下载文档原格式
低温石油降解菌LHB16的筛选及降解特性研究•相关推荐
低温石油降解菌LHB16的筛选及降解特性研究
摘要：目的:筛选、鉴定低温石油降解菌并对其降解特性进行研究.方法:富集分离低温石油降解菌;采用形态学、生理生化实验和分子生物学方法进行菌种鉴定;紫外分光光度法和GC-MS检测石油降解特性.结果:自盘锦油田低温环境土样中分离到1株低温菌,命名为LHB16,该菌能以石油烃为惟一碳源和能源.经鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia).该菌生长温度范围0℃～35℃,最适生长温度15℃.在接种量为2%(V/V),原油浓度为0.5%(W/V),振荡培养10 d时,降解率可达80.16%.石油中长链烷烃C15～C32被完全降解.传代培养数代,降解率为81.06%,降解性能稳定.结论:菌株LHB16在低温地区石油污染的`生物治理中有良好的应用前景.作者：李兵张庆芳窦少华孙子羽王宇迟乃玉 LI Bing ZHANG Qing-fang DOU Shao-hua SUN Zi-yu WANG Yu CHI Nai-yu 作者单位：李兵,张庆芳,窦少华,孙子羽,迟乃玉,LI Bing,ZHANG Qing-fang,DOU Shao-hua,SUN Zi-yu,CHI Nai-yu(大连大学生物工程学院,辽宁大连,116622)
王宇,WANG Yu(大连轻工业大学生物与食品工程学院,辽宁大连,116034)
期刊：生物技术 PKU Journal：BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2010, 20(5) 分类号：X172 关键词：低温石油降解筛选 Stenotrophomonas maltophilia。
同时降解柴油和去除Cr(Ⅵ)的混合菌种特性研究吴奇; 刘海华; 李瑞娟; 马宁; 徐伟霞【期刊名称】《《工业催化》》【年(卷),期】2019(027)011【总页数】5页(P76-80)【关键词】三废处理与综合利用; 复合污染; 混合菌种; 培养基【作者】吴奇; 刘海华; 李瑞娟; 马宁; 徐伟霞【作者单位】西安航空学院能源与建筑学院陕西西安710077【正文语种】中文【中图分类】TQ426.97; X703随着全球工业化进程的加速，复合污染日益释放到环境中。
复合污染物是电力、农药厂、电镀、油漆、炼油、金属冶炼等行业的副产品，通常含有硫氧化物、一氧化氮、农药、多氯联苯、多环芳烃和重金属等。
环境中复合污染物最多的是重金属和多环芳烃。
重金属和多环芳烃的结合对植被、土壤微生物和人类健康构成巨大威胁，对生物体具有致突变性、致畸性和致癌性。
化学氧化法、离子交换法和电镀法等多种污染物综合治理技术已得到应用，但化学法产生二次有害废物，植物萃取法需要较长时间[1]。
生物修复技术具有很多优势。
对含有碳氢化合物和重金属废料的生物修复是基于微生物(如细菌和真菌)吸收或降解使之成为无毒产品。
这些微生物可能是一个污染区的本土微生物，也可能是从另一个地方分离出来并转移到污染区的。
Liu Minchao 等[2]采用水培实验，研究风车草对Cr(Ⅵ)和Ni的积累及耐受机理。
结果表明，在Cr(Ⅵ)和Ni复合污染下，低浓度的Ni提高了风车草对Cr(Ⅵ)的富集和迁移能力，而高浓度的Ni则相反。
Malakul P等[3]在镉和萘的复合污染水体中添加一种改性粘土和螯合树脂，结果显示，改性粘土复合物和螯合树脂对萘生物降解过程中镉的毒性有显著的降低作用，而未填加改性粘土和螯合树脂对镉的毒性没有显着影响。
Liu Yunguo等[4]通过实验得到既可降解苯酚又可去除Cr(Ⅵ)的混合菌液，实验中苯酚是唯一碳源，苯酚初始浓度为150 mg·L-1、Cr(Ⅵ)初始浓度为15 mg·L-1时，Cr(Ⅵ)还原效果最佳，Cr(Ⅵ)还原和苯酚降解均受培养基组成以及复合污染物初始浓度的影响。
2,4-D高效降解菌的筛选及其降解特性李志清，凌晓光，庞立飞，宋伟，杨海龙(山东潍坊润丰化工股份有限公司，山东潍坊261000)[摘要]2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是一类广泛除草剂，但其大量施用导致环境残留已对生态环境造成严重威胁。
从山东某农药厂污水处理站二沉池污泥中筛选出一株高效降解菌，命名为ZQ，能以2,4-D为唯一碳源和能源生长，基于其形态，生化特性及16S rRNA基因序列分析，鉴定为Achromobacter sp.。
优化其降解100mg/L2,4-D条件，结果表明最佳降解条件为：温度35℃，pH=8.0，接种量为2%。
同时，不同初始浓度下2,4-D的降解动力学研究表明ZQ对2,4-D的降解符合一阶动力学模型。
当2,4-D浓度为100mg/L时，降解半衰期大约为10.80h。
菌株ZQ 还可以其他6种常见苯氧羧酸类农药作为唯一碳源生长。
结果证明Achromobacter sp.作为生态修复苯氧羧酸类农药生物强化菌具有潜在的适用性。
