一株既产表面活性剂又高效降解石油烃菌株的鉴定及降解效果

邻苯二甲酸二丁酯高效降解菌的分离、鉴定及降解特性杨统一;高俊贤;刘琦;连梓竹【摘要】从土壤中分离出1株能够以邻苯二甲酸二丁酯为碳源和能源生长的细菌XHYG.经形态观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列及系统发育分析,鉴定该菌株为无色杆菌(Achromobacter insolitus).对该菌株的降解条件进行优化,确定最佳降解条件为:温度30℃,pH =6.5 ～8.0.在最佳降解条件下,其在48 h内对400 mg/L DBP降解率达到90.67％,为邻苯二甲酸二丁酯的高效降解菌.底物降解广谱性试验表明,该菌株对邻苯二甲酸二辛脂(DOP)、邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP)都具有良好的降解能力,表明具备良好的底物降解广谱性,说明该菌株在处理邻苯二甲酸酯类化合物的污染治理中有独特的应用潜力.【期刊名称】《江苏科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(029)006【总页数】5页(P607-611)【关键词】邻苯二甲酸二丁酯;降解特性;生物降解;降解条件;16S rDNA【作者】杨统一;高俊贤;刘琦;连梓竹【作者单位】江苏科技大学环境与化学工程学院,江苏镇江212018;江苏科技大学环境与化学工程学院,江苏镇江212018;江苏科技大学环境与化学工程学院,江苏镇江212018;江苏科技大学环境与化学工程学院,江苏镇江212018【正文语种】中文【中图分类】X172邻苯二甲酸酯类(phthalic acid esters，PAEs)是一类重要的有机化合物，被广泛用作塑料助剂、油漆溶剂、合成橡胶增塑剂及化妆品、香味品、润滑剂等生产原料中［1］.然而，由于邻苯二甲酸酯增塑剂并非与树脂共价连接，因此极易扩散到环境中.目前，PAEs在环境中已到了普遍检出程度，包括在陆地生态系统及水域生态系统等都能检测到PAEs的存在［2］.近期研究表明，PAEs具有致畸性、致突变性、致癌性及生殖毒性，可在极低浓度下干扰人和动物的内分泌系统，导致其发育紊乱［3］.且在环境研究领域，邻苯二甲酸酯类被中国环境监测总站、美国国家环保局(EPA)和欧盟列为优先控制污染物［4］.PAEs在自然界中的降解分为生物降解和非生物降解两种，而微生物降解是其降解的主要途径［5］.目前国内外有关PAEs微生物降解的研究有很多［6-7］，如Delfia sp.［8］，Sphingomonsa sp.［9］，Arthrobacter sp.［10］，Paenibacillus sp.［11］等.但已报道的菌株能降解DBP且能降解多种邻苯二甲酸酯类化合物的还较少，因此有必要筛选高效广谱的DBP降解菌，丰富降解菌种类.本研究从镇江市江苏科技大学西校区垃圾处理站土样中分离到了1株能够高效降解邻苯二甲酸二丁酯的细菌，采用生理生化及16S rDNA序列分析等手段对该菌进行了鉴定，并研究其生长和降解特性，以期为PAEs污染物的治理及土壤修复提供一定的科学依据.1.1 实验材料实验土样取自镇江市江苏科技大学西校区垃圾处理站附近土壤.基础无机盐(MSM)培养基(g/L):K2HPO45.8，KH2PO44.5，(NH4)2SO42.0，MgCl20.16，CaCl20.02，Na2MoO4·2H2O 0.002 4，FeCl30.001 8，MnCl2·2H2O 0.001 5，pH=7.0，于121℃湿热灭菌20 min.固体培养基为含DBP的液体培养基加琼脂20 g/L.富集培养基(g/L):牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，pH=7.0，于121℃湿热灭菌20 min.主要试剂:邻苯二甲酸二丁酯(DBP，分析纯);邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯(DEHP，分析纯);邻苯二甲酸二辛脂(DOP，分析纯);环己烷(色谱级)，甲醇(色谱级).1.2 实验方法1.2.1 DBP降解菌的筛选与纯化称取10 g土壤样品，加入20 ml无菌水，剧烈振荡混合均匀后于4 000 r/min离心机中离心5 min，取上清液;接着重复此步骤2次，最后取上清液获得土壤溶液.取分别稀释100倍、1 000倍、10 000倍的土壤溶液，涂布在固体MSM培养基(含DBP 100 mg/L)于30℃培养箱内培养7 d.然后挑取筛选的菌落接种于含DBP 200 mg/L的液体MSM培养基，150 r/min、30℃ 的摇床培养7 d，再用划线法划线于固体MSM培养基(含DBP 200 mg/L)于30℃培养箱内培养7 d，进一步分离单菌落.重复上述两步并逐步提高培养基中DBP含量依次为200，250，300，350，400 mg/L.最后将分离出的单菌用富集培养基富集.1.2.2 菌株的生理生化鉴定降解菌株形态及生理生化特性鉴定参照常见细菌系统鉴定手册［12］等文献.1.2.3 菌株DNA的鉴定降解菌株分子生物学鉴定采用16S rDNA序列分析.首先提取分离的降解菌DNA作为模板，利用16S rDNA基因通用引物F27和R1492进行PCR扩增.其中，引物F27为5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，引物R1492为5’-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’.PCR扩增条件为:94℃预变性5 min;94℃变性40 s;55℃退火40 s;72℃延伸90 s，30个循环; 72℃最终延伸7 min，4℃保存.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序工作.将测序结果提交GenBank，获得序列号KM598778，并同GenBank数据库中的基因序列进行BLAST比对，以获得相似性较高的相关菌株，采用MEGA6.0软件进行多序列比对，并构建系统进化树.1.2.4 溶液中PAEs的含量测定采用高效液相色谱法检测溶液中PAEs，具体处理方法如下:待测溶液于超声波振荡器中振荡10 min后取10 ml加入20 ml环己烷，剧烈振荡后放入超声波振荡器中振荡5 min，后倒入离心管在高速离心机(5 000 r/min)中离心分离取上层有机相，再用孔径为0.22 μm的有机相过滤器过滤后上机测定.高效液相色谱条件:色谱柱为5μm Eclipse XDB-C18柱;流动相为甲醇∶水=90∶10;检测器波长为228 nm;柱温为35℃;柱压为15 bar;流速0.5 mL/min;进样量为10 μL;保留时间为11 min.1.2.5 生物量测定方法测定菌株的生物量，采用721型可见分光光度计在600 nm处测量培养基的光密度OD600.1.3 降解菌底物广谱性测试在基础无机盐培养基中分别加入邻苯二甲酸二辛脂(400 mg/L);邻苯二甲酸(2-乙基已基)酯(400 mg/L)于121℃湿热灭菌20 min.以2%的接种量将降解菌种子液接种到100 mLMSM中，160 r/min、30℃摇床培养.培养5 d后取样，用高效液相色谱法测定不同邻苯二甲酸酯的残留量.1.4 菌株的降解特性研究1.4.1 降解菌对DBP的降解曲线及生长曲线将菌液离心分离获取菌体，再用MSM培养基重悬，调整菌液浓度OD600=1.0.然后将上述菌液1 ml接种到液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L) 25 ml中，在150 r/min、30℃ 的摇床培养，并设置一组液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L)不加入菌液作为对照.每24 h定时取样用高效液相色谱法测定其中DBP的含量，并测定其OD600值.1.4.2 DBP高效降解菌的降解条件优化1)温度将菌株的菌液离心分离获取菌体，再用MSM培养基重悬，调整菌液浓度OD600=1.0.然后取上述菌液5份，每份1 ml分别接种到液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L)25 ml中，在150 r/min、温度分别为25，30，35，40，45℃ 的摇床培养5 d，并设置一组液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L)不加入菌液作为对照.用高效液相色谱法测定其中DBP的含量.2)pH将菌株的菌液离心分离获取菌体，再用MSM培养基重悬，调整菌液浓度OD600=1.0.然后取上述菌液5份，每份1 ml分别接种到液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L)25 ml中，将5份培养基pH分别调整为6.0，7.0，8.0，9.0，10.0在150 r/min、30℃ 的摇床培养5 d，并设置一组液体MSM培养基(DBP含量为400 mg/L)不加入菌液作为对照.用高效液相色谱法测定其中DBP的含量. 2.1 菌株XHYG的分离及部分生理生化特征经过富集培养，分离得到1株能够在DBP含量为400 mg/L的MSM培养基中很好生长的降解菌，此菌株能以DBP为唯一碳源很好地生长，将其命名为XHYG.XHYG菌株在MSM平板上于30℃恒温培养箱中培养5 d后，菌落呈圆形，不透明，黄色，中央部分突起，边缘部分光滑，质地致密且有光泽，不含水溶性色素，在显微镜下观察为球状.生理生化测试发现，菌株XHYG为革兰氏阴性菌，接触酶呈阳性反应，淀粉水解酶呈阴性反应，不产硫化氢气体，明胶液化反应、甲基红反应均呈阴性反应，能够发酵葡萄糖(详见表1).2.2 降解菌底物广谱性测试接种5 d后观察菌株XHYG都能很好地利用DOP和DEHP，根据图1所示，菌株XHYG对DOP的降解较DEHP要好.这与文献［13］中邻苯二甲酸脂类的生物降解效果与碳链长度和复杂程度呈反比相一致.2.3 菌株XHYG的16S rDNA分子鉴定与系统发育分析测序结果提交 GenBank的登录号为KM598778.在GenBank中进行BLAST比对分析，结果发现与菌株XHYG的16S rDNA序列相似性最高的是Achromobacter insolitus，其相似性达到99%.结合其形态学和生理生化特征，可以初步确定XHYG为无色杆菌(Achromobacter insolitus).