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细菌体外实验所需要的仪器设备：1．37℃恒温箱：容积可容50个培养皿2．无菌操作台3．VORTEX振荡器4．高温高压消毒锅5．微波炉及手套6．冰箱7．玻璃器皿：细菌培养皿100个及消毒筒6个，10ml试管及盖100个及试管架2个，锥形瓶及盖（20个），酒精灯1个，玻璃涂布棒3个。
8．其它耗材：微量移液器枪头及盒，细菌培养液配制原料，Ep管及架。
细菌体内实验所需要的仪器设备：1．动物饲养房：动物饲养笼，通风设备2．组织切片：切片机、烘片机、滩片机、电炉、恒温箱、细菌的简单染色和革兰氏染色（一）实验目的：学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
（二）实验原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
到２００５年使生物农药使用量占到农药总量的３０％，２０１５年占到５０％。
目前，我国农药耗用量每年达１５０万吨以上，按此比例计算，２００５年需生物农药４５万吨，２０１５年达７５万吨。
而目前我国生物农药仅８０００吨，在农药总量中不到１％。
由此可见，生物农药具有很好的发展前景。
苏云金杆菌作为应用最广泛的生物农药，其发展潜力是可以预测的。
２苏云金杆菌的产生背景及发展１９叭年，德国南部一个叫苏云金的小城镇上，一家面粉加工厂发生了一件怪事，一种叫地中海粉螟的仓库害虫，平时粉蛾飞舞，幼虫在面粉中爬来爬去，这一天，有人发现那些小爬虫突然卷曲死ｌ二。
这件事弓ｆ起了生物学家贝尔内里的注意，经过无数次努力，贝尔内里从虫ｔｒ＿｜中分离出来这利，杆状细菌。
４年以后．克林诺发现．在细菌的芽孢形成不久，还会形成一些正方形或菱形的晶体，可惜这个发现来被重视。
１９５３年，汉纳证明了这种晶体是有赤的噩白晶体，粉螟幼虫自然死【＝＝的原因不吉臼明了。
这种细菌以发现的地方命名，叫嚣云金杆菌。
经过几十年的势力。
科学家们用实验证明苏云金杆菌可以防治鳞翅曰、膜翅日、直翅目、鞘翅目等１３０多种害虫。
３苏云金杆菌的杀虫机理苏云金杆菌杀虫作用的主要成分是孢子形成过程中产生的伴孢晶体（ＩｃＰｓ），它足单基因表达的产物”。
伴孢晶体经敏感昆虫口服后，在中肠碱性环境中，被降梓为活性的多肽片断（ＩｃＰ的毒性片断包含三个不同的结构域。
一般认为结构Ｉ参与孔道的形成．结构域ＩＩ决定毒素与受体的特异性结合。
结构域ＩＩＩ主要调节毒素的活性）”’，再与巾肠受体蛋白（陷锄）结合，形成细胞膜通道，破坏渗透膜，引起细胞溶解，展终导致虫体死亡。
ＩｃＰ的杀虫作用表现出种属专一性，然而，ＩｃＰ对敏感昆虫的特异性和毒力，除决定于菌株本身外，还决定于昆虫肠液对伴孢晶体的溶解和激活方式，幼虫中肠上皮细胞毒蛋白专一性受体的存在以及昆虫对ＢＴ的抗性“３。
目前，全世界拱分离到５００００株苏云金杆菌，分为６２种血清型和矩种。
稀释培养测数法（MPN）一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理 &n一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。
见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。
根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。
具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。
培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；稀释度 lO-3 10-4 10-5 lO-6 10-7 10-8重复数 5 5 5 5 5 5出现生长的管数 5 5 5 4 1 0根据以上结果，在接种lO-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。
《各种功能菌的作用》一、枯草芽孢杆菌：增加作物抗逆性、固氮。
二、巨大芽孢杆菌：解磷（磷细菌），具有很好的降解土壤中有机磷的功效。
三、胶冻样芽孢杆菌：解钾，释放出可溶磷钾元素及钙、硫、镁、铁、锌、钼、锰等中微量元素。
四、地衣芽孢杆菌：抗病、杀灭有害菌，五、苏云金芽孢杆菌：杀虫（包括根结线虫），对鳞翅目等节肢动物有特异性的毒杀活性。
六、侧孢芽孢杆菌：促根、杀菌及降解重金属，七、胶质芽孢杆菌：有溶磷、释钾和固氮功能，分泌多种酶，增强作物对一些病害的抵抗力。
八、泾阳链霉菌：具有增强土壤肥力、刺激作物生长的能力。
九、菌根真菌：扩大根系吸收面，增加对原根毛吸收范围外的元素（特别是磷）的吸收能力。
十、棕色固氮菌：固定空气中的游离氮，增产。
十一、光合菌群：是肥沃土壤和促进动植物生长的主力部队。
十二、凝结芽孢杆菌：可降低环境中的氨气、硫化氢等有害气体。
提高果实中氨基酸的含量。
十三、米曲霉：使秸秆中的有机质成为植物生长所需的营养，提高土壤有机质，改善土壤结构。
十四、淡紫拟青霉：对多种线虫都有防治效能，是防治根结线虫最有前途的生防制剂。
三种以上多种复合菌相互促进、相互补充，抗土传病害效果远远大于单一菌种有益菌群相互协同，共同作用，能使作物达到高产丰产的效果.1、促进快速生长：菌群中的巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌等有益微生物在代谢过程中产生大量的植物内源酶，可明显提高作物对氮、磷、钾等营养元素的吸收率。