[关键词]2,4-D；生物降解；16S rRNA；Achromobacter sp.；降解动力学[中图分类号]TQ[文献标识码]A[文章编号]1007-1865(2021)08-0050-04Isolation,Identification of a2,4-D-degrading Bacterium and its High EffectiveBiodegradation CharacteristicsLi Zhiqing,Ling Xiaoguang,Pang Lifei,Song Wei,Yang Hailong(Shandong Weifang Runfeng Chemical Co.,Ltd.,Weifang261000,China)Abstract:Abstract2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)is a systemic and broad-spectrum foliar herbicide.But because of its frequent use,2,4-D has resulted in considerable pollution to water and soil and thus threatened the ecological environment and human health.In this article,a novel gram negative bacterial strain, named ZQ,capable of utilizing2,4-D as the sole source of carbon and energy was isolated from activated sludge taken from activated sludge from secondary sedimentation tank of a pesticide plant in Shandong province through screening test.According to the analysis of morphology,physiological properties and16S rRNA gene sequence,strain ZQ was identified as Achromobacter sp..Effects of various environmental factors e.g.temperature,initial pH and dosage of bacteria on 2,4-D degradation were optimized.Optimal temperature and pH value for2,4-D degradation(initial concentration was100mg/L)were determined as:35℃,pH=8.0, 2%inoculation quantity.Meanwhile,all the degradation processes of2,4-D under various initial2,4-D concentrations by ZQ were followed the first-order reaction model.The half-life of degradation was about10.80h when the concentration of2,4-D was100mg/L.The other six common phenoxycarboxylic acid pesticides could be also utilized as the sole carbon and energy source for the cell growth.The results indicate the bacterium may represent a promising application for2,4-D bioremediation.Keywords:2,4-D；Biodegradation；16S rRNA；Achromobacter sp.；Degradation kinetics正人类活动产生的环境污染是全世界存在的问题。
石油降解菌群的筛选、构建及其降解特性研究詹亚斌;张桥;陈凯伦;李方敏;马立安【期刊名称】《环境污染与防治》【年(卷),期】2017(039)008【摘要】为了构建高效石油降解混合菌群,从潜江某油田采集8个石油污染土样(分别记为S1~S8)和2个石油污染水样(分别记为W3、W4),以石油为唯一碳源进行富集驯化培养;采用外观评分、石油降解率、石油3组分降解率、饱和烃中正构烷烃色谱分析等方法筛选石油降解优势菌群,构建石油降解混合菌群;采用正交试验研究混合菌群最佳降解条件.结果表明,富集的10个石油降解菌群中S3、S4、S5、S6、S8为优势菌群,培养30 d后的石油降解率分别为21.67%、22.34%、27.23%、20.46%、19.99%;菌群W3、W4对石油乳化效果较好;混合菌群M3(S3+S4+S5+S8+W3+W4)为石油降解优势混合菌群,其最佳降解条件为35 ℃、pH 7.60、含油率1.70%,在最佳条件下培养30 d后,混合菌群M3对石油降解率达30.71%,比最优菌群S5的石油降解率提高了12.78%.【总页数】6页(P860-864,868)【作者】詹亚斌;张桥;陈凯伦;李方敏;马立安【作者单位】长江大学生命科学学院,湖北荆州 434025;长江大学生命科学学院,湖北荆州 434025;长江大学化学与环境工程学院,湖北荆州 434025;长江大学化学与环境工程学院,湖北荆州 434025;长江大学生命科学学院,湖北荆州 434025【正文语种】中文【相关文献】1.产生物表面活性剂石油降解菌的筛选及高效降解菌群的构建 [J], 夏铁骑;常慧萍;张建清2.石油降解菌的分离筛选及混合菌群的构建与优化 [J], 宁卓;刘雅慈;张胜;张翠云;何泽3.石油降解菌的筛选及复合菌群的构建 [J], 李乐;周飞;孙先锋4.石油污染土壤中石油降解菌的筛选及降解特性研究 [J], 汤小萌;马超;熊元林5.石油降解菌群的构建及其对混合烃的降解特性 [J], 范瑞娟;郭书海;李凤梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