选取部分文献报道的PAEs降解菌，用MEGA 6.0软件包构建系统发育树(图2)，对比降解菌的系统进化关系.由图2可以看出，文中筛选的XHYG菌株与无色杆菌(Achromobacter insolitus)处于同一分支，具有相同的进化距离，因而更进一步说明菌株XHYG为无色杆菌属.从图2还可看出，部分PAEs降解菌与XHYG菌株进化距离较远，说明PAEs降解基因广泛分布在不同种属.2.4 菌株XHYG的生长曲线和降解曲线菌株XHYG的生长和降解曲线如图3.由图3可以看出，在0～1 d时，菌株XHYG生长缓慢，DBP的降解率较低，培养基呈现淡淡的乳白色;菌株在1～3 d为迟滞期;3～5 d为对数生长期;5 d后进入平衡期;从降解曲线上来看，菌株在48 h时对400 mg/L DBP降解率达到90.67%，在3～6 d，菌株XHYG以DBP为唯一碳源和能源迅速繁殖生长，在培养基底部逐渐产生灰白色悬浮颗粒物即菌体，而DBP也被大量降解，培养基颜色逐渐澄清;在5～6 d时期，菌株的生长进入平衡期，其OD600稳定在1.2左右，菌株的生长量逐渐达到最大值，DBP的残留量仅为4.09 mg/L，降解率达到98.99%.因此，确认菌株XHYG为DBP的高效降解菌.2.5 温度对菌株XHYG降解DBP的影响由图4看出，菌株XHYG对DBP的降解效果先随温度的升高而升高，达到最大值后，随着温度的升高而降低，菌株XHYG的最适生长温度为30℃，在温度超过35℃后降解活性大大降低.由此表明，温度过高或过低都会使菌株XHYG的生长受到抑制，降解活性降低.这与文献［11］的研究结果一致.这可能由于当温度过低时，菌体内酶的活性在低温下大大降低，导致菌株对DBP的降解效率降低;当温度过高时酶活性失活导致降解效率降低.2.6 pH对菌株XHYG降解DBP的影响由图5可以看出菌株XHYG的最适生长pH值在6.5～8.0左右，菌株的降解率能达到85%以上，而当pH值过低或者过高时菌株的生长均受到抑制，降解活性降低.由此表明，中性环境更利于这株菌株对DBP的降解.这与文献［16］分离出的HS-B1菌株相似，该菌株被鉴定为不动杆菌(Acinetobacter sp.)，当pH＞8.0，菌株的降解效率大大降低.1)从土壤中分离得到了一株能够以DBP为碳源和能源生长的细菌XHYG，经过形态学特征、生理生化特征和16S rDNA序列系统学分析，初步鉴定该菌株为无色杆菌(Achromobacter insolitus).2)XHYG生长和降解DBP的最佳培养条件为:温度30℃，pH 7.0;在此条件下，菌株迅速利用DBP作为碳源和能源进行生长，能够在DBP浓度为400 mg·L-1的无机盐培养基中生长良好，有较高的耐受性和降解效率.【相关文献】［1］Blount B C，Milgram K E，Silva M J，et al.Quantitative detection of eight phthalate metabolites in human urine usingHPLC-APCI-MS/MS［J］.Analytical Chemistry，2000，72(17):4127-4134.［2］Zolfaghari M，Drogui P，Seyhi B，et al.Occurrence，fate and effects of Di(2-ethylhexyl)phthalate in wastewater treatment plants:a review［J］.Environmental Pollution，2014，194:281-293.［3］Gu J D，Li J，Wang Y.Biochemical pathway and degradation of phthalate esterisomers by bacteria［J］.Water Science Technology，2005，52(8):241-248.［4］骆祝华，黄翔玲，叶德赞.环境内分泌干扰物:邻苯二甲酸酯的生物降解研究进展［J］.应用与环境生物学报，2008，14(6):890-897.Luo Zhuhua，Huang Xiangling，Ye Dezan.Advances in research of biodegradation of environmental endocrine disruptors-phthalate esters ［J］.Chinese Journal of Applied＆Environmental Biology，2008，14(6): 890-897.(in Chinese)［5］Staples C A，Peterson RT.F.The environmental fate of phthalate esters:a literature review［J］.Chemosphere，1997，35(4):667-749.［6］Fang C，Long Y，Shen D.Removal of dibutyl phthalate from refuse from different phases of landfill in the presence of its dominant bacterial strains［J］.Ecological Engineering，2014，71:87-93.［7］Fang C，Yao J，Zheng Y，et al.Dibutyl phthalate degradation by Enterobacter sp.T5 isolated from municipal solid waste in landfill bioreactor［J］.International Biodeterioration＆Biodegradation，2010，64(6):442-446.［8］刘洋，马保华，王兆梅，等.食品塑料包装中邻苯二甲酸酯类增塑剂的调查分析［J］.现代食品科技，2013，29(1):181-185.Liu Yang，Ma Baohua，Wang Zhaomei，et al.Investigation of phthalates contamination in the market-sold plastic food packages［J］.Modern Food Science and Technology，2013，29(1):181-185.(in Chinese)［9］周洪波，胡培磊，刘飞飞，等.DBP降解菌株XJ1的分离鉴定及其降解特性［J］.生物技术，2008，18 (2):64-67.Zhou Hongbo，Hu Peilei，Liu Feifei，et al.Isolation and identification of DBP-degrading strain XJ1 and its degradation characters［J］.Biotechnology，2008，18 (2):64-67.(in Chinese)［10］Jin D C，Liang R X，Dai Q Y，et al.Biodegradation of di-n-butyl phthalate by Rhodococcus sp.JDC-11 and molecular detection of 3，4-phthalate dioxygenase gene ［J］.Journal of Microbiol Biotechnol，2010，20 (10):1440-1445.［11］金雷，陈瑜，严忠雍，等.邻苯二甲酸二丁酯高效降解菌H-2的分离鉴定及其降解特性［J］.食品科学，2014，35(15):202-206.Jin Lei，Chen Yu，Yan Zhongyong，et al.Isolation and identifi cation of a di-n-butyl phthalate(DBP)-degrading strain H-2 and its degradation characteristics［J］.Food Science，2014，35(15):202-206.(in Chinese) ［12］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京:科学出版社，2001.［13］Chang B V，Yang C M，Cheng C H，et al.Biodegradation of phthalate esters by two bacteria strains［J］.Chemosphere，2004，55(4):533-538.［14］吴学玲，金德才，赵维良，等.4株邻苯二甲酸二丁酯降解菌的分离鉴定及其相关降解基因的克隆［J］.环境科学，2009，30(9):2722-2727.Wu Xueling，Jin Decai，Zhao Weiliang，et al.Isolation and identification of four DBP-degrading strains and molecular cloning of the degradation genes［J］.Environmental Science，2009，30(9):2722-2727.(in Chinese) ［15］金雷，严忠雍，施慧，等.邻苯二甲酸二丁酯DBP降解菌S-3的分离、鉴定及其代谢途径的初步研究［J］.农业生物技术学报，2014，22(1):101-108.Jin Lei，Yan Zhongyong，Shi Hui，et al.Identification of a dibutyl phthalate(DBP)-degrading strain S-3 and preliminary studies on the metabolicpathway［J］.Journal of Agricultural Biotechnology，2014，22(1): 101-108.(in Chinese)［16］陈湖星，杨雪，张凯，等.1株高效BBP降解菌的分离与特性研究［J］.环境科学，2013，34(7):2882-2888.Chen Huxing，Yang Xue，Zhang Kai，et al.Isolation and characterization of a highly efficient BBP-degrading bacterium［J］.Environmental Science，2013，34(7): 2882-2888.(in Chinese)。