2、调节生命活动，增产增收：菌群中的胶冻样芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等有益菌可促进作物根系生长，须根增多。
有益微生物菌群代谢产生的植物内源酶和植物生长调节剂经由根系进入植物体内，促进叶片光合作用，调节营养元素往果实流动，膨果增产效果明显。
与施用化肥相比，在等价投入的情况下可增产15%—30%。
3、果实品质明显提高：菌群中的侧孢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等可降低植物体内硝酸盐含量20%以上，能降低重金属含量，可使果实中Vc含量提高30%以上，可溶性糖提高2—4度。
芽孢杆菌的功能主治芽孢杆菌简介芽孢杆菌（Bacillus spp.）是一类革兰氏阳性细菌，形态为直杆状，能够形成耐热性芽孢。
芽孢杆菌广泛存在于自然环境中，包括土壤、水体、动物和植物体内等。
与许多其他微生物相比，芽孢杆菌具有较高的耐受性和适应性，因而具备了多种功能和应用价值。
芽孢杆菌的功能主治1.生物杀虫剂–芽孢杆菌是一种重要的生物杀虫剂。
其中，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），尤其被广泛应用于农业生产中。
Bt杆菌产生的毒素对多种昆虫具有高度的选择性，对外泌皮的昆虫特别有效。
其通过被昆虫摄入，杀死昆虫的中肠细胞，从而达到杀虫的目的。
由于其对非目标生物的毒性低，对环境友好，不会引起昆虫抗药性，且不会留下农药残留，因此被广泛应用于农田、果园和温室中，为农业生产做出了重要贡献。
2.植物生长调节剂–芽孢杆菌可以促进植物的生长和发育。
它们产生一系列植物生长调节物质，包括植物生长素、溶解性磷酸酶和蛋白酶等。
这些物质可以提高植物的营养吸收能力，增加植物根系的生物量和活性，改善植物的根区环境，从而增强植物的抗逆性和产量。
3.环境净化–芽孢杆菌具有很强的分解作用，可以降解和清除各种有机物质，包括石油类物质、农药残留、工业废水和有机废弃物等。
它们能够分解这些有害物质，并将其转化为无害的物质，从而净化环境，降低对生态系统的危害。
4.动物饲料添加剂–芽孢杆菌可以作为一种优质的动物饲料添加剂。
它们能够增强动物的消化吸收能力，提高动物的生长速度和饲料转化率。
此外，芽孢杆菌还能够抑制肠道有害菌的生长，预防动物的肠道病菌感染，增强动物的免疫力。
5.抑制病原菌生长–芽孢杆菌产生的一些抗菌物质可以抑制许多病原菌的生长，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等。
这些物质可以与病原菌竞争生存资源，抑制其生长和繁殖，从而减少感染风险。
6.食品保鲜剂–一些芽孢杆菌产生的代谢产物具有抑制食物腐败和变质的作用，可以作为一种天然的食品保鲜剂使用。
十四种常见生物菌名称与作用（收藏！）一、枯草芽孢杆菌：增加作物抗逆性、固氮。
二、巨大芽孢杆菌：解磷(磷细菌)，具有很好的降解土壤中有机磷的功效。
三、胶冻样芽孢杆菌：解钾，释放出可溶磷钾元素及钙、硫、镁、铁、锌、钼、锰等中微量元素。
四、地衣芽孢杆菌：抗病、杀灭有害菌。
五、苏云金芽孢杆菌：杀虫(包括根结线虫)，对鳞翅目等节肢动物有特异性的毒杀活性。
六、侧孢芽孢杆菌：促根、杀菌及降解重金属。
七、胶质芽孢杆菌：有溶磷、释钾和固氮功能，分泌多种酶，增强作物对一些病害的抵抗力。
八、泾阳链霉菌：具有增强土壤肥力、刺激作物生长的能力。
九、菌根真菌：扩大根系吸收面，增加对原根毛吸收范围外的元素(特别是磷)的吸收能力。
十、棕色固氮菌：固定空气中的游离氮，增产。
十一、光合菌群：是肥沃土壤和促进动植物生长的主力部队。
十二、凝结芽孢杆菌：可降低环境中的氨气、硫化氢等有害气体。
提高果实中氨基酸的含量。
十三、米曲霉：使秸秆中的有机质成为植物生长所需的营养，提高土壤有机质，改善土壤结构。
十四、淡紫拟青霉：对多种线虫都有防治效能，是防治根结线虫最有前途的生防制剂。
三种以上多种复合菌相互促进、相互补充，抗土传病害效果远远大于单一菌种。
有益菌群相互协同，共同作用，能使作物达到高产丰产的效果。
1、促进快速生长：菌群中的巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌等有益微生物在代谢过程中产生大量的植物内源酶，可明显提高作物对氮、磷、钾等营养元素的吸收率。
2、调节生命活动，增产增收：菌群中的胶冻样芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等有益菌可促进作物根系生长，须根增多。
有益微生物菌群代谢产生的植物内源酶和植物生长调节剂经由根系进入植物体内，促进叶片光合作用，调节营养元素往果实流动，膨果增产效果明显。
与施用化肥相比，在等价投入的情况下可增产15%—30%。
3、果实品质明显提高：菌群中的侧孢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等可降低植物体内硝酸盐含量20%以上，能降低重金属含量，可使果实中Vc含量提高30%以上，可溶性糖提高2—4度。
1.革兰氏阳性细菌细胞壁中的特有成分是（）。
肽聚糖脂蛋白磷壁酸脂多糖本题分值： 5.0用户得分： 5.0用户解答：磷壁酸知识点： 2.1 细菌2.下列（）微生物常被加入保健饮品中，以提高产品的保健效果。
乳酸杆菌双歧杆菌醋酸菌酵母菌本题分值： 5.0用户得分： 5.0用户解答：双歧杆菌知识点： 2.1 细菌3.衣原体与立克次氏体的主要区别在于（）。
衣原体没有能量代谢系统立克次氏体没有细胞壁衣原体没有细胞壁立克次氏体没有能量代谢系统本题分值： 5.0用户得分： 5.0用户解答：衣原体没有能量代谢系统知识点： 3.1 丝状真菌（霉菌）营养体|2.3 其他有代表性的原核微生物4.下列微生物中能进行光合作用的微生物是（）。