降解石油复合微生物菌剂的筛选研究摘要：从30个土样中筛选出3株高效原油降解菌株，它们为dch-16，dch-19和dch-20，7天后降油率分别为75.6%，80.3%和73.2%。
经鉴定，分别是脂肪酸芽孢杆菌属alicycolobacillus，芽孢肠状杆菌属sporomaculum和盐芽孢杆菌属halobacillus。
将此3株高效原油降解菌在原油培养基中进行复合实验，结果表明，在相同条件下复合菌降油效果优于单菌；菌株dch-19与dch-20复合的最佳原油降解条件为：接种量比1：1（总接种量为10%），ph值为7.5，底物浓度20mg·ml-1，温度35℃，原油降解时间为7天。
将实验复筛所得部分降油菌用于胜华炼厂废水处理，效果最好的是菌dch-19和dch-20的复合，处理两天后降油率达到80.2%。
表明复合菌株dch-19和dch-20有很强的适应能力。
abstract： we select three strains of high efficient oil degrading strains from 30 soil samples， i.e. the dch-16，dch-19 and dch-20. seven days later， the oil degradation rate turns to 75.6%， 80.3% and 73.2%. the three strains are identified as the fatty acid bacillus alicycolobacillus，bacillus sporomaculum and bacillus halobacillus. thereafter，we use the three strains of high efficient degradation bacteria for the crude oil compound experiments. the result shows that the compound bacteria has much better efficiency than single bacteria， and the optimized condition for dcd-19and dch-20 is that： the inoculation ratio gets 1：1 with total inoculation 10%， the ph value is 7.5， the concentration of substrate is 20mg. ml-1， and the temperature reaches 35℃，then the degradation of crude oil will be 7 days. further more，we introduce part of the microbial inoculants into the refinery wastewater treatment of shenghua refinery. the compound dch-19 and dch-20 shows the best performance of petroleum degradation which is up to 80.2%.关键词：筛选；石油降解；复合生物菌；炼厂废水key words： selection；petroleum degradation；complex microbial inoculants；refinery wastewater中图分类号：[p642.5] 文献标识码：a 文章编号：1006-4311（2013）13-0296-03————————————作者简介：徐宝刚（1979-），男，山东潍坊人，工程师，工学学士，环境工程给排水专业硕士在读。
!"#$%&'2020,Chemistry&Bioengineeringdoi：10.3969/j.issn.1672—5425.2020.12.013段潍超，杨泽群，刘其友.石油A高效降解菌的筛选、复配及降解条件优化化学与生物工程，2020,37(12):5558.DUAN W C,YANG Z Q,LIU Q Y.Screening and compounding of high efficient petroleum hydrocarbon-degrading bacteria and optimization in degradation conditions'].Chemistry W Bioengineering,2020,37(12)：55-58.石油怪高效降解菌的筛选、复配及降解条件优化段潍超杨泽群2,刘其友2(1.青岛欧赛斯环境与安全技术有限责任公司，山东青岛266555；2.中国石油大学(华东)，山东青岛266555)摘要：基于原油组成选取模式物，从实验室保存的石油A降解菌株(S1、S2、S3、S4、S5、S6"中筛选各模式物的高效降解菌株，并对高效降解菌株的复配进行优化，通过正交实验确定复配菌群的最优降解条件。