１ 实验材 料 ．
从扶余油 田东区采油，厂经常被含油废水浸 ｉ 泡 的土地 上选 取 了 ８处采 样 点 ， 去除 表层 ５ＣＩ ｌ 的 Ｙ 浮土 ， ５ ０ ｌ 之间， 在 ～１ Ｙ ＣＩ 使用经过高温灭菌 的铲 子取 土 ，装到 灭菌 的塑 料袋 中 ，封 口，一２ Ｏ℃冷 冻保存 ，第二 天进 行分离 纯化 。
石 油 烃 降 解 菌 （ ｄｏａ ｏ Ｄ ｇａａｏ Ｈｙｒｃｒ ｎ ｅｒｄｔ ｎ ｂ ｉ Ｂ ｃ ｒ ，Ｈ ） ａｔ ｉ ｅ ａ ＤＢ 是能 将 石油 烃作 为 唯一 碳 源 进行
的筛选是是徽生物技术处理石油污染的关键 。 本文从抚余油田石油污染的土壤中筛选出一 株高效降解烃类化合物的微生物 ，并通过个体形 态 、菌 落形 态对 其进 行 了初步 鉴定 。
维普资讯
牛 态 环 境 ２ ０ ，６５： ３４ １９ ０ ７ ｌ（）１９ －３ ８
Ｅｃ ｏｇ ｎ Ｅｎ ｒ ｍ ｅ ｏｌ ｙ ａ ｄ ｖｉｏｎ ｎｔ
ｈｔ：ｗ ．ｅｃ． ｌ ｔ ／ ｗｗ ｅｓｉ Ｏｎ ｐ／ ｊ Ｃ Ｅｍａｌｅ ｉ ｒ ｅｓｉ ｏ － ｉ ｄｔ ＠ｊｅｃ． ｍ ： ｏ ｔ
物 群 落 的种属 组 成 【。 目前 在处 理 石油 污 染土 壤 ３ 』 时 ，所 选用 的微 生物 对污 染土 壤 中烃类 的降 解针 对性较差 ，降解率较低【 ７ Ｊ 。高效降解烃类徽生物
烷烃和芳香烃等 ，有些成分有致癌变 、 致突变 、 致 畸变作 用 ，并 能通过 食 物链 在动植 物及 人 体 内 富集 ，被列 为 重点 污染 物【。进 人环 境 中的石 油 ， ２ Ｊ 由于 生 物学 的和 某 些 非 生物 学 的机 制 （ 主要 是 光 化学 氧化 ）而逐 步 降解 【。大 量 研究 表 明 ，在 自 ２ Ｊ 然界净化石油烃类污染的综合因素中 ，天然微生 物的生物降解作用已成为消除环境中石油烃类污 染 的 主要机 制 【。 ｊ Ｊ

（2）pH值对菌株降解效率的影响：在pH值为7.0时，菌株X的降解效率最高， 达到60%以上。当pH值偏离7.0时，其降解效率明显下降。
（3）盐度对菌株降解效率的影响：在低盐度条件下，菌株X的降解效率较高。 随着盐度的增加，其降解效率逐渐降低。当盐度超过5%时，其降解效率显著下降。
（4）产物分析：利用GC-MS等技术，我们对菌株X降解石油烃的产物进行了 分析。结果显示，菌株X能够将石油烃主要降解为脂肪酸、酚类化合物等中间产 物。这些中间产物在进一步降解过程中转化为二氧化碳和水，从而实现石油烃的 生物修复。
2、筛选流程：首先，采集油污土壤和石油废水样品，进行富集培养；其次， 通过初筛和复筛，获得具有较强石油降解能力的菌株；最后，通过形态学和分子 生物学鉴定，确定菌株种类。
3、鉴定步骤：将筛选得到的菌株进行16S rDNA分子鉴定，利用细菌分类学 软件进行比对分析，最终确定菌株的种属。
4、石油降解特性分析：采用液体培养法测定菌株的石油降解能力，通过测 定不同时间点石油烃类物质的含量，计算菌株的降解速率和降解效率。
1、菌株筛选
从石油烃污染地区采集土壤样品，采用富集培养法，经过多步筛选，获得具 同温度、pH值、盐度等条件下，对菌株降解石油烃的能力进行测定。通 过改变环境因素，观察其对菌株降解效率的影响。同时，利用气相色谱-质谱联 用（GC-MS）等技术，对菌株降解的产物进行分析。
参考内容
一、引言
石油烃是石油和天然气的主要成分，它们在自然环境中的存在和降解对全球 碳循环和环境生态有着重要影响。厌氧降解菌在石油烃的降解过程中扮演着关键 角色。本次演示旨在筛选出具有高效石油烃厌氧降解能力的菌株，并对其降解特 性进行研究，以期为石油烃污染的生物修复提供理论依据。
二、材料与方法

收 稿 日期 ： ２ ０ １ ３ — ０ ２ — ２ ４
基金项 目： 辽 宁省 海 洋渔 业 科 技 项 目（ ２ ０ １ ｌ Ｏ １ ０ ） ； 辽 宁 省 科 技 计 划项 目（ ２ ０ １ １ ２ ０ ３ ０ ０ ５ ） 作者简介 ： 关 晓燕 （ １ ９ ８ ３ 一） ， 女， 辽 宁 营 口人 ， 辽 宁 省 海 洋 水 产 科 学研 究 院助 理 研 究 员 ．
第 ３ ６卷 第 ３期
２ ０ １ ３年 ９月
辽 宁 师 范 大 学 学报 （ 自然 科 学 版 ）
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｌｉ ａ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ Ｎｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ（ Ｎａ ｔ ｕ ｒ ａ １ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ）
度２ ５ ～３ Ｏ℃ ， ｐ Ｈ ７ ． ０ ～８ ． ０ ， 盐度 （ 体 积分 数） ３ ～３ ． ５ ， 转速 １ ５ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ． 在 最 佳 条件 下， Ｌ ＨＯＤ － ２对 ８ ０ ０ ｍｇ ／ Ｌ柴 油在 １ ２ ０ ｈ内 的降解 率达 到 ８ ５ （ 质量 分 数 ） ． 聚 氨 酯 泡沫 载体 具有 大孔 网状 结 构 ， 利于菌株生长和传质， 固定 化 菌 降解 柴 油 的速 率 明 显 高 于游
离菌．
关键词 ： 柴油； 埃 氏 号 ： Ｘ１ ７ ２ 文献标 志码 ： Ａ
海上 溢油 事故 的不 断发 生 、 海上 船舶 含 油废水 的排 放 以及 陆 源含 油废 水 通过 江 河 大量 输入 海 洋 ， 石油 烃 已成为 我 国近海 的主要 污染 物 ， 严 重 影响 了生态环 境［ １ ］ ． 近 年来 ， 国内外 很多 学者都 在努 力 寻求 安全、 经济 的方 法治 理溢 油污染 ． 生 物修 复技术 具有 成本低 、 效率 高 、 对 环境友 好 、 不 产生 二次污 染等 显 著 优点 ， 已经成 为一 种经 济效益 和 环境效 益俱 佳 的、 解决 复杂环境 污染 问题 的有效方 法 ］ ． 将 微 生物 固