链霉菌酵母菌绿色木霉蓝细菌本题分值： 5.0用户得分： 5.0用户解答：蓝细菌知识点： 2.3 其他有代表性的原核微生物5.酵母菌的菌落类似于（）。
霉菌菌落链霉菌菌落细菌菌落以上都不对本题分值： 5.0用户得分： 5.0用户解答：细菌菌落知识点： 3.4 真菌的分类及代表属6.下列（）微生物常被作为食品卫生质量评定的指示菌。
金黄色葡萄球菌变形杆菌大肠杆菌群芽孢杆菌群本题分值： 5.0用户得分： 5.0用户解答：大肠杆菌群知识点： 9.7 食品卫生的微生物学检验7.能产生伴胞晶体的微生物是（）。
大肠杆菌蓝细菌苏云金芽孢杆菌根瘤菌本题分值： 5.0用户得分： 5.0用户解答：苏云金芽孢杆菌知识点： 2.1 细菌氮元素矿质元素碳元素水分本题分值： 5.0用户得分： 5.0用户解答：水分知识点： 5.1 微生物的营养二多项选择题1.请指出下列（）吸收营养物的方式需要能量。
扩散主动运输助长扩散基团转位本题分值： 5.0用户得分： 5.0用户解答：主动运输| 基团转位知识点： 5.1 微生物的营养2.请指出下列（）吸收营养物的方式需要酶。
扩散主动运输助长扩散基团转位本题分值： 5.0用户得分： 5.0用户解答：主动运输| 助长扩散| 基团转位知识点： 5.1 微生物的营养3.为了缩短微生物在培养过程中的延迟期，可采用（）方法。
1 一、选择题 1、下列关于微生物分离和培养的有关叙述，错误的是 A．微生物培养前，需对培养基进行消毒 B．测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法 C．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度 D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源 2、筛选是生物技术中的一个重要环节。下列叙述不正确的是（ ） A．基因工程中，利用目的基因对受体细胞进行筛选 B．杂交育种中，利用病原体感染法筛选出F2中抗病植株 C．细胞工程中，利用特定的选择培养基筛选出杂交细胞 D．动物细胞培养与植物组织培养所用的培养基成分一样 3、下列关于生物技术的叙述，不正确的是 （ ） A．DNA连接酶能特异性识别粘性末端从而将切割位点连接起来 B．植物体细胞杂交过程中得到的杂种细胞具有连续分裂并分化形成完整植株的潜能 C．单克隆抗体制备时需要利用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞 D．微生物培养中可以利用以尿素为唯一碳源的培养基筛选出能分解尿素的细菌 4、“筛选”是生物学中培育生物新类型常用的手段，下列有关技术筛选不成功的是（ ） A．细胞中DNA的合成有D和S两种途径，效应B细胞中这两种合成途径都有，该细胞一般不增殖；骨髓瘤细胞中只有D途径。在细胞工程中若要将杂交瘤细胞从中筛选出来，可在培养基中加入能阻断D途径的药物。 B．可以用添加伊红和美蓝的培养基分离大肠杆菌 C．将具有不同优良性状的亲本杂交后，不断自交，并不断淘汰不符合要求的个体，直至后代不在发生性状分离，可培育出具有优良性状的新品种。 D．在基因工程中，通过对细胞单独培养并检测目的基因表达的产物来筛选基因工程细胞 5、下列设想中，从生物工程技术的原理看，无法实现的是（ ） A．利用基因工程技术可获得乙肝疫苗 B．利用发酵工程技术得到能够分解多种塑料废弃物的超级细菌 C．利用细胞工程技术制备大量且纯度高的抗HIV的抗体 D．利用植物体细胞杂交技术可培育出地上结番茄、地下结马铃薯的杂种植株 6、下列关于生物工程技术的叙述中，正确的是 （ ） A．用同一种限制酶分别作用于正常基因和它的突变基因，其结果可能不同 B．在离体植物细胞转变为愈伤组织的过程中体现了细胞的全能性 C．选取一定数量的B淋巴细胞进行增殖培养，即可获得有关的单克隆抗体 D．某种植物甲乙两品种的体细胞杂交后代与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同 7、湖南师大生科院与湘东渔场协作，成功培育出全球首例遗传性状稳定且能自然繁殖的四倍体鱼类种群。虽然四倍体鱼生长快、肉质好、抗病能力强，但研究人员并不直接将它投入生产，而是将它与二倍体鱼杂交的后代投入生产。你认为这样做的最主要意义是 （ ） A．充分利用杂种优势 B．避免出现新基因，维持种群基因库的稳定 C．保护物种的多样性，维护生态平衡 D．避免四倍体鱼对人类健康可能造成的危害 8、降钙素是一种多肽类激素，临床上用于治疗骨质疏松症等。人的降钙素活性很低，半衰期较短。某科学机构为了研发一种活性高、半衰期长的新型降钙素，从预期新型降钙素的功能出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了两条72个碱基的DNA单链，两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用Klenow酶补平，获得双链DNA，过程如下图： 2
苏云金杆菌在我国研究和应用进展
董濯清
【期刊名称】《农药科学与管理》
【年(卷),期】1995(000)004
【摘要】苏云金杆菌在我国研究和应用进展董濯清（中国农科院生物防治研究所
１０００８ｌ）苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）简称苏云金杆菌（Ｂ．ｔ．），其制剂是目前世界上产量最大的微生物杀虫剂，已有１００多种商品制剂。
它广泛用于防治农业、...
