昆虫病毒怎样分离与纯化

病毒的分离方法一般情况下分离病毒可以用传代细胞、原代细胞或者直接用动物接种或者鸡胚接种，只有在找不到适合病毒生长的原代细胞或者传代细胞的情况下才运用动物接种或者鸡胚接种的方法分离病毒。

大致过程应该是这样的：第一获取病毒分离样品，这个要求比较高，采集后如果不能立即操作则必须低温保存，并尽快送实验室操作。

另外也可以冷冻保存，一般情况下病毒是不容易冻死的。

当然某些特殊病毒除外，这需要查阅相关资料。

第二病毒分离操作，将获取病样研磨，并冻融至少一次，当然研磨过程中必须低温。

同时研磨应充分，在研磨时可以加入生理盐水或PBS或者直接加细胞培养液，研磨完全后冻融一到三次，冻融的目的是为了让细胞完全破裂将细胞内的病毒释放到溶液中。

然后低速离心，取上清用0.22微米的滤膜过滤，去过滤后的液体接种细胞。

此时须注意，并不是所有病毒接种是都需要让细胞完全长满细胞瓶，一般是不能产生细胞病的病毒最好在细胞长到40%左右接种，而能产生细胞病变的则需要完全长满细胞瓶以后再接种病毒。

接种过程中为避免污染可以加入双抗，或者其他抗生素。

第三接种后观察，某些能产生细胞病变的病毒很容易观察，直接在显微镜下就能看是否分离成功；如果病毒不产生细胞病变，则需要用其他的方法来检测，比如可用荧光抗体染色、PCR或者其他方法。

不过大部分情况下第一代都不容易看到或者效果不好，这时你可以再传几代试试。

如果再传四~五代以后都没有的话，那恭喜你，你失败了，或者你的方法有问题，或者根本就没有你要分离的病毒，或者在分离过程中你的病毒就已经死了。

用细胞分离病毒大概就是这个过程，当然某些病毒可能还没有相应的传代或者原代细胞，如果要分离就只能用易感动物了，操作都是相似的，无非都是采样、样品处理、接种、接种后检测观察、收集病毒而已。

上面说到的方法都是从动物组织中分离，当然如果不是组织，比如你要从粪便或者尿液或取的拭子上分离，则可直接将其用生理盐水、PBS或细胞培养液稀释（要尽量摇匀如果是拭子的话应多挤压摇匀）然后离心取上清过滤接种细胞就可以了。