海洋石油污染及微生物修复一、概述海洋石油污染已成为当今全球面临的重大环境问题之一。

随着工业化和城市化进程的加速，石油开采、运输和使用过程中的泄漏、排放和溢出事件屡见不鲜，给海洋生态系统带来了严重的影响。

石油污染不仅破坏了海洋生物的栖息地，还导致生物多样性减少，生态平衡失衡，甚至对人类的健康和安全构成威胁。

微生物修复技术作为一种环保、高效的治理手段，在海洋石油污染治理中发挥着越来越重要的作用。

微生物能够利用石油中的烃类化合物作为碳源和能源进行生长和代谢，将有害物质转化为无害物质，从而达到修复污染的目的。

微生物修复技术还具有成本低、操作简便、对环境影响小等优点，因此备受关注。

海洋石油污染及微生物修复技术仍面临诸多挑战。

海洋环境的复杂性和不确定性给微生物修复技术的实施带来了困难；另一方面，现有的微生物修复技术仍存在效率不高、稳定性不强等问题，需要进一步研究和改进。

加强对海洋石油污染及微生物修复技术的研究和探索，对于保护海洋生态环境、促进可持续发展具有重要意义。

1. 海洋石油污染问题的严重性海洋石油污染问题日益凸显，其严重性不容忽视。

石油污染主要来源于石油开采、运输、加工和使用过程中的泄漏和排放，这些污染物进入海洋环境后，对生态系统造成了严重破坏。

石油污染对海洋生物造成了直接伤害。

油污覆盖在海洋生物的表面，影响其呼吸和觅食，甚至直接导致死亡。

油污还会改变海洋生物的栖息环境，使其失去生存空间。

油污中的有害物质通过食物链传递，最终可能影响到人类的健康。

石油污染破坏了海洋生态平衡。

油污导致海洋生物的种群数量减少，生物多样性降低，进而影响到整个生态系统的稳定。

生态平衡一旦被破坏，恢复将需要漫长的时间，甚至可能无法完全恢复。

石油污染对海洋环境和人类活动造成了负面影响。

油污使得海水变得浑浊，影响了海洋景观和旅游业的发展。

油污还可能对海洋渔业资源造成长期影响，降低渔业产量和经济效益。

海洋石油污染问题的严重性不容忽视。

ＣＵ ｍ 。 Ｆ ／ Ｌ
Ｉ ２ ３柴油 降解 菌的 性 能 实验 ．．
将菌 悬液 按 ２ ％的接 种 量放入 两种 不 同无机 培养
本研 究 以柴 油 为 目标 污 染物 ，从油污 土 壤 中筛 选
出石 油烃 降解 菌 ，考 察菌 株 生长 、疏 水性 、产 表面 活
性剂 、脱氢 酶 活性 等 自身 降解 特 性 ，为该 菌株 在生 物 修复 的实 际应 用 中提供 依据 。
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８ ２７ 月 ・ ０ 年６ ０
油 气 田 环 境 保 护
治理技术与研究
石油 降解菌 的降解特 性研究
赵 敏 马宏 瑞
（． １ 陕西科技大学资源 与环境学 院；２ 南京大 学地球科 学系 ） ．
摘 要 以Ｏ ’ 柴油为唯一碳 源，对石油降解 菌Ｄ Ｐ Ｓ 菌的生长、疏水性、产表 面活性剂、脱氢酶活性及降解 能力进行研究。结果表明：Ｄ Ｐ Ｓ 菌在生长过程 中可产生糖脂类生物表 面活性剂，对石油烃的降解有很好的促进 作用， 其脱氢酶活性与降解率有较好的相关性。 当土壤 中柴油含量为Ｉ ％时， Ｏ 利用ＤＰ Ｓ 菌经过４ ｄ ０ 的处理（ ０℃， ３ ｐ值为６ ，油含量下降到Ｉ ８ ％，降解率最高可达６． ％。 Ｈ ） ．２ ５４ 关键词 微生物降解 疏水性 生物表面活性剂
广 泛进 展 ，但 很 多是对 外 界影 响因素 的研 究 。
１２ ２ 菌悬液 的制备 ．． 将 活 化 后 的 菌 液 在 ４０ ／ ｉ 条件 下 离心 １ ００ｒ ｍ ｎ ０ ｍ ｎ 去除 上 清 液 并用 Ｎ ｚＰ ａ ２０ 缓 冲 液 （． ｉ， ａ Ｏ—ＮＨＰ Ｈ ０２ ｍ ｌＬ Ｈ值为 ７０ 洗 涤 ２次 ，使 细胞 浓度 达 到 ｌ。 ｏ ／ ，ｐ ．） ０

状， 经过分 离、 筛选、 复筛 ， 从大港油 田的石油 污染土壤 中富集分 离、 选 出 ２株石 油降解 菌， 优 并进 一步研 究了 ２株 菌 的生理生化特性． 菌株鉴 定结果表明 ， 菌株 Ｄ — Ｂ ｌ属于假 单胞杆菌属 ， 菌株 Ｄ Ｆ一１ 于曲霉 菌属 ． 属 关键词 ： 石油 ；石油污染土壤 ； 石油 降解 菌 ； 分离鉴 中图分类号 ： ５ Ｘ３ 文献标识码 ： Ａ ｄ ｉ１ ．９ ９ｊｉ ｎ １７ －９ Ｘ．０ １ ０ ．２ ｏ ：０３ ６ ／．ｓ ．６ ３ ０５ ２ １ ．４ ０ １ ｓ
Ｋｅ ｒ ｓ ｅ ｒ ｌｕ ；ｐ ｔｏｅ ｍ— ｏｌ ｔ ｄ ｓ ｉ；ｐ ｔ ｌ ｕ ｄ ｇ ａ ａｉｎ ｓｒ ｉ ｓ ｓ ｌｔｏ ｎ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｙ ｗｏ ｄ ：ｐ ｔｏｅ ｍ ｅｒ ｌｕ ｐ ｌ ｅ ｏ ｌ ｅ ｒ ｅ ｍ— ｅ ｒｄ ｔ ｔ ｎ ；ｉ ａｉｎ ａ ｄ ｉ ｅ ｔ ｉａ ｉ ｕ ｏ ｏ ａ ｏ ｆ ｏ
耐盐 性实 验 培 养 基 ： 白胨 ２ ｇ 蒸 馏 水 １０ ０ 蛋 ， ０
各三支， 一支作为空 白对照 ， 其他 两支分别接人两株
供 试菌 ， 同对 照试 管均 放 于 ３ 连 ７℃ 恒温箱 中培养 ２ ４
ｈ 观察 试 管 内培养 液 的混浊程 度 ． ， ２ 生长 曲线 的绘 制 ： ） 采用 比浊 法 ．
基 ，ｂ 为加 入 菌 株 在摇 床 中培 养 ４天 后 的 培养 基 ， （） （） Ｃ 为加 入菌株 并 在摇 床 中培养 ７天 后 的培 养 基 ． 通
过 观察 不难 发 现 ， （ ） （ ） 培 养 基 逐 渐 浑 浊 ， 从 ａ到 Ｃ ， 并
液转入新鲜 的牛 肉膏蛋 白胨液体培养基 中， 在上 述
℃ 、６ ｍｉ 条件 下 培养 １ ． １０ｒ・ ｎ ０ｄ 培养 液 明显 浑浊 ，