【总页数】3页(P23-25)
【作者】董濯清
【作者单位】中国农科院生物防治研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S482.3
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微生物的显微直接计数法一、实验目的了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法,掌握显微镜下直接计数的技能;二、实验原理测定微生物细胞数量的方法很多,通常采用的有显微直接计数法和平板计数法;显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质,常不易分辨;菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽Petrof Hausser 细菌计数板;两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察;而血球计数板较厚,不能使用油镜,计数板下部的细菌不易看清;血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台;中间的平台较宽,其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区图21-1,计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格大方格用三线隔开,而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格大方格之间用双线分开,而每个大方格又分成16个小方格;但是不管计数区是哪一种构造,它们都有一个共同特点,即计数区都由400个小方格组成;计数区边长为1mm,则计数区的面积为l mm2,每个小方格的面积为1/400mm2;盖上盖玻片后,计数区的高度为,所以每个计数区的体积为,每个小方格的体积为1/4000mm3;使用血球计数板计数时,先要测定每个小方格中微生物的数量,再换算成每毫升菌液或每克样品中微生物细胞的数量;已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格,即系数K=4×106 ;因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数N×系数K×菌液稀释倍数d 三、实验器材1．活材料：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae斜面或培养液;2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片22mm×22mm、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸;四、实验方法1．视待测菌悬液浓度,加无菌水适当稀释斜面一般稀释到10-2,以每小格的菌数可数为度;2．取洁净的血球计数板一块,在计数区上盖上一块盖玻片;3．将酵母菌悬液摇匀,用滴管吸取少许,从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴不宜过多,让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区,勿使气泡产生,并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液;也可以将菌悬液直接滴加在计数区上,不要使计数区两边平台沾上菌悬液,以免加盖盖玻片后,造成计数区深度的升高;然后加盖盖玻片勿使产生气泡;4．静置片刻,将血球计数板置载物台上夹稳,先在低倍镜下找到计数区后,再转换高倍镜观察并计数;由于生活细胞的折光率和水的折光率相近,观察时应减弱光照的强度;5．计数时若计数区是由16个大方格组成,按对角线方位,数左上、左下、右上、右下的4个大方格即100小格的菌数;如果是25个大方格组成的计数区,除数上述四个大方格外,还需数中央l个大方格的菌数即80个小格;如菌体位于大方格的双线上,计数时则数上线不数下线,数左线不数右线,以减少误差;6．对于出芽的酵母菌,芽体达到母细胞大小一半时,即可作为两个菌体计算;每个样品重复计数2—3次每次数值不应相差过大,否则应重新操作,求出每一个小格中细胞平均数N,按公式计算出每mlg菌悬液所含酵母菌细胞数量;7．测数完毕,取下盖玻片,用水将血球计数板冲洗干净,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免损坏网格刻度;洗净后自行晾干或用吹风机吹干,放入盒内保存;五、实验作业：将实验结果填入下表中：稀释平板测数法一、实验目的了解稀释平板计数的原理,掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法,认识细菌、放线菌、霉菌的菌落特征;二、实验原理稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落,即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法,即一个菌落代表一个单细胞;计数时,首先将待测样品制成均匀的系列稀释液,尽量使样品中的微生物细胞分散开,使成单个细胞存在否则一个菌落就不只是代表一个细胞,再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中,使其均匀分布于平板中的培养基内;经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可计算出样品中的含菌数;此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数,故又称活菌计数;一般用于某些成品检定如杀虫菌剂等、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验;三、实验器材1．活材料：苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis菌剂;2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基附录三、13．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等;四、实验方法1．