昆虫神经毒素AaIT原核表达、纯化及抗体制备肖帅;廖雄辉;罗海燕;张树琴;李洪波【摘要】人工合成AaIT的成熟基因,连接到pET32载体并转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化重组AaIT蛋白并免疫小鼠,经蛋白质-G柱对抗血清进行纯化.研究结果表明,纯化得到了AaIT蛋白经免疫小鼠和纯化抗血清得到了特异性强的AaIT抗体蛋白.【期刊名称】《怀化学院学报》【年(卷),期】2016(035)011【总页数】4页(P60-63)【关键词】昆虫神经毒素;原核表达;抗血清;亲合纯化;抗体【作者】肖帅;廖雄辉;罗海燕;张树琴;李洪波【作者单位】怀化学院生物与食品工程学院,湖南怀化418008;怀化学院生物与食品工程学院,湖南怀化418008;怀化学院生物与食品工程学院,湖南怀化418008;怀化学院生物与食品工程学院,湖南怀化418008;怀化学院生物与食品工程学院,湖南怀化418008;怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室,湖南怀化418008【正文语种】中文【中图分类】Q786昆虫神经毒素是一类选择性作用于昆虫神经系统的多肽类毒素[1].这类昆虫专一性毒素的分子靶点是细胞膜表面的离子通道，已知高度特异的昆虫神经毒素最主要的分子靶点是钠离子通道.蝎子是昆虫神经毒素最主要的来源之，从蝎毒中分离的蝎长链昆虫神经毒素是一类选择性作用昆虫钠离子通道的毒素，这类毒素一般由60-70个氨基酸残基组成，通常包含2-4对分子内二硫键[2-4].AaIT是一种从北非蚶蝎Androctonus australis Hector毒腺中分离得到的高度选择性的昆虫神经毒素，能引起昆虫兴奋性神经中毒，该毒素作用位点是钠离子通道，也是目前研究得最多的一种昆虫神经毒素，已被应用于获得转基因抗虫植株和提高昆虫病毒的毒力[5-8].几纳克到几十纳克每克体重剂量的AaIT就能使翅目、双翅目、直翅目等昆虫在数分钟左右瘫痪甚至死亡[7，8]. AaIT是一种高效且专一的昆虫神经毒素，在农业害虫的防控上具有潜在应用价值.为了准确快速地检测AaI T，制备相应抗体非常必要.AaIT成熟蛋白的基因由上海生工合成并连接到pET32载体.表达用菌株BL21-codonplus（DE3）购自广州Invitrogen公司.镍亲和层析树脂购自Qiagen公司，酶标二抗体购自于CST公司，1 ml蛋白质-G预装柱购自GE公司.蛋白纯化设备为BIO-RAD Duoflow系统.其它化学试剂均为分析纯产品.2.1 目标蛋白的验证重组表达载体pET32/AaIT转化BL21-codonplus（DE3）表达菌株.随机挑取转化子数个，接种至LB（50 mg/LAmp）液体培养基中，37℃和IPTG条件下振荡培养至A600=0.6左右，加入终浓度为0.1 mMIPTG，37℃和200 rpm条件下诱导，诱导6 h后取菌液80 μl，加入20 μl 5×SDS-PAGE变性上样缓冲液，95℃变性5 min，SDS-PAGE分析重组蛋白的表达.2.2 目标蛋白的纯化取大肠杆菌转化子过夜培养的LB液体种子，1：100比例接种至100 ml液体培养基中，37℃、250 rpm培养至A600=0.6左右，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，37℃、200 rpm条件诱导6 h.根据精编分子生物学实验指南和文献报告的方法利用镍亲合层析柱对重组包涵体蛋白进行纯化[9，10].取不同咪唑浓度的蛋白洗脱液，加入DS-PAGE上样缓冲液、95℃变性5 min，15%SDS-PAGE分析检测.2.3 抗血清的制备及纯化从SDS-PAGE胶上将目标条带切下、磨碎并加入弗氏完全佐剂，腹腔注射雄性6周龄昆明小鼠，取免疫前血清为阴性对照.在第一次免疫后后每间隔2周左右加强免疫1次，于第2次加强免疫后的7-10天，抽取小鼠腹水.将纯化的10 μg/ml AaIT蛋白包被96孔酶标板，以不同释稀度的抗血清为一抗、HRP标记山羊抗兔IGg为二抗，间接ELISA法测定抗血清的效价.取效价最高的腹水，pH7.4 PBS稀释10倍，0.22 μm滤膜过滤，10倍柱体积的PBS平衡蛋白质-G纯化柱.以1ml/min的流速将腹水挂柱，100倍柱体积的pH5.0的0.1 MNaAC漂洗纯化柱后，0.1 M甘氨酸-HCl缓冲液（pH 2.4）洗脱、1 MTris中和并PBS透析，截留分子量10 kDa的超滤管浓缩蛋白.12%SDS-PAGE对纯化前后的抗体进行分析.2.4 纯化抗体特异性分析分别取未经诱导的转化子培养液菌体总蛋白、未经纯化的AaIT包涵体蛋白和经纯化的AaIT包涵体蛋白，SDS-PAGE后转膜，将纯化的抗体（1 mg/ml）稀释5000倍用作一抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗，对抗体的特异性进行迹分析.3.1 表达产物的验证随机挑取2个pET32空载体的BL21转化子和4个pET32/AaIT转化子，诱导表达前后总蛋白的SDS-PAGE结果如图1所示.pET32空载体BL21转化子N-端硫氧还蛋白（Trx）融合片段表达产物的理论分子量约18 kDa，即空载体转化子在IPTG诱导下，表达的Trx片段分子量约18 kDa；AaIT蛋白理论分子量约8 kDa，其N-端融合了Trx片段，AaIT/Trx融合蛋白分子量理论值为26 kDa左右.泳道1是未经IPTG诱导的pET32空载体BL21转化子总蛋白、泳道2是经IPTG诱导的pET32空载体BL21转化子总蛋白，说明在IPTG诱导下，空载体转化子实现了Trx片段的表达，分子量大小与理论相符约为18 kDa.未加入IPTG诱导的菌体总蛋白（泳道3）在26 kDa位置没有特异蛋白条带，而3株经IPTG诱导的转化子总蛋白（泳道4-6）在26 kDa有明显的目标条带（箭头所示），且特异表达蛋白的分子量与预期相符，说明重组AaIT在大肠杆菌中的实现了融合表达.3.2 重组蛋白纯化SDS-PAGE结果显示，含有100、200和300 mM咪唑的洗脱液可将重组AaIT 蛋白洗脱下来，在咪唑为300 mM时，洗脱的目标蛋白纯度最高，当咪唑浓度为400 mM时未见目标蛋白，说明在咪唑300 mM时目标蛋白已全被洗脱（图2所示）.