结果表明：菌株S2和S5对单环芳A(甲苯)的降解效果最好，菌株S1和S6对多环芳A(菲)的降解效果最好，菌株S4对长链烷A(石蜡)的降解效果最好；将S1、S2、S4复配得到的复配菌群对原油的降解效果最好，其最优降解条件为:pH值7、底物浓度0.4g・L1、氮磷比7:1、接种量1mL、温度30b，各因素对原油降解率的影响大小为：pH值％温度〉底物浓度％接种量〉氮磷比&关键词：石油A降解菌；筛选；复配菌群；正交实验；降解条件中图分类号：X172文献标识码:A文章编号：16725425(2020) 1205504ScreeningandCompoundingofHighE f icientPetroleum Hydrocarbon-DegradingBacteriaandOptimizationinDegradationConditionsDUAN Weichao1,YANG Zequn2,LIU Qiyou2(1.Qingdao Oasis Environmental&Safety Technology Co..Ltd.,Qingdao266555,China；2.China University of P e troleum(East China%,Qingdao266555,Cina)Abstract:Based on the composition of crude oil,we selected the model substances,and screened the high efficient degradation strains against each model substance from the petroleum hydrocarbon-degrading strains(S1, S2,S3,S4,S5,and S6)preserved in the laboratory.Moreover,we optimized the compounding of high efficient degradationstrainsanddeterminedtheoptimaldegradationconditionsofthecompoundbacteriabyorthogonal experiments.TheresultsshowthatstrainsS2andS5havethebestdegradatione f ecton monocyclicaromatic hydrocarbons(toluene)strainsS1andS6havethebestdegradatione f ectonpolycyclicaromatichydrocarbons (phenanthrene)andstrainS4hasthebestdegradatione f ectonlong-chainalkanes(para f in wax).Thecom-poundbacteriaofS1!S2andS4havethebestdegradatione f ectoncrudeoilandthebestdegradationcondi-tions are determined as follows：the pH value of7,the substrate concentration of0.4g•L-1,the N/P ratio of7 :1,the inoculum amount of1mL,and the temperature of30b.The effects of various factors on the degrada-Oion raOe of crude oil are inOhe fo l owing order:pH value%OemperaOure%subsOraOe concenOra ion%inoculum a-mounO%N/PraOio.Keywords：petroleum hydrocarbon-degrading bacterium；screening；compound bacteria；orthogonal experiment；degradation condition收稿日期2020-09-08作者简介：段潍超（1991—"，男，山东济南人，工程师，研究方向：土壤污染调查与修复，E-mail：dwc8023@foxmai1com&「段潍超，等：石油怪高效降解菌的筛选、复配及降解条件优化/2020年第12期石油是目前人类使用最为广泛的能源之一，但在开采、储运、炼制及加工过程中，石油因事故、泄漏或排污等不可避免的会进入水体和土壤中，从而污染生态环境(13)。
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
从活性污泥中分离到1株苯酚高效降解细菌,初步确定为假单胞菌属(Pseudomonas);该菌株能在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中生长;可以在20～40 ℃、pH值5.0～9.0范围内较好生长;降解苯酚最适温度为35℃,最适pH值为7.0,最大降解率达到89%.完全降解无机盐培养基中500mg/L、1 000mg/L、1 200mg/L的苯酚分别需要60h、72h、108h.