的降解率均达 ８％。 ５ （） 菌 ： ２真 主要 包括 金色 担子 菌 属 、 丝 酵母 属 、 假 红 酵母属 、 掷孢 酵母属 、 曲霉属 、 毛霉 属 、 刀霉属 、 镰 青 霉属、 木霉属 、 孢霉属 等 。在 土壤环 境 中 ， 被 真菌 的种
２ 降解 石 油 烃 的微 生物 种 类
微 生物 降解 石油烃 类污染物 的研 究进展
赵 东宇
（ 门大学生命科学学 院， 厦 福建厦 门 ３ １０ ） ６ ０ ５
摘 要 ： 油作 为重要的能源之一 ， 石 在被 大量开采、 运输和使用的 同时， 带来 了严重的污染 。利用微 生物降解石 油烃类污染物 是 当前 治理石油污染最为理 想的有效方法。介绍 了降解石油烃的微 生物种类和 降解机理 ， 并分析 了固定化 、 表面活性剂 、 温条 低 件 等对降解过程的影响。 关键词 ： 油污染； 油降解 茵； 石 石 固定化 ； 面活性剂 ； 温 表 低
行 原位 修复 ， 柴油 、 滑油 和石 油 的总石 油烃 （Ｐ 润 ｒ Ｈ） ｒ
分属于细菌 、 真菌 、 放线菌 、 霉菌 、 酵母以及藻类 ， 它 们的细胞均含有改变了的脂肪酸组分和较多的核糖 体， 并常将烃类累积在细胞质膜上， 同时它们也能合 成较多的磷脂 …。 一般认为 ， 细菌更能有效地降解原
油， 其数 目最 多 ， 约有 ４ ０多个 属 ， 在生 态 系统 中 占据 首要 的地位 ［ 。 ２ ］ （ ） 菌 ： 括假 单胞 菌 属 、 １细 包 黄杆 菌属 、 状 杆 菌 棒
属、 无色杆菌属 、 节杆菌属 、 小球菌属 、 孤菌属等属的 某些菌株。其中最常见的是假单胞菌 ， 它对短链及长 链烷 烃 、 芳烃 均有 降解 能力 ， 而且 能彻底 降解烷 烃 。 ５ ］ Ｍ ｔ ｓａ ｙ ６ ｕ ｕｗ ｍ 等［ ｈ ］ 研究了芽孢杆菌（ａｉｕｓ． Ｏ １ ７ Ｂ ｃｌ ｐ） Ｓ — 、 ｌｓ Ｉ 棒杆菌（０ ａｆ ｕ ｓ．Ｂ Ｓ— 、 ｃ舢 ｃ 脚 ｐ） Ｐ ２ ６假单胞菌（ｓｕ ｅ Ｐ ｅ— ｄｍ ｎｓｐ） Ｐ ２ ５ ｏ ｏａ ．Ｈ Ｓ— 、假 单 胞 菌 （ｓｕｏ ｏａ ） ｓ Ｐｅｄｍ ｎｓｐ． ｓ Ｂ Ｓ — 等菌株对石油烃的降解效果 ， Ｐ ８ １ 结果显示石油烃

H4菌株对环己烷的降解性能刘莹;金文杰;丛冰冰【摘要】为了应对石油污染问题,研究获得高效降解石油烃菌株.分析高效降解菌株H4的降解性能,确定了H4菌株对环己烷的最佳降解条件,在环己烷初始质量浓度为2.49 g/L,培养温度为28℃,pH为6,液体培养基菌体浓度约为9×105个/mL,液体培养基体积为100 mL,摇床转速为120 r/min的条件下,环己烷96h的降解率为70.1％.【期刊名称】《辽宁科技大学学报》【年(卷),期】2014(037)003【总页数】4页(P235-238)【关键词】菌株H4;环己烷;高效降解【作者】刘莹;金文杰;丛冰冰【作者单位】辽宁科技大学化学工程学院,辽宁鞍山 114051;辽宁科技大学化学工程学院,辽宁鞍山 114051;喀左县环保局,辽宁朝阳 122300【正文语种】中文【中图分类】TM761环己烷是石油组成成分之一，因其具有低溶解性和潜在毒性而难于被微生物降解［1-2］。

目前，国内外对环己烷降解菌的研究鲜有报道。

1919年Tausz和Peter首次分离出一株能够利用环己烷的烃液化杆菌（Bacterium aliphaticumliquifaciens）［3］。

1974年Klerk和Van der Linden 用两株假单胞菌（Pseuaomonas spp.）降解环己烷，但是这两株菌并不能以环己烷为唯一碳源和能源［4］。

直至1977年一株诺卡氏菌（Nocardiasp.）被分离，它被认为是第一株以环己烷为唯一碳源和能源的菌株［5］。

中国首次报导是在1999年，由李大平分离的一株能以环己烷或环戊酮为唯一碳源的降解菌株［6］。

本文介绍筛选的一株优势菌株H4，经上海生工生物工程股份有限公司鉴定，菌株H4为克雷伯氏菌属，能够高效降解环己烷，对其生长状况及最适降解条件等进行了研究，可为降解石油烃污染提供一株有效菌种和一定的理论依据。