样品稀释液的制备准确称取待测样品l0g,放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中,用手或置摇床上振荡20 min,使微生物细胞分散,静置20-30s,即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管,吸取10-1稀释液lml,移入装有9ml无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml,移入装有9ml无菌水的试管中,也吹吸三次,即成l0-3稀释液；以此类推,连续稀释,制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液图22-1;图22-1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养用稀释平板计数时,待测菌稀释度的选择应根据样品确定;样品中所含待测菌的数量多时,稀释度应高,反之则低;通常测定细菌菌剂含菌数时,采用10-7、10-8、10-9稀释度,测定土壤细菌数量时,采用10-4、10-5、10-6稀释度,测定放线菌数量时,采用l0-3、10-4、10-5稀释度,测定真菌数量时,采用10-2、10-3、10-4稀释度;2．平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法;1混合平板培养法将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码,每一号码设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中,同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中,再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换;然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基图22-2,轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷疑后倒置,适温培养;至长出菌落后即可计数;2涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上每个编号设三个重复;再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀图22-3,每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌;在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲;将涂抹好的平板平放于桌上20—30min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至长出菌落后即可计数;五、实验作业：将实验结果填入下表中计算结果时,常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度,求出每克菌剂中的含菌数;1同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊;2细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜,霉菌以每皿10—100个菌落为宜;选择好计数的稀释度后,即可统计在平板上长出的菌落数,统计结果按下式计算;混合平板计数法：每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数涂抹平板计效法：每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数稀释培养测数法MPN一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数,了解稀释培养计数MPN的原理和方法;二、实验原理最大或然数most probable number,MPN计数又称稀释培养计数,适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势,但却具有特殊生理功能的类群;其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰,并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度;本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等;见附表23-1的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群如大肠菌群的数量,缺点是只适于进行特殊生理类群的测定,结果也较粗放,只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用;MPN计数是将待测样品作一系列稀释,一直稀释到将少量如lm1的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖;根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度,采用“最大或然数”理论,可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值;具体地说,菌液经多次10倍稀释后,一定量菌液中细菌可以极少或无菌,然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中;培养后,将有菌液生长的最后3个稀释度即临界级数中出现细菌生长的管数作为数量指标,由最大或然数表见附录九上查出近似值,再乘以数量指标第一位数的稀释倍数,即为原菌液中的含菌数;如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；稀释度 lO-3 10-4 10-5 lO-6 10-7 10-8重复数 5 5 5 5 5 5出现生长的管数 5 5 5 4 1 0根据以上结果,在接种lO-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长,在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长,在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长,而接种10-8稀释液的试管全无生长;由此可得出其数量指标为“541”,查最大或然数表得近似值17,然后乘以第一位数的稀释倍数10-5的稀释倍数为100 000;那么,1ml原菌液中的活菌数＝17×100 000 = 