作者：刘广金张袖丽作者单位：安徽农业大学应用化学系,安徽合肥,230036 刊名：现代农业科技英文刊名：XIANDAI NONGYE KEJI 年，卷(期)：2007 ""(11) 分类号：X7 关键词：苯酚生物降解假单胞菌属。
三株DBP降解菌的筛选及其降解特性的相关研究的开题报告一、选题背景随着化学品的广泛应用以及工业化进程不断加快，工业废弃物的处理日渐受到社会的关注。
其中，含有邻苯二甲酸酯（DBP）类化合物的废水成为了焦点之一。
邻苯二甲酸酯是一种常见的塑料增塑剂，易溶于水，对环境的危害性非常大。
因此，寻找一种生物降解DBP的方法，对环境保护和资源化利用具有重要的意义。
二、选题意义目前，高效降解DBP的微生物菌株还比较罕见，因此需要通过菌群筛选，寻找到高效降解DBP的菌株。
通过对菌群进行分离和筛选，可以找到高效降解DBP的菌株，并对其降解特性进行研究，为工业废水治理提供更加可行的方案。
三、研究内容本次研究将从环境样品中分离筛选出具有降解能力的微生物菌株，并对其进行16S rDNA序列分析，确定其分类学位置。
随后，对菌株的生理生化特性、生长条件和降解特性等方面进行研究，探究其对DBP的降解机理并构建相应的降解途径。
四、研究方法1.样品采集：采集不同环境样品，如土壤、水样、废水等样品。
2.菌群筛选：将采集的环境样品进行分离筛选，筛选出具有高效降解DBP功能的微生物菌株。
3.分子生物学检测：通过16S rDNA序列分析，确定菌株的分类学位置。
4.菌株降解特性研究：对菌株的生理生化特性、生长条件和DBP的降解特性等方面进行研究，并构建相应的降解途径。
5.降解效果验证：通过实验验证新筛选出的菌株对DBP的降解效果，加速其应用进程。
五、研究预期成果1.成功筛选出三株高效降解DBP的微生物菌株。
2.构建三株菌株的降解途径，并探究其降解机制。
3.通过实验验证三株菌株的降解效果，并比较其降解效率和适用范围。
4.为废水处理和环境保护提供更加可行的解决方案。
六、研究进度安排1.样品采集：2个月。
2.菌群筛选：3个月。
3.分子生物学检测：2个月。
4.菌株降解特性研究：6个月。
5.降解效果验证：3个月。
6.写作撰写：2个月。
七、研究团队本研究计划由化学工程专业博士生负责，兼顾生物学和化学专业的教授作为指导老师进行指导，实验室技术人员提供技术支持。
环境污染物降解菌的筛选及其应用研究随着现代工业的发展，环境污染成为一个日益严重的问题。
这些污染物对人类的健康和环境的生态稳定造成了极大的威胁。
因此，降解环境污染物成为了一个紧迫的任务，其中环境污染物降解菌的筛选和应用研究就成为了重要的研究内容。
本文将对环境污染物降解菌的筛选及其应用研究进行探讨。
一、环境污染物降解菌的筛选环境污染物降解菌是一类具有特殊代谢功能的微生物，可以通过吸收、转化、分解、利用污染物质来减低或消除环境中的有害物质。
这些菌株广泛存在于自然界中，如土壤、水体和沉积物中等，有些甚至可以从污染源中分离出来。
由于不同的环境污染物的成分和性质有很大的差异，因此不同的菌株对不同的污染物物质有不同的反应。
因此，对于寻找适合的菌株进行分解就成为了一个挑战。
环境污染物降解菌的筛选主要包括两个方面，一是从自然界中筛选具有降解能力的菌株，二是通过基因工程技术筛选出具有特定降解功能的菌株。
从自然界中寻找环境污染物降解菌的方法主要有三种。
一是通过样品分离的方法，即通过从污染土壤、废水或纯化有机物中分离到具有降解能力的微生物。
二是直接从污染源中获取菌株，如从工厂废水中分离、从油窑或石油泄漏现场中分离。
三是通过对自然界中微生物的特性进行鉴定，如首先寻找具有易生长、菌落明显、降解速率快的菌株，再对其进行鉴定，筛选出具有特殊降解能力的菌株。
基因工程技术是一种快速而高效的筛选途径，可以通过获得污染物分解途径中的降解酶基因、浓度可感应表达系统或高效表达系统等，将其转移到其他微生物中，以构建特定降解菌株。
这种筛选方法最大的优点是可以针对特定的污染物进行定制，从而出现对多污染物的同时降解的菌株。
二、环境污染物降解菌的应用研究环境污染物降解菌的应用研究主要包括两个方面，一是菌株应用的基础研究，二是菌株应用的实际情况。
基础研究主要包括对降解菌株的鉴定和评估、降解途径的研究、降解产物的分析及对菌株生长环境的优化等。
这些研究对环境污染物治理及其监测有很大的实际意义。