1 实验材料与方法实验筛选出一株能以环己烷为唯一碳源和能源的优势菌株H4。

高效石油降解菌株的筛选及菌群的构建徐志霞;张颖;金显敏;梁晨;李丹;金映虹【摘要】从海南澄迈油井周围污染的土壤中采集样品，以原油为唯一碳源，经初筛、复筛得到13株具降解石油性能的微生物，其中J-2、J-4、J-12、J-13菌株在培养10 d后，其石油降解率分别可达到27.92％、37.36％、30.98％和14.10％.选择这4株菌进行2株菌、3株菌、4株菌的混合培养，构建了11个降解石油的微生物体系，研究发现J-2与J-4混合菌群降解效果最好，高达71.58％，明显优于其他的混合菌群体系和单菌株的降解效果.根据形态学观察和生理生化特征对这4种菌株进行鉴定，初步确定为粉红头孢霉属（Cephaesosp），青霉属（Penicillium），链霉菌属（Streptomyces）和黄单胞菌属（Xanthomonas）.%Four strains of high efficient oil degrading which could take used of petroleum as sole carbon source were isolat⁃ed from Hainan Chengmai, and marked as No. J-2, J-4, J-12 and J-13. After incubation for ten days, every strain’s degra⁃dation rate of petroleum was 27.92%,37.36%, 30.98%, and 14.10%respectively. In the further exploration of mixed cul⁃ture of two bacteria, three bacteria or four bacteria, 11 microbial systems of degradation petroleum had been built. The re⁃sults showedthat the degradation rate of system No. J-2 and J-4 could reach 71.58%, which had the most efficient degrad⁃ing than any other systems or single strains in this study. These strains were preliminary identified as Cephaesosp, Penicilli⁃um, Streptomyces and Xanthomonas by physiology and biochemistry research.【期刊名称】《海南师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】4页(P421-424)【关键词】石油;高效降解;筛选;菌群构建【作者】徐志霞;张颖;金显敏;梁晨;李丹;金映虹【作者单位】海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158;海南师范大学生命科学学院，海南海口 571158【正文语种】中文【中图分类】Q939.9石油是含有各种芳香烃、烷烃、环烷烃成分的一种复杂混合物，是古代海洋或湖泊的生物经过漫长的演化而形成的一种化石燃料［1-2］.目前，石油及其提炼品（汽油、煤油、柴油等）在人类生产和生活中扮演着极其重要的角色，因此被人们称为“工业血液”［3］.当今能够替代石油的新型能源由于成本高等原因尚未能广泛应用，因此人们对石油的需求量仍然居高不下［4］.然而石油在开采、运输、装卸、加工和使用过程中，对环境造成严重污染，产生致癌物，污染土壤、地下水源、海洋环境等，危害人类健康.传统的石油污染治理方法主要为物理和化学方法，但其治理效果不佳，耗资巨大，并残余大量有毒物质于自然环境中，因此微生物修复技术（Bioremediation）以其经济、安全、效率高、适用范围广和无明显的二次污染等显著优点［5］越来越引起人们的关注.大多数未污染土壤的复杂微生物群落都含有天然降解石油的微生物，这种固有的特性使大多数土壤具有很大的石油降解能力［6］.大量的研究表明，在生物圈中，可以降解石油污染物的微生物超过100余属，200多个种，分属于霉菌、酵母菌、细菌、放线菌等［7］，其降解菌种类十分丰富，具有菌种的多样性.但是石油组成成分复杂，很难实现只靠一种微生物即可对其污染物实现完全降解.本研究通过对石油污染土壤样品进行筛选，得到4株高效石油降解菌株，根据形态学观察和生理生化特征初步鉴定为粉红头孢霉属（Cephaesosp）、青霉属（Penicillium）、链霉菌属（Streptomyces）和黄单胞菌属（Xanthomonas），并以此为基础进行石油降解微生物菌群的构建及研究，进一步提高降解效率，达到更高效降解石油的目的.1.1 材料1.1.1 实验材料原油及土样均采自海南澄迈油井.1.1.2 培养基原油培养基：NH4NO31.0g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl20.02g，Na2EDTA·2H2O 0.02g，FeCl30.05g，蒸馏水1000 mL，pH7.4，分装时每50 mL培养基加1 mL原油.固体平板培养需另外加入2%琼脂. 1.2 方法1.2.1 石油降解菌的富集培养和分离纯化［8］将5 g（干重）石油污染土壤接入45 mL原油培养基中，30℃，180 r/min恒温摇床上富集培养7 d.取培养液在原油平板培养基上进行划线分离，同时取适量菌液进行稀释，在原油平板培养基上涂布分离，将培养皿置于30℃培养箱中进行培养，定期观察.另外，将富集培养液按10%的比例接入新鲜的原油培养基中，相同条件下进行第二次富集培养，同样操作进行3次，每次的富集培养液都经过划线和平板稀释分离.3次富集培养之后，观察平板上长势良好的优势菌株，选取形态特征一致的单菌落，并分别接种于相应的牛肉膏蛋白胨培养基、查氏培养基、高氏Ⅰ号培养基、马铃薯培养基中，进行多次划线分离，纯化得到单菌后斜面保存.1.2.2 高效石油降解菌的筛选将分离纯化得到的具有降解石油能力的13株菌株，分别接种至含50 mL原油培养基的三角瓶中，接种量为1 mL，以不接种的原油培养基作空白对照组，30℃，180 r/min振荡培养10d.培养结束后采用重量法测定每株菌的石油降解率［9］.降解率=（m3-m2）/m1×100%m3为对照组的残余油量，m2为降解后的残余油量，m1为最初的含油量.1.2.3 高效石油降解体系的构建通过筛选得到4株高效石油降解菌，分别接种至含50 mL原油培养基的三角瓶中，30℃，180 r/min振荡培养24 h，制备一定浓度的菌悬液，接种于装用原油培养基的三角瓶（装液量50 mL/250 mL）中，每株菌接种量均为1 mL，30℃，180 r/min振荡培养10d.培养结束后测定每个微生物降解体系的降解率，选出较佳的降解体系.1.2.4 高效石油降解菌的初步鉴定根据菌株的形态特征和生理生化特征，参照伯杰氏细菌鉴定手册［10］、常见细菌系统鉴定手册［11］、常见真菌鉴定手册［12］，对分离得到的石油降解菌进行初步鉴定.2.1 石油降解菌的富集培养和分离纯化从海南省澄迈采集的石油污染土样通过原油培养基的3次富集培养后，挑选生长良好的优势菌株，分离纯化得到具有较好石油降解能力的细菌8株，霉菌4株及放线菌1株，共计13株菌株.2.2 高效石油降解菌的筛选将富集分离纯化得到的13株菌株，并分别接种于原油培养基中培养，与未接菌的空白对照组进行对比，观察培养液的颜色、混浊程度及分层现象等变化.培养前，培养液上下层呈黑褐色和乳黄色.培养后，培养液出现三种情况：图1-A，培养液分为3层，由上往下依次为残余石油油膜、褐色絮状物和浅褐色溶液；图1-B，培养液颜色澄清透明，分散着明显的真菌丝状菌落，菌体中间呈深褐色；图1-C，培养液无明显变化.进一步对13株菌进行石油降解率的测定（见表1），其中J-2、J-4、J-12、J-13编号的菌株降解率较高，分别为27.92%、37.36%、30.98%、14.10%，挑选这4株菌株用以构建降解菌群.2.3 石油降解菌的菌群构建将筛选获得的具有高效降解石油性能的菌株J-2、J-4、J-12、J-13进行不同的组合，分别2株菌、3株菌和4株菌混合，等比例接种培养，构建不同的微生物降解菌群，并检测其石油降解率，通过与单菌株的降解率比对，研究不同降解体系的降解效果（见表2）.根据表2的降解率可初步判断，不同菌株构成的降解菌群相对于单菌株而言，降解率有的升高，有的降低，这可能是由于不同菌株之间的相互作用导致的.其中由菌株J-2和J-4的混合降解组降解效果较其他组高，在装液量50 mL、石油浓度为2%的培养基中，10 d后其石油降解率可达到71.58%，较单菌株中降解效果最好的J-4的降解率提高近一倍.2.4 高效石油降解菌的初步鉴定对J-2、J-4、J-12、J-13进行鉴定，其菌落形态特征见表3，菌体形态见图2，可初步判断J-2、J-4为真菌，J-12为放线菌，J-13为细菌.其中，J-13的染色结果表明该菌为革兰氏阴性细菌.对J-12和J-13进行了生理生化特征试验，其结果见表4.根据上述实验结果，参照参照伯杰氏细菌鉴定手册［10］、常见细菌系统鉴定手册［11］、常见真菌鉴定手册［12］，初步鉴定J-2为粉红头孢霉属（Cephaesosp），J-4为青霉属（Penicillium），J-12为链霉菌属（Strepto⁃myces），J-13为黄单胞菌属（Xanthomonas）.随着国内外经济的发展，随着原油的开采量不断上升，由此引起的土壤及海洋石油污染日益加剧. 20世纪80年代末，美国在短时间内利用生物修复技术成功清除了油轮石油泄漏的污染物，开启了生物修复技术的研究，也引发石油污染微生物降解的讨论［13］.在本研究中以海南澄迈油井附近被石油污染的土壤为样品，利用石油为唯一碳源的培养基富集纯化得到的13株菌，经过筛选获取降解效果较好的4株菌，分别为J-2、J-4、J-12、J-13，在装液量50 mL、石油浓度为2%的培养基中，10d后其石油降解率可达到27.92%、37.36%、30.98%、14.10%.由于石油成分复杂，依靠单一的微生物无法彻底完成石油的降解，需要通过具有不同降解功能的微生物共同作用，才可能实现石油污染物的完全降解［14］.本研究对筛选得到的4株菌进行2株菌、3株菌、4株菌混合培养，构建了11个降解石油的微生物体系，通过与单菌株降解率比较，发现J-2与J-4混合菌群降解效果最好，可将降解率提高至71.58%，明显优于其他的微生物体系的降解效果.根据形态学观察和生理生化特征对这4种菌株进行鉴定，初步确定为粉红头孢霉属（Cephaesosp），青霉属（Penicillium），链霉菌属（Streptomyces）和黄单胞菌属（Xanthomonas）.本研究组将进一步研究培养温度、pH、盐度、时间等对菌株降解能力的影响，通过改变不同菌株在微生物系统中的比例构成，使微生物降解系统达到更好的降解效果.【相关文献】［1］张光宇.SBR工艺污水处理厂抗石油污染物冲击强化处理技术研究［D］.山东：青岛理工大学，2010.［2］陆昕.产表面活性剂石油降解菌的选育及对陕北石油污染土壤生物修复的试验研究［D］.陕西：西北大学，2010.［3］林标声，陈雪英，江胜滔，等.土壤中高效石油降解菌的筛选及其降解特征的研究［J］.福建师范大学福清分校学报，2010，98（2）：11-16.［4］张磊.中国石油安全分析与对策研究［D］.天津：天津大学，2007.［5］邵宗泽，许晔，马迎飞，等.2株海洋石油降解细菌的降解能力［J］.环境科学，2004，25（5）：133-137.［6］阮志勇.石油降解菌株的筛选、鉴定及其石油降解特性的初步研究［D］.北京：中国农业科学院，2006.［7］贾燕，伊华.石油降解菌株的筛选、初步鉴定及其特性研究［J］.暨南大学学报，2007，28（3）：296-301.［8］李超敏，王加宁，邱维忠，等.高效石油降解菌的分离鉴定及降解能力的研究［J］.生物技术，2007，17（4）：80-82.［9］张鹏.石油降解菌的分离、鉴定及降解特性的研究［D］.山东：山东师范大学，2006.［10］R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰.细菌鉴定手册（第八版）［M］.北京：科学出版社，1984：1037-1161.［11］东秀珠，蔡妙莫.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001：128-180. ［12］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科技出版社，1979：132-135；491-495.［13］刘晓春，阎光绪，郭绍辉，等.微生物降解土壤中石油污染物的研究进展［J］.污染防治技术，2007，20（6）：51-54.［14］李宝明，阮志勇，姜瑞波.石油降解菌的筛选、鉴定及菌群构建［J］.中国土壤与肥料，2007（3）：68-72.。