17×105;即每毫升原菌液含活菌数为l700000个;在确定数量指标时,不管重复次数如何,都是3位数字,第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管,后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数,如果再往下的稀释仍有生长管数,则可将此数加到前面相邻的第三位数上即可;如某一微生物生理群稀释培养记录为：稀释度 lO-1 10-2 10-3 lO-4 10-5 10-6重复数 4 4 4 4 4 4出现生长的管数 4 4 3 2 1 0以上情况,可将最后一个数字加到前一个数字上,即数量指标为“433”,查表得近似值为30,则每毫升原菌液中含活菌30×102个;按照重复次数的不同,最大或然数表又分为三管最大或然数表、四管最大或然数表和五管最大或然数表;应用MPN计数,应注意两点,一是菌液稀释度的选择要合适,其原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长,而最高稀释度的所有重复无菌生长;对土壤样品而言,分析每个生理群的微生物需5—7个连续稀释液分别接种,微生物类群不同,其起始稀释度不同见附表1；二是每个接种稀释度必须有重复,重复次数可根据需要和条件而定,一般2—5个重复,个别也有采用2个重复的,但重复次数越多,误差就会越小,相对地说结果就会越正确;不同的重复次数应按其相应的最大或然数表计算结果;若要求出土样中每克干土所含的活菌数,则要将前述两例中所得的每毫升菌数除以干土在土样中所占的质量分数烘干后的土样质量／原始土样的质量;计算式为：三、实验器材1. 土壤样品：肥沃菜园土2. 培养基：阿须贝Ashby无氮培养液附录三、1522管每管装5ml,加1cm×滤纸l条3. 器材：90ml无菌水装入250 ml三角瓶中,并装有15—20个玻璃珠、9ml无菌水、lml刻度无菌吸管、试管架、记号笔;四、实验方法1．称取10克土样,放入90ml无菌水中,振荡20min,让菌充分分散,然后按十倍稀释法将供试土样制成10-1—10-6的土壤稀释液;2．将22支装有Ashby无氮培养液的试管按纵4横5的方阵排列于试管架上,第一纵列的4支试管上标以10-2,第二纵列的4支试管上标以10-3……第五纵列的4支管上际以10-6即采用5个稀释度,4个重复,另外2支试管留作对照;3．用lml无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6的土壤稀释液各lml放入编号10-6的4支试管中,再吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的4支试管中,同法吸取10-4、10-3、10-2稀释液各lml放入各自对应编号的试管中;对照管不加稀释液;4．将所有试管置28—30℃培养7天后观察结果;5．精确称取3份10克稀释用土,放入称量瓶中,置105-110℃烘2h后放入干燥器中,至恒重后称重,然后计算干土在土样中所占的质量份数;五、实验作业：培养7天后,取出试管,检查实验结果;凡有固氮菌生长的试管,则培养液与滤纸接触处有黑褐色或粘液状菌膜,即为阳性,否则为阴性;对照管应为阴性;依次检查每管生长情况,将结果填入下表,计算每克干土所含的活菌数;附表23-1 几种主要微生物生理群MPN计数法一览表。
高含量苏云金杆菌制剂防治高山甘蓝小菜蛾的田间药效龙同;罗业文;蔡建华;陈洪波;曹春霞;杨妮娜;黄大野;程贤亮;杨自文【摘要】在鄂西北高山地区,采用喷雾法进行高含量苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)制剂(50000IU/mg可湿性粉剂,晶体蛋白含量为8.3％)防治小菜蛾的田间药效试验.试验结果表明,50 000 IU/mg苏云金杆菌可湿性粉剂对小菜蛾防效显著,药后7d防效达到91.0％～95.9％,优于对照药剂1.8％阿维菌素乳油.苏云金杆菌作为一种全球公认的低毒、环保、安全生物农药,50 000 IU/mg苏云金杆菌可湿性粉剂可以在高山十字花科蔬菜种植区大面积推广,推荐使用剂量675～900 g/hm2.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2014(053)024【总页数】3页(P6015-6017)【关键词】高含量苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis);50 000 IU/mg苏云金杆菌可湿性粉剂;高山蔬菜;小菜蛾;田间药效【作者】龙同;罗业文;蔡建华;陈洪波;曹春霞;杨妮娜;黄大野;程贤亮;杨自文【作者单位】湖北省生物农药工程研究中心,武汉 430064;湖北省农业科技创新中心生物农药分中心,武汉430064;利川市农业局,湖北利川 445400;嘉鱼县农业局,湖北嘉鱼437200;利川市农业局,湖北利川 445400;湖北省生物农药工程研究中心,武汉 430064;湖北省农业科技创新中心生物农药分中心,武汉430064;湖北省生物农药工程研究中心,武汉 430064;湖北省农业科技创新中心生物农药分中心,武汉430064;湖北省生物农药工程研究中心,武汉 430064;湖北省农业科技创新中心生物农药分中心,武汉430064;湖北省生物农药工程研究中心,武汉 430064;湖北省农业科技创新中心生物农药分中心,武汉430064;湖北省生物农药工程研究中心,武汉430064;湖北省农业科技创新中心生物农药分中心,武汉430064【正文语种】中文【中图分类】S433.4湖北高山蔬菜产业，特别是恩施利川、宜昌长阳的高山十字花科蔬菜（甘蓝、萝卜、大白菜）是湖北省的特色产业，对当地经济的发展贡献巨大［1－3］。
苏云金芽胞杆菌肠毒素基因克隆与序列分析
黄必旺;李龙生;关雄
【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2005(034)001
【摘要】根据蜡质芽孢杆菌(Bc)肠毒素基因序列,设计特异PCR引物,对本实验室保存的16个苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株进行检测.结果显示,15个菌株含有肠毒素基因片段.克隆了Bt 8010肠毒素entS基因的编码框(ORF)序列,将该序列测序,用在线的BLAST软件与DNASIS软件进行同源性分析.结果表明,该基因与已知的Bc和炭疽芽孢杆菌肠毒素基因有很高的同源性,但该基因有12个核苷酸缺失,不能表达完整多肽.
【总页数】4页(P70-73)
【作者】黄必旺;李龙生;关雄
【作者单位】福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建,福州,350002;福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建,福
州,350002;福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建,福
州,350002