以上电泳结果说明，镍亲合层析可以纯化AaIT包涵体蛋白.3.3 抗血清的制备及纯化经免疫小鼠，获得的最高滴度的抗血清效价达1：64000，将此血清用蛋白质-G 柱进行纯化，抗体蛋白的洗脱曲线如图3-A所示，经过漂洗液的漂洗后，0.1 M 甘氨酸-HCl缓冲液（pH 2.4）洗脱得到单一蛋白峰.将纯化前后的抗体进行SDS-PAGE分析，结果如图3-B所示，纯化前的血清在抗体重链50 kDa和轻链25 kDa处外还有大量杂蛋白（泳道1），尤其是在55-70 kDa处存在大量的血清白蛋白条带.而经过蛋白质-G柱纯化后，单一蛋白峰仅在抗体重链50 kDa和轻链25 kDa处有特异条带（泳道2），结果说明，利用蛋白质-G柱可以高效除去抗体以外的蛋白，从而实现对抗体的纯化.3.4 纯化抗体特异性分析未经诱导的转化子培养液菌体总蛋白、未经纯化的AaIT包涵体蛋白和经纯化的AaIT包涵体蛋白，SDS-PAGE分离后的考染结果如图4-A所示，未经纯化的AaIT包涵体蛋白除目标蛋白外还有很多杂蛋白条带（泳道1），未经诱导的转化子培养液菌体总蛋白除杂蛋白外没有目标蛋白条带（泳道2），经纯化的AaIT包涵体蛋白仅在目标位置处有蛋白条带（泳道3）.Western blot分析抗体的特异性的结果如图4-B所示，以稀释5000倍的抗体为一抗，未经诱导的转化子培养液菌体总蛋白未出现印迹条带（泳道2），纯化的AaIT包涵体蛋白（泳道1）和未经纯化的AaIT包涵体蛋白在目标位置（泳道3）均仅检测到目标蛋白条带，未经纯化的AaIT包涵体蛋白未出现明显非特异条带表明纯化的抗体具有很高的特异性. 昆虫毒素除了具有高度的昆虫选择性、瘫痪和致死剂量低，因此这类毒素在农业上有非常诱人的前景，目前已有不少利用昆虫神经毒素改造生物杀虫剂提升杀虫效果和将这类基因转入到植物中获得转基因植株的报告.而检测这类毒素最有效的方法之一就是利用抗体技术承包.制备多抗仍然是获得抗体的常用方法，而高质量多克隆抗体的制备需要高纯度的抗原，以基因工程手段制备重组蛋白并对蛋白质进行纯化，纯化的蛋白中常常含有杂蛋白，而杂蛋白除去往往非常困难，导致抗体的特异性受到影响.本研究将纯化的蛋白进行SDS-PAGE分离，再将目标蛋白连同胶一起切下，磨碎后免疫小鼠.经过SDS-PAGE后能将不同大小分子量的蛋白分开，切下的含目标条带具有很高纯度，保证了抗原的特异性，因此能获得高质量的多克隆抗血清.制备的抗血清利用亲合层析柱对抗体进行了纯化，结果表明，经过蛋白质-G 柱纯化后，得到了高纯度的抗体蛋白，该抗体能特异性检测AaIT重组蛋白.抗体的制备为AaIT的快速与准确检测打下了良好的前期基础.【相关文献】[1]Zlotkin E，Eitan M，Bindokas VP，et al.Functional duality and structural uniqueness of depressant insect-selective neurotoxins [J].Biochemistry，1991，30：4814-4821.[2]Possani LD，Becerril B，Delepierre M，et al.Scorpion toxins specific for Na+-channels.European Journal of Biochemistry[J]. 1999，264：287-300.[3]Rodríguez de la Vega RC，Possani LD.Overview of scorpion toxinsspecificforNaClchannelsandrelatedpeptides：biodiversity，structure-function relationships and evolution[J]. Toxicon，2005，46：831-844.[4]Zlotkin E，Fraenkel G，Miranda F，et al.The effect of scorpion venom on blowfly larvae：a newmethod for evaluation of scorpion venomtoxicity[J].Toxicon，1971，9：1-8.[5]伍宁丰，孙芹，姚斌，等.抗虫的转AaIT基因杨树的获得[J].生物工程学报，2000，16：129-132.[6]姚斌，范云六.表达昆虫特异性神经毒素AaIT基因的转基因烟草的抗虫性[J].生物工程学报，1996，2：113-118.[7]Liu SM，Li J，Zhu JQ，et al.Transgenic plants expressing the AaIT/GNA fusion protein show increased resistance and toxicity to both chewing and sucking pests[J].Insect Sci.，2016，23（2）：265-276.[8]Wang CS，St Leger RJ.A scorpion neurotoxin increases the potency of a fungal insecticide[J].Nat.Biotechnol.，2007，25（12）：1455-1456.[9]Li H，GaoX，Zhou Y，et al.Active and stable expression offusion Human C1q and tumor necrosis factor related protein 2（hCTRP2）in E.coli[J].Protein Expr.Purif.，2011，79（1）：1-6.[10]Frederick F M，Brent R，Kingston R E，et al.Short Protocols in Molecular Biology，5th Edition Books[M].John Wiley and Sons，Inc.，Publishers，2000：343-502.。