一株石油烃降解菌的筛选及其影响因素的研究发布时间：2022-12-04T02:39:13.821Z 来源：《城镇建设》2022年第14期7月作者：支良材[导读] 生物修复技术的主要原理是利用微生物以及其他生物的的降解、吸收及转化等能力将土壤中的石油污染物转化成二氧化碳、有机物、水等对环境无害的物质，从而达到修复土壤的效果支良材62010219820625****一、生物修复技术的基本原理、方法及应用生物修复技术的主要原理是利用微生物以及其他生物的的降解、吸收及转化等能力将土壤中的石油污染物转化成二氧化碳、有机物、水等对环境无害的物质，从而达到修复土壤的效果。
生物修复较传统的物理化学治理方法有很大优势，前两种虽然也可达到修复土壤的效果，但是效果较差、成本较高，易造成其他方面的环境污染，适用于污染区域较小而且污染程度高，不适合大范围的推广应用。
相比之下，生物修复技术的优势显著，有广泛的应用前景。
生物修复技术主要广义的生物修复技术分为植物修复、动物修复、微生物修复、混合修复技术与异位生物修复技术这几种类型。
二、生物修复技术的应用（一）植物修复技术通过某些植物的生长过程中吸附土壤中的重金属与污染物，从而使得土壤中的有害物质减少，持久性较强。
但是植物的生长周期较长，也需要土壤提供植物生长所需的养分，适合土壤中污染物质浓度较低、污染量较少的情形。
（二）动物修复技术土壤中存在蚯蚓、土著动物等可以改善土壤的质量，增强土壤的肥力，对土壤中的有害物质进行吸收、转化。
（三）微生物修复技术通过人工接种培养的菌落对土壤中的有害物质进行有效的吸附于降解，降低污染物的危害，从而使得土壤的性能得到提升。
本实验针对大庆的石油污染土壤，通过富集驯化培养，分离纯化出几种菌种处理油污土壤，由于该油污土壤中含有该大量的微生物存在，会对设备造成腐蚀和损坏，管道及注水井的堵塞，因此要考虑防腐。
但这也給采用生物技术修复油污土壤带来了新的难题，因此筛选出具有反硝化性的石油降解菌尤为重要。
柴油高效降解菌株筛选及降解特性研究 岳贵龙;陈亮;刘娜 【摘 要】采用梯度富集培养、稀释涂布从受石油污染的样品中,分离得到柴油降解菌株10株,其中菌株YR2柴油降解率最高,在含柴油1％(w/v)的无机盐液体培养基中培养7d,降解率达到92.8％,在2％、4％、5％的柴油浓度下降解率分别为60.8％、53.5％、41.0％.综合菌株形态特征观察、生理生化特性分析和16S rDNA序列比对,菌株YR2应为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa).菌株YR2具有较好的细胞表面疏水性、乳化性能和排油性能.薄层层析结果表明菌株YR2分泌糖脂类表面活性剂.菌株YR2具有高效的柴油降解能力,有望应用于柴油污染的微生物修复.
【期刊名称】《生物技术通报》 【年(卷),期】2014(000)001 【总页数】5页(P161-165) 【关键词】柴油;假单胞菌;糖脂;细胞表面疏水性;微生物降解 【作 者】岳贵龙;陈亮;刘娜 【作者单位】河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001
【正文语种】中 文 柴油污染对土壤和水体环境威胁巨大，具有致癌、致畸、致突变等危害，直接影响到生态系统平衡和人体健康。常规物理化学方法处理柴油污染物，能耗和处理成本高，易对环境造成二次污染。而采用微生物降解的方法处理柴油污染物具有明显的优势［1］。 国内外已有研究证明柴油污染微生物修复技术的基础和关键是筛选高效的柴油降解微生物。但是，目前柴油降解菌株大多是在柴油浓度1%或者更低浓度下分离筛选得到的［2-5］，而实际污染物中柴油浓度远远高于1%。低浓度柴油下筛选得到的降解菌株在实际应用中柴油降解效果欠佳。 本文从受石油污染的样品中通过梯度富集培养分离筛选高浓度柴油降解菌株，并对降解菌株的乳化性能、排油性能和细胞表面疏水性进行研究，以期为柴油污染微生物修复提供菌株和参考。 1.1 材料 1.1.1 样品 中原油田、南阳油田、普光油气田等 地受石油污染土壤以及油基钻屑。 1.1.2 培养基 无机盐液体培养基：NH4NO32 g，K2HPO41.5 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，无水氯化钙 0.01 g，Na2EDTA·2H2O 0.01 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2-7.4。 油平板培养基：无机盐液体培养基1 000 mL，柴油10 mL，琼脂18 g。 