微生物表面活性剂对烃类污染物降解的促进作用*任春艳,聂麦茜,王 蕾,林立宁,董 湃(西安建筑科技大学环境与市政工程学院,陕西西安 710055)摘 要:从陕北油田受石油污染的土壤中筛选得到一株能利用葡萄糖作为惟一碳源的高效微生物表面活性剂产生菌株S5,提取得到其微生物表面活性剂纯品。

该生物表面活性剂可使表面张力降至32.81mN/m2,且具有良好的热稳定性和耐盐性。

同时研究该生物表面活性剂对烃类污染物生物降解的促进作用,结果表明,加入该生物表面活性剂可以使S5对柴油的降解率提高15.2%,S9对柴油的降解率提高21.2%;在多环芳烃的水相降解实验中,添加不同浓度的微生物表面活性剂对芘的降解均有明显促进作用,降解率最大可以提高53.57%;在修复石油污染土壤实验中,加入S5发酵液后,可以使 植物-微生物联合修复的效率提高22.5%。

关键词:微生物表面活性剂 烃类污染物 生物降解中图分类号:X172 文献标志码:A 文章编号:1674-0254(2009)04-0044-05 Enhance m ent of B iosurfactant for B iodegradati on of H ydrocarbonsREN Chunyan,N IE M aiq ian,WANG Le,i L IN L i n i n g,DONG Pai(Co llege o f Environment and M un i c i pal Eng i neeri ng,X i!an Un i versityof A rchitecture and Tec hno l ogy,X i!an710055,Chi na)Abstract:Scree n i ng fro m o il conta m i nated soil i n Sha nbei o ilfield,w e found a bacterial strai n S5which ca n use g l ucose as sole carbon source to produce eff i c i ently b i osurfactant.A fter extract i ng,w e obtai ned its pure b i osur factant.The b i osurfactant c ou l d reduce the surface tensi on to32.81mN/m2,and has bee n prove d hi gh endu-rance to heat a nd salt.Further more,the effects of the biosurfactant on hydrocarbons bi odegradat i on were i nvest igated,the results i ndicated that addi ng the biosurfactant the degradation r ate o f d i esel oil by S5coul d be m ipr oved by a bout15.2%,the de gradation r ate of diese l o il by S9could be m i proved by about21.2%;In thepo l ycyclic aro mat i c hydrocarbon aqueous phase degr adat i on of S5,t he degradation rates of pyrene could be pro moted by addi ng t he different concentrati ons o f bi osurfacta nt,the pyrene degradati on rate could be enhanced byabout53.57%;I n the b i ore m ediat i on o f oil-conta m inated soi,l add i ng the br oth o f S5,t he efficiency o f the plant-m icrobe assoc i ated bi ore mediation c oul d be enhanced by about22.5%.K eyW ords:biosurfactants,hydrocarbons,biodegradati on近年来烃类污染问题越来越受到关注,人们倾向于应用生物法修复烃类污染环境。

Ｎｏ ｓ ．２ Ｆｕ ｈｕｎ Ｐｅ ｒ ｌ ｕ ｆｎｅ ｙ． Ｔｈｅｍ ｏｒ ｏｌｇｙ ａ ｄ ｈｙｓｏｏｇ ｈ ｅ ｔ ｉ ｈｏ ｓｔ ｔｔ ｔａｉ ５ ｎｄ ＰＤ ５ ｌ ｎｇ ｔｏ ｅ ｍ Ｒｅ ｉ ｒ ｐｈ ｏ ｎ ｐ ｉ ｌ ｙ ｏｆｔ ｒ ｅｓ ａｎｓ ｓ ｗ ｈａ ｈｅｓ ｒ ｎ ＰＤ ａ １ ３ ｂｅｏ ｔ ｉｒ ｂ ｔｒ ｕｍ ， ｈ ｌ ｔ ｅ ｓ ｒ ｉ ｏ Ｍ ｃ ｏ ａｃ ｅ ｉ ｗ ｉｅ ｈ ｔａ ｎ ＰＤ５６ ｂｅｏ ｌｎｇｓ ｏ Ａ ｒｈｒ ｂ ｅ ． Ａ ｆｅ ｈｅ ｅ ｓ ｒ ｉ ｓ ｔ ｔ ｏ ａｔ ｒ ｔ ｒ ｔ ｓ ｔａ ｎ ｗａ ｃ ｔｖａ ｅ ｔ ８ Ｃ ｏｒ ７ ｈ， ｔ ｓ ｕｌｉ ｔ ｄ ａ ２ ｆ ２ ｈｅ ｂｏｄ ｇｒ ｄａ ｌ ａ ｉ ｆＰＤ５１， ＰＤ５３ ａ ｉ ｅ ａ ｂ ｅ ｒ ｔｏｓ ｏ ｎｄ ＰＤ５ ｆ ｔｏｌｕｍ ｙｄ ｏ ａ ｂｏ ｅ ｅ ７ ６３ ， ７ ．４７ ６ ｏｒｐｅ ｒ ｅ ｈ ｒ ｃ ｒ ｎ ｗ ｒ ６． ６ ａ ｄ ．１ ， ｒ ｓ ｃ ｉｅ ｙ ｎ ７６ ７ ｅ ｐｅ ｔｖ ｌ ．
Ｆｕｓ ｈｕｎ Ｌｉ ｎｉ ａｏ ｎｇ ３ １１ ００１， ． Ｒ． Ｃｈｉ ａ） Ｐ ｎ
ห้องสมุดไป่ตู้
Ｒｅ ｅ ｖ ｄ ｐｔｍ ｂ ｒ２０ ６；ｒ ｖ ｓ ｄ ｏ ｍｂ ｒ ２ ０６；ａｃ ｅ ｅ ２５ Ｎ ｏ ｅ ｅ ００ ｃ ｉ ｅ ５ Ｓｅ ｅ ｅ ０ ｅ ｉｅ ２３ Ｎ ｖｅ ｅ ０ ｃ ｐｔ ｄ ｖ ｍｂ ｒ ２ ６
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η=
C0和Cx分别为对照试样和接种菌试样中残余石油烃质量浓度，mg/L。
12.生物菌剂对石油污染土壤生物修复作用的研究黄廷林等
石油烃含量采用OCMA-350非分散红外石油分析仪测定。石油组分采用气象色谱-质谱联用仪测定。气象色谱（GC）为Trace2000型，质谱（MS）为Voyager，柱子DB-5，长30m，固定相0.25µm厚，测试相对分子质量范围为30450，前610min为溶剂峰。分析条件为：100℃开始，每分钟上升10℃至200℃，再以5℃/min升至280℃，保留10min，质谱与色谱连接温度为250℃。
8.石油降解菌的分离鉴定及石油污染土壤的细菌多样性任随周等
石油中饱和烃和芳香烃含量的分析：用石油醚将培养基中残余的石油提取出来, 浓缩一定体积后采用FinniganTrace DSQ (Thermo ElectronCorporatio)气质联用仪进行分析, 色谱柱为DB-5MS(30m×0.25µm×0.25mm)，气相色谱操作条件为: 进样口温度数220℃, 程序升温,扫描范围19～650amu，扫描速度500amu/s，电子能量70eV，离子源温度250℃, 传输线温度250℃, 载气流速1.0ml/min。
9.石油污水灌区的微生物生态及其降解石油的研究刘期松等
微生物降解石油的测定方法：取液体培养基25ml置125ml三角瓶中，加10-15mg油，约占0.04-0.06基质，震荡培养，28℃，7天。
（1）萃取培养液中的油：用处理过的二氯甲烷或四氯化碳萃取未被降解的石油。
（2）萃取油的测定：用5-10ml的四氯化碳洗烧杯中上述残渣，将溶液置石英槽中，以四氯化碳作参比。于IR-27G红外分光光度计上在3200-2800nm-1(3.43µm)扫描，测定各点2491nm-1(3.43µm)的吸光强度。

