退变模型可分为诱发性和自发性两种，体外椎间盘退变模型可分为细胞培养模型和椎间盘组织培养模型[12]。

诱发性椎间盘退变模型主要包括脊柱应力改变、破坏脊柱结构致脊柱失稳、直接破坏椎间盘组织等方法，其中手术损伤椎间盘突出模型也是目前在研究椎间盘退行性变疾病中常用的方法[13]。

但目前尚无公认的能够完全模拟人类椎间盘退变的标准模型[14]，因此临床实验研究中，应充分考虑各模型的适用性及局限性，以便选择合适的动物模型，为了能更好地为人类椎间盘退变研究提供支持，椎间盘退变动物模型的研究仍任重道远。

刘清华[15]研究发现，卵巢切除去势方法建立骨质疏松大动物模型可引起椎间盘退变。

临床工作中发现绝经后妇女出现腰椎退行性疾病的不在少数，绝经这一因素是否加速了人类椎间盘退变目前尚无明确定论。

本实验采用爬行类动物大鼠作为研究对象，此类动物在一定程度上减少了生物力学对椎间盘退变的影响，普通大鼠的平均寿命在2.0～3.5年，性成熟年龄在2～8个月之间，实验中选择8个月龄性成熟大鼠，再行造模手术，使去卵巢这一因素是否参与了椎间盘退变更具有可信度。

统计学结果显示，大鼠去卵巢后第13周腰椎间盘组织形态退变严重、脊索细胞数量减少，其退变评分和脊索细胞计数和空白组及假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05），同时模型组髓核细胞超微结构退变较空白组及假手术组更为明显。

综上所述，去卵巢这一因素加速了大鼠椎间盘的退变，性成熟雌性大鼠通过去卵巢这一方法能初步建立腰椎间盘退变模型，这种模型模仿现实中绝经妇女椎间盘退变模型，为临床进一步研究如何防止绝经后妇女腰椎间盘退变提供初步动物模型。

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