牛肉膏蛋白胨固体培养基［6］（NA培养基）。 1.2 方法 1.2.1 梯度富集培养 取样品10 g加入到100 mL含柴油1%（w/v）的无机盐液体培养基中，于30℃、170 r/min富集培养5 d后，以5%的接种量接入到柴油浓度2%的无机盐液体培养基继续富集培养5 d，然后依次转入到柴油浓度3%、4%、5%的无机盐液体培养基进行富集培养。取培养液在固体油平板上进行稀释涂布，挑取生长迅速的菌落进行划线分离纯化，保存备用。 1.2.2 柴油降解率测定 将菌株活化培养液以5%（v/v）的接种量接入不同柴油浓度的无机盐液体培养基中，于30℃、170 r/min下培养7 d后，采用重量法［7］测定柴油降解率，以不接菌的培养液作为空白对照，每个试验重复3次。降解率计算公式如下： 降解率（%）=W0-W1/W0×100% W0是对照组残油质量（g），W1是试验组残油质量（g）。 1.2.3 柴油降解菌株鉴定 参照《常见细菌系统鉴定手册》［8］进行菌株形态特征观察和生理生化特性分析。菌株形态特征观察包括菌落形态观察、结晶紫染色、革兰氏染色，生理生化特性分析包括需氧性试验、葡萄糖发酵试验、运动性试验、氧化酶试验、硝酸盐还原试验、甲基红试验、V-P试验、吲哚试验等。 菌株16S rDNA序列比对参照文献［9］进行。使用细菌基因组提取试剂盒（北京鼎国）提取菌株基因组DNA，以细菌16S rDNA扩增通用引物27F和1492R进行PCR扩增，PCR产物经电泳检测后送样测序。 1.2.4 菌株降解特性 1.2.4.1 乳化性能 菌株于柴油无机盐液体培养基培养5 d后，于12 000 r/min离心20 min，收集发酵上清液，于带刻度试管中加入等体积的发酵上清液和柴油，充分振荡5 min后静置24 h，观察并记录乳化层高度和稳定性，计算乳化指数（EI）［10］。以未接种的培养液作为空白对照。 1.2.4.2 排油性能 发酵液排油性能以排油圈直径计，采用排油圈法［10］测定。 1.2.4.3 表面活性物质分析 发酵液表面活性物质分析采用薄层层析法。将等体积的发酵上清液和萃取液（氯仿∶甲醇=2∶1）混合，充分振荡后取样进行薄层层析，展开后用苯酚硫酸试剂显色。 1.2.4.4 菌体细胞表面疏水性 细胞表面疏水性以细胞表面疏水率计，测定采用Rosenberg测定方法的改进方法［11］。菌株于柴油无机盐液体培养基培养5 d，离心后重悬于灭菌的无机盐液体培养基中，取悬浮液1.5 mL调节OD600至0.5，加入200 μL柴油涡旋3 min，静置待水相和油相分层后，记录悬浮液OD600的变化。以无机盐液体培养基为空白对照，每个试验重复3次。细胞表面疏水率计算公式如下： 细胞表面疏水率（%）=（1-Ac/A0）×100% Ac和A0分别是振荡后悬浮液的吸光值和振荡前悬浮液的吸光值。 2.1 柴油降解菌株筛选 经富集培养后分离纯化得到能以柴油作为唯一碳源的细菌10株，其中菌株YR2降解效果最好。分别在柴油浓度1%、2%、4%、5%的无机盐液体培养基培养7 d后，降解率分别为92.8%、60.8%、53.5%、41.0%。 2.2 菌株鉴定 如图1所示，菌株YR2在NA平板上菌落黄色微绿、不透明，菌落表面有褶皱、边缘裂纹，产黄 绿色色素；细胞短杆状，单个或成对出现，革兰氏阴性，无芽孢；菌株YR2需氧生长，利用葡萄糖产酸不产气，运动性、氧化酶试验、硝酸盐还原为阳性，甲基红试验、V-P试验、吲哚试验为阴性，菌株YR2生理生化特性与铜绿假单胞菌基本保持一致。 菌株YR2的16S rDNA序列（GeneBank登录号KF530279）经BLAST比对，发现与Pseudomonas aeruginosastrain S25（DQ095913） 和Pseudomonas aeruginosastrain D1（KF113578）的同源性均为99%，构建Neighbor-Joining系统发育树如图2所示。 综合菌株形态特征观察、生理生化特性分析和16S rDNA序列比对，菌株YR2为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。 2.3 菌株降解特性 2.3.1 乳化性能 如图3所示，菌株发酵液对等体积柴油的乳化效果明显，乳化指数高达75%，且静置24 h后乳化层仍然稳定，表明菌株YR2在生长代谢过程中分泌高效表面活性物质，有效增加了菌株菌体细胞与烃类物质的接触面积。 