【正文语种】中文
【中图分类】S476+.11;Q781
【相关文献】
1.产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素和耐热肠毒素基因克隆及序列分析 [J], 李晓阳;郭学青
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最全的各种功能菌的作用一、枯草芽孢杆菌：增加作物抗逆性、固氮。
二、巨大芽孢杆菌：解磷（磷细菌），具有很好的降解土壤中有机磷的功效。
三、胶冻样芽孢杆菌：解钾，释放出可溶磷钾元素及钙、硫、镁、铁、锌、钼、锰等中微量元素。
四、地衣芽孢杆菌：抗病、杀灭有害菌，五、苏云金芽孢杆菌：杀虫（包括根结线虫），对鳞翅目等节肢动物有特异性的毒杀活性。
六、侧孢芽孢杆菌：促根、杀菌及降解重金属，七、胶质芽孢杆菌：有溶磷、释钾和固氮功能，分泌多种酶，增强作物对一些病害的抵抗力。
八、泾阳链霉菌：具有增强土壤肥力、刺激作物生长的能力。
九、菌根真菌：扩大根系吸收面，增加对原根毛吸收范围外的元素（特别是磷）的吸收能力。
十、棕色固氮菌：固定空气中的游离氮，增产。
十一、光合菌群：是肥沃土壤和促进动植物生长的主力部队。
十二、凝结芽孢杆菌：可降低环境中的氨气、硫化氢等有害气体。
提高果实中氨基酸的含量。
十三、米曲霉：使秸秆中的有机质成为植物生长所需的营养，提高土壤有机质，改善土壤结构。
十四、淡紫拟青霉：对多种线虫都有防治效能，是防治根结线虫最有前途的生防制剂。
三种以上多种复合菌相互促进、相互补充，抗土传病害效果远远大于单一菌种。
有益菌群相互协同，共同作用，能使作物达到高产丰产的效果.1、促进快速生长：菌群中的巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌等有益微生物在代谢过程中产生大量的植物内源酶，可明显提高作物对氮、磷、钾等营养元素的吸收率。
2、调节生命活动，增产增收：菌群中的胶冻样芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等有益菌可促进作物根系生长，须根增多。
有益微生物菌群代谢产生的植物内源酶和植物生长调节剂经由根系进入植物体内，促进叶片光合作用，调节营养元素往果实流动，膨果增产效果明显。
与施用化肥相比，在等价投入的情况下可增产15%—30%。
3、果实品质明显提高：菌群中的侧孢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌等可降低植物体内硝酸盐含量20%以上，能降低重金属含量，可使果实中Vc含量提高30%以上，可溶性糖提高2—4度。
发酵工艺学作业 题 目 苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 学 院 班 级 学 号 姓 名 苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 摘要：苏云金芽孢杆菌（Bt）是一种开发和利用较为成功的微生物生物农药，但也存在着生产成本高、发酵条件难控制等缺点。本文主要综述了Bt生物农药的发酵工艺研究进展，主要包括BT发酵中的培养基、温度、PH值、通氧量以及发酵时间等方面。并对Bt生物农药的发展前景作出了展望。 关键词：苏云金芽孢杆菌；生物农药；发酵工艺；展望
Review on fermentation of Bacillus thuringiensis
Abstract: Bacillus thuringiensis (Bt) is a microbial pesticides,Which has been successful developed and used.The fermentation technology of Bacillus thuringiensis (Bt) in recent years were summarized, including raw material, temperature, pH value, oxygen, fermentation time.In this aricle,the development prospct of Bt microbial pesticides is also put forward. Key words: Bt;microbial pesticides; fermentation technology;forward 前言 生物农药又可称为绿色农药、生态农药，是20世纪70年代提出的，是指可以用来防治病、虫、草、鼠等有害生物及调节植物生长的生物体或源于生物体的各种生理活性物质。生物农药不仅具有常规农药的高活性，能大规模工业化生产，而且专一性强，一般不伤害虫的天敌和有益生物，对人畜无毒，不污染环境，可在田间大规模应用。 微生物生物农药是生物农药中的主要类型之一[1]。而在微生物生物农药方面又以苏云金芽孢杆菌（Bt）为目前产量最大，应用最为广泛的一类细菌杀虫剂[2,3]，占到生物农药的90%左右[4]。Bt的发酵方式可分为液体发酵和固体发酵两种类型。我国主要采用液体深层发酵生产苏云金芽孢杆菌制剂。但液体发酵存在培养基成本高、效率低等问题，使得产品生产成本较高[5]。 我国一些地方的中小型农药厂生产苏云金芽孢杆菌多用简易的，小批量的固体发酵方法。 固体发酵方法作为生产BT生物农药的一种新方式，与液体发酵方式相比，具有投资低、产量高、后处理方便等优点，从而逐渐体现其优越性，但其技术和设备研究并未完全成熟。 本文对Bt发酵生物农药的发酵工艺最新研究进展进行了综述，主要包括Bt发酵中的培养基、温度、PH值、通氧量以及发酵时间等5个方面。并对BT生物农药的发展前景作出了展望。 1培养基 根据相关文献报道[6]，Bt在含氮0.075%～0.225%，含糖0.1%～1.5%和碳氮比为0.4～20.0的范围内都能生长良好。因此，为了降低生产成本，节约资源，人们通常选择廉价、易得的农副产品作为Bt发酵的原料。 1．1碳源 碳源大多为淀粉和蔗糖等。一般发酵培养基中，总营养物含量在5%左右，C/N比为(4～5):1为宜，这样的配比使得最后发酵液中芽孢量为20亿个～50亿个/ml。碳源除可以用玉米粉、葡萄糖、蔗糖外，还可以用丙酮丁醇废醪。其中葡萄糖由于受Fe2+和PO43-等离子的影响，在灭菌时很容易焦糖化，对发酵产生很大的影响[7]。由于Bt在发酵过程中能分泌活跃的胞外淀粉酶，故最好选择淀粉作碳源[8]。陈在佴等[9]对BT99-11菌株进行培养条件的研究发现，玉米淀粉比葡萄糖和玉米粉对发酵的影响更显著。 1．2氮源 氮源为豆饼、棉籽饼等蛋白质物质，其中以豆饼粉、玉米浆、鱼粉、蚕蛹粉、棉籽饼等有机氮为好，pH要求中性。吴继星[10]等进行两个菌株的混合培养，研究得出，在以豆饼粉为主要氮源的培养基上发酵水平分别达到5650和5800U/ul,显然豆饼粉培养基较棉籽饼培养基优越；申烨华等[11]对Bt-HD-1菌株进行了发酵培养，研究得出棉籽饼粉对发酵的影响显著，而鱼粉和豆饼粉对其发酵的影响不显著。在工业上，发酵中使用玉米浆比酵母粉对芽孢和伴孢晶体的影响更显著。苏云金芽孢杆菌在利用糖时会大量产酸，如果糖浓度过高，发酵液的PH值可能会降到5．5以下，这种pH会抑制或阻止苏云金杆菌的生长，同时苏云金杆菌在利用氮源时会产生一些碱性物质，会利用糖代谢时产生的酸性中间产物，因此糖浓度过少，对苏云金杆菌发酵也是不利的。综上所述，选择适合的氮碳比对BT发酵时十分重要的[11]。 1．3填料 在固体发酵中还要加入具有一定疏松通气作用的填料，这些填料可以为谷壳、砻糠、秸秆粉等农副产品，其中麸皮、米糠既可疏松透气又可作为氮源。因此麸皮、米糠是比较常用的有机载体，但是如果单独使用麸皮等载体，在培养基高温灭菌消毒后，存在着粘度加大、疏松度降低、后续接种困难等问题。张怡，杨天雪[12]等利用废次烟草部分替代固体发酵中的麸皮等有机载体，72h后棉铃虫的较正死亡率可达74%，从而降低了生产成本。 2温度