摘要 ［ 目的］ 筛选产生物表 面活性剂石 油降解茵， 并构建高效降解茵群。［ 方法】 以中原原 油为
Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ，
Ｐ ｕ ｙ ａ ｎ ｇ ，
Ｈｅ ｎ ａ ｎ
唯 一碳 源 ， 经富集培养 ， 从 石油污 染土壤 中分 离到 １ ２ 株 茵； 通 过测定 茵株 的溶血 活性、 排油
石 油 又称 原 油 ，对石油 烃的
ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ， ｅ ｍｕ ｌ ｓ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｄ ｅ ｘ ａ ｎ ｄ ｓ ｕ ｒ ｆ ａ ｃ ｅ ｔ ｅ ｎ — ｓ ｉ ｏ ｎ ，ａ ｎ ｄ ｔ ｈｅ ｙ ｗｅ ｒｅ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉｅ ｆ ｄ ｂ ａ ｓ ｅ ｄ ｏ ｎ ｈｅ ｔ ｉ ｒ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ，ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｉｓ ｒ ｔ ｉ ｃ ｓ ．Ｆ ｉ ｎ ａ ｌ ｌ ｙ ．ｔ ｈｅ
中图分 类号 Ｓ １ ８ １ ． ３
ｄ ｕ ｃ ｅ ｂ ｉ ｏ ｓ ｕ ｒ ｆ ａ ｃ ｔ ａ ｎ ｔ ａ ｎ ｄ ｅ ｍｕ ｌ ｓ ｉ ｆ ｙ ｔ ｈ ｅ ｃ ｒ ｕ ｄ ｅ ｏ ｉ ｌ ｗｅ ｒ ｅ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｅ ｄ ａ ｃ ｃ ｏ ｒ ｄ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｉ ｒ ｈ ｅ ｍｏ ｌ ｙ ｔ ｉ ｃ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ． ｏ ｉ ｌ ｄ ｉ ｓ ｐ ｌ ａ ｃ ｅ ｍｅ ｎ ｔ
活性 、 乳化指数 和表 面张力 ， 筛选 出具有较 强的表 面活性剂 产生能力和 乳化 原油能 力的 菌
株， 并对其形态特征和 生理生化特性进行研 究 ； 再将这 几株 茵按不 同比例组合 构建茵群 ， 研

高效石油烃降解菌 CQ6的分离鉴定及 He －Ne 激光诱变付瑞敏;康治华;彭瑞强;陈五岭【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2015(000)007【摘要】从长庆油田石油污染土壤中分离得到一株产生生物表面活性剂的高效石油烃降解菌。

通过形态学、生理生化和分子生物学研究，筛选出的菌株 CQ6被鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。

为了增强该菌降解石油烃的能力，对其进行He －Ne激光诱变，获得6株突变株，通过检测其表面张力、排油圈直径和烃降解率，降解石油烃能力最强且遗传性状稳定的突变株 CQ66被挑选出来。

本研究表明，He －Ne 激光诱变育种技术可有效改良石油烃降解菌，该手段对修复石油污染土壤具有现实意义。

【总页数】4页(P404-406,407)【作者】付瑞敏;康治华;彭瑞强;陈五岭【作者单位】西北大学生命科学学院，陕西西安 710069; 河南教育学院生命科学系，河南郑州 450046;中国石油长庆油田分公司第三采油厂，陕西西安 710069;中国石油长庆油田分公司第五采油厂，陕西西安710069;西北大学生命科学学院，陕西西安 710069【正文语种】中文【中图分类】S182【相关文献】1.石油烃降解菌CQ6产生物表面活性剂发酵条件的优化 [J], 付瑞敏;杨雪;谷亚楠;薛婷婷;邢文会;张红;张丽琴;常慧萍;陈五岭2.高效石油烃降解菌的分离鉴定及降解特性 [J], 李慧;陈冠雄;张颖;徐慧;金寰宇;张成刚3.石油烃降解菌的分离鉴定及其产生乳化剂条件 [J], 任华峰;张雨山;王静;张晓青;成玉4.一株镍抗性和石油烃降解菌的分离鉴定及其生物学特性 [J], 马永松;李琋;李珍珍;王佩洁5.一株耐低温石油烃降解菌的分离鉴定及其降解特性 [J], 任华峰;姜天翔;成玉;张晓青;马晓蕾;曹军瑞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一株能高效降解几种有机磷农药的菌株JS018的鉴定江玉姬;邓优锦;刘新锐;谢宝贵;胡方平;辛伟【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2006(46)3【摘要】从福建三明农药厂附近的土壤分离、筛选获得一株能够高效降解甲基1605、辛硫磷等有机磷农药的菌株JS018,在LB培养基中发酵36h,对甲基1605、辛硫磷、三唑磷、敌敌畏的降解率分别为96%、99%、98.9%和69.0% .该菌在LB平板培养基上形成的菌落为粉红色,圆形,有光泽;经电镜观察,为小球状菌,直径0.5μm～0.75μm;革兰氏染色为阴性;能够在30℃～38℃温度范围内和pH7.0～9.0范围内很好的生长,最适生长温度为32℃,最适pH7.5～8.0;在含有6%NaCl以上的培养基中,不能生长.抗生素敏感性实验表明:JS018菌对安比西林、青霉素、林肯霉素有抗性;对卡那霉素、四环素、庆大霉素等敏感.碳源发酵实验表明:该菌株能发酵葡萄糖、海藻糖、松三糖、乙醇;不能发酵阿拉伯糖、蔗糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖等;不能利用棕檬酸盐,不能液化明胶,不产生硫化氢,能还原硝酸盐,不产生吲哚,接触酶阳性,脲酶阳性.根据其形态特征,生理生化特性、16S rDNA序列分析,初步鉴定JS018为Roseomonas(玟瑰单胞菌属).【总页数】4页(P463-466)【作者】江玉姬;邓优锦;刘新锐;谢宝贵;胡方平;辛伟【作者单位】福建农林大学食品科学学院,福州,35002;福建农林大学植物保护学院,福州,35002;福建农林大学生命科学院,福州,35002;福建农林大学生命科学院,福州,35002;福建农林大学生命科学院,福州,35002;福建农林大学植物保护学院,福州,35002;福建农林大学生命科学院,福州,35002【正文语种】中文【中图分类】Q93【相关文献】1.一株既产表面活性剂又高效降解石油烃菌株的鉴定及降解效果 [J], 刘虹;王航;汪雪格;刘娜;温钢;付净;翦英红2.一株高效降解中长链烷烃菌株的分离鉴定及其降解特性研究 [J], 唐赟;谭洪;;3.炼油废水中筛选的一株高效降解石油烃菌株的鉴定及降解特性 [J], 高鹏飞;刘虹;刘翠珠;温钢4.一株高效木质素降解菌株LG-1的筛选、鉴定及酶活测定 [J], 王全;王会;李红亚;李术娜5.一株尼古丁高效降解菌株的分离鉴定和降解特性 [J], 孙柯丹;朱晨静;钟卫鸿;陈建孟;叶紫娟;刘培基;周强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

生物表面活性剂及其在生物降解中的应用蒋磊;杨慧群;陶语若【摘要】Biosurfactants could be widely used in the biodegradation of organic contaminants. The mechanism, common characteristics and microbial origin of biosurfactants were summarized. The research advance and environmental applications of three biosurfactants (rhamnolipid, sophorose lipids and surfactin) were introduced especially.%生物表面活性剂在有机污染物的生物降解上具有广泛的运用潜力.介绍了表面活性剂的作用机制,总结了生物表面活性剂的一般特征及其来源微生物,重点归纳了鼠李糖脂(Rhamnolipid)、槐糖脂(Sophorose lipids)和表面活性肽(Surfactin)3种常见的生物表面活性剂的研究进展,并对其在生产实践中的运用进行了介绍.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2011(050)017【总页数】5页(P3457-3461)【关键词】生物表面活性剂;鼠李糖脂;槐糖脂;表面活性肽;生物降解【作者】蒋磊;杨慧群;陶语若【作者单位】武汉纺织大学环境工程学院,武汉430073;武汉纺织大学环境工程学院,武汉430073;武汉纺织大学环境工程学院,武汉430073【正文语种】中文【中图分类】TQ423;X172由于工业化的发展越来越依赖于石油等有机能源，最近的20年内，土壤及水体的有机污染越来越受到人们的重视。

目前石油烃已经成为土壤及其含水层最主要的污染物［1］，其他的有机污染物还包括水性有机废物（杀虫剂）和有机溶剂等。