2.3.2 发酵液排油性能 向油膜中心滴加培养5 d后的发酵液，经测定排油圈直径为7.7 cm，表明菌株在发酵液中分泌有高效表面活性物质。 2.3.3 表面活性物质定性分析 薄层层析展开后经苯酚硫酸试剂显色，出现糖脂类物质的棕色斑点，Rf值0.67，与鼠李糖脂标准品Rf值接近，由此可初步判断菌株产糖脂类表面活性剂。 2.3.4 细胞表面疏水性 菌株YR2在柴油浓度为2%、4%、5%的无机盐液体培养基中培养5 d，细胞表面疏水率分别为54.1%、54.3%、66.4%，说明菌株具有良好的细胞表面疏水性。 图4所示为菌株YR2细胞与油滴微粒的黏附现象。取菌株发酵液与美兰染液混合后于光学显微镜下进行观察，发现在油滴微粒周围吸附有大量的菌体细胞（菌体细胞蓝色、较小，油滴透明、较大）， 即在菌株分泌的表面活性物质作用下，疏水性油滴被分散为微粒进入水相，进而形成了油滴-菌体细胞-水的混合体系。 菌株YR2柴油降解能力明显高于国内外相关报道，详见表1。由表1可知，国内外目前关于柴油降解微生物菌株的研究大多在低浓度柴油（1%）下进行。高浓度柴油会对微生物细胞产生明显毒害作用以及形成的油膜会阻隔菌体细胞与外界环境的物质运输，导致微生物菌株不能良好地生长。本研究采用梯度富集培养筛选柴油降解菌株，提高了菌株对高浓度柴油的适应性。 菌株YR2在柴油浓度2%、4%、5%条件下，细胞表面疏水率分别为54.1%、54.3%、66.4%。即随着柴油浓度的升高，菌株YR2的细胞表面疏水率也随之升高，也说明菌株细胞经过富集培养后对于高浓度柴油具有较好的适应性。 现有研究显示，疏水性的烃类化合物由于其本身具有较高疏水性、固液分配系数，影响其与细菌细胞的黏附，只能通过非特定扩散机理并在疏水性最高的区域进入细胞内［16］。而良好的菌株细胞表面疏水性可以促进菌体细胞、疏水性油滴微粒的充分黏附，从而促进菌体细胞对烃类物质的摄取和降解。 菌体细胞表面疏水性高低将决定着烃类物质从胞外环境进入到胞内的难易［17］，因此，细胞表面疏水性越高，越有利于菌体细胞与烃类物质的黏附接触，进而促进菌株对烃类物质的降解［18］。那么，柴油降解菌株的选育过程中菌株细胞表面疏水性和降解率同样重要。 经梯度富集培养分离筛选得到一株高效柴油降解菌株YR2，经鉴定菌株应为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。 菌株YR2在1%、2%、4%、5%的柴油浓度下降解率分别为92.8%、60.8%、53.5%、41.0%。 菌株YR2对柴油乳化效果明显且稳定，菌株发酵液排油性能良好。菌株YR2具有较好的细胞表面疏水性，可分泌糖脂类表面活性物质。
【相关文献】 ［1］ 禄立彦, 邓超, 段作营, 等. 两株柴油降解菌的筛选和降解特性研究［J］. 工业微生物, 2012, 42（6）：14-20. ［2］ Lee M, Kim MK, Kwon MJ, et al. Effect of the synthesized mycolic acid on the biodegradation of diesel oil by Gordonia nitida strain LE31［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005, 100（4）：429-436. ［3］ 马晓焉, 陈德育, 段敏, 等. 柴油降解细菌的筛选及生长特性初探［J］. 西北农林科技大学学报, 2013, 41（6）：85-90. ［4］ Lee M, Woo SG, Ten LN. Characterization of novel diesel-degrading strains Acinetobacter haemolyticus MJ01 and Acinetobacter johnsonii MJ4 isolated from oil-contaminated soil［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28（5）：2057-2067. ［5］ Huang L, Ma T, Li D, et al. Optimization of nutrient component for diesel oil degradation by Rhodococcus erythropolis［J］. Marine Pollution Bulletin, 2008, 56（10）：