温度直接影响到微生物体内各种酶的活性，一般而言，发酵温度升高，酶的活性增大，微生物生长代谢加快，生产期提前；但温度过高会使酶失活，表现在菌体容易衰老，发酵周期缩短，从而影响最终产物[13]。因此，在发酵过程中必须保证稳定和适宜的温度范围。不同的微生物之间基本生长温度有较大的差别，对一种微生物而言，其最适生长温度一般为30℃[14]。Bt的最适生长温度在29～31℃之间，温度越低，发酵时间越长，发酵水平越好。杨淑兰[15]等对生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌的固体发酵进行了研究，结果发现，在室温23～25℃、29～31℃、35～36℃三组实验中，29～31℃的发酵效果最好，在35～36℃时菌体被抑制生长。该实验表明，控制温度至关重要，特别在对数生长期，菌体代谢旺盛，产生较大热量，此时更要控制温度，控制温度在最适范围以内，从而提高产量和毒效。 3 pH值 pH是微生物生长和产物合成非常重要的参数，是代谢活动的综合指标，对于发酵过程具有十分重要的意义。不同种类的微生物对pH的要求不同。pH的变化会影响微生物的生长和代谢产物的生成，因而控制发酵液中的pH尤为重要。 苏云金芽孢杆菌对pH有较高的耐性，可以在较宽的pH范围内好好的生长[5]。在酸性条件下生长性能较差，在弱酸和酸碱条件下生长较好[16]。当6.0时，菌数相差不大。灭菌后pH<6.5后有利于芽孢的萌发和菌体的大量生长，但对后期晶体的形成不利，pH>7.5则会延长芽孢的萌发期，因此灭菌后pH应在6.8左右为宜[17]。方苹等[18]进行了Bt固体发酵的条件试验，结果发现发酵初始pH值为7.5时所产芽孢数达到最大值，基本稳定在2137×1010个/g。Ejiofor等[19]研究表明，当pH值为5左右时，Bt形成芽孢和半孢晶体的能力较pH为中性偏碱时弱。Abdel-Hameed等[20]通过实验研究表明,当培养基的pH 值低于6. 5时,对菌体芽孢的形成和δ-内毒素产生负面的影响。杨淑兰等[21]进行苏云金芽孢杆菌固体发酵杀虫粉百公斤级扩大实验时发现，pH值为8时菌数最多，但由于配制液体种子培养基时，使用的原料在灭菌时产生了乙酸，将一部分碱中和了，实际pH为7，从而Bt的最适生长pH为7。 中科院生态中心[8]利用味精废水进行Bt的发酵也得到了同样的结论。丁学知等[22]对4.0718菌株发酵的最佳条件进行了研究，结果表明，发酵液的起始pH值为7.8-8.0. 4 通氧量 好氧性微生物的生长发育和产物的合成都需要消耗氧气，它们只有在有氧分子存在的情况下才能完成生物氧化作用，因此，供养对需氧微生物必不可少。Bt属于革兰氏好氧菌，因此在发酵过程中必须提供充足的氧气，以维持菌体生长和代谢产物的形成。在发酵初期，菌体细胞数量少，需氧量不大，但当菌体达到指数生长期时，菌体繁殖很旺盛，以糖代谢为主，需氧量最多，因此必须增加氧气的供应量[5]。根据生长周期中各阶段对氧的需求量的不同，合理的调整氧气的加入量，在需氧量较大时加大氧气的通入量，其中提高搅拌速度[23]是提高发酵水平的一种有效措施，此外，适当使用某些可溶性营养成份和进行分批补料发酵有利于改善氧气的传递[24]。 5 发酵时间 在发酵过程中，应严格控制发酵的时间，发酵时间若不足，则孢子没有充分形成，伴孢晶体的产量不足；发酵时间若太长，则由于培养基中营养物质的消耗以及代谢产物的积累，菌体数量不再继续增加，菌体逐渐老化，伴孢晶体的产量也会因此而降低[25]。一般Bt的培养时间为44-48h, 姚伟芳等[ 26 ]对Bt固态发酵条件的优化研究,结果表明,发酵时间为42 h左右效果最佳。王世梅等[ 27]利用城市污泥生产Bt生物农药时发现,在培养30 h时,有75%的芽孢脱落,在培养36 h时,有90%的芽孢脱落,在培养48 h时,细胞总数和芽孢数均达到最高。李新社等[28]对Bt不同时间的发酵培养所产生的芽孢进行计数统计，发现在培养2天时所产生的芽孢数目比前一天所产生的芽孢数要多，以后基本上不再增加甚至略有减少。周先治等[29]研究了Bt-LSZ9408菌体的生长曲线，结果表明，在8～20h范围内为对数生长期，菌体浓度逐渐增大，24h后菌体浓度达到最大值，在28～40h之间菌体数变化不大，称之为稳定生长期，40h后菌体浓度降低，进入衰亡期。通过涂片观察，发现8h时有少量菌丝体，20h时有孢子形成，28h时有半孢晶体形成，32h时有晶体出现，40h时晶体数达到80%以上。在对数生长期适当的增加生物所需的营养物质可提高Bt菌的产量[30]。 6 总结 我国Bt生物农药研究开发与应用技术已达到国际先进水平。世界上首家Bt专门研究机构——中国湖北Bt研究开发中心于20世纪90年代中期在湖北省农科院成立。新型发酵设备的出现、发酵吨位的提高、工业发酵技术的成熟、发酵液处理技术的完善以及剂型的多样化都无疑为我国Bt生物农药产业发展创造了条件，但与国外在菌种和生产技术方面相比仍有较大差距。Bt的产业化生产已经取得了一定的成绩，在实际生产中，人们为了降低生产成本，大多采用农副产品作为Bt发酵的原料。在Bt发酵过程中，会受到多方面因素的影响，这就要求我们要从多角度、多方面综合考虑，从而开发出更经济合理的培养基和培养方法。 7 展望 Bt的发展前景是非常乐观的。随着各门学科的不断发展，人们正在不断地从生物化学、基因工程等上游技术研究思路出发，同时结合代谢动力学、发酵动力学、发酵后处理化工技术、生物化学反应工程技术等下游技术研究微生物的发酵过程，通过各门学科的交叉和渗透，一定能不断扩宽Bt的开发领域。与此同时，随着以基因工程为主导的现代生物技术的不断发展，新一代遗传工程杀虫剂具有良好的开发应用前景，研究性能良好的Bt基因工程菌成为今后的一大热点。 参考文献 [1] 喻子牛. 微生物农药及其产业化[M]. 北京:科学出版社, 2000: 27 - 34. [2] 阮丽芳，王玉洁，沈萍．产黑色素B．thuringiensis重组菌株的构建及其培