病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。

它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。

为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。

本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。

一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。

以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。

首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。

2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。

通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。

3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。

通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。

二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。

以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。

这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。

2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。

根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。

3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。

这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。

结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。

通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。

病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。

注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。

昆虫抗菌肽的分离纯化技术Technical standard for isolation and purification of insect antimicrobial peptides昆虫抗菌肽的分离纯化技术标准1范围本标准规定了昆虫抗菌肽的分离纯化技术要求，本标准以家蝇作为材料提纯血淋巴的抗菌肽。

本标准适用于以家蝇为材料的抗菌肽分离纯化，对于其他昆虫等作为材料纯化抗菌肽可参照执行。

本规程规定了抗菌肽的提取方法、Tricine-SDS-PAGE电泳、抗菌肽活性测定方法等技术要求。

本规程适用于抗菌肽的快速分离。

2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版本）适用于本文件。

GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》GB/T6682-2016《分析实验室用水规格和试验方法》GB4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定3术语下列术语和定义适用于本文件：3.1抗菌肽（antimicrobial peptides）抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）是一种基因编码的、在体内诱导的、具有抗菌活性的碱性多肽物质，强碱性、热稳定性、对细菌、真菌、病毒等微生物与寄生虫有抑杀活性。

某些抗菌肽还具有抑杀肿瘤、中和内毒素、促进伤口愈合、调节免疫等多种生物学功能。

3.2家蝇（Musca domestica）在25℃，相对湿度60%～70%的实验室内饲养家蝇，成蝇喂以白糖和奶粉，每日更换饮水。

幼虫以人工饲料（发酵麦麸）喂养。

3.3多肽（polypeptides）介于氨基酸与蛋白质之间，有2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。

3.4多肽活力（antimicrobial activity）抑制微生物的能力，以抑菌圈直径（mm）来表示。

一种简便快速提取和透析昆虫杆状病毒DNA的方法
孟小林
【期刊名称】《微生物学杂志》
【年(卷),期】1991(011)001
【摘要】经几次蔗糖梯度离心纯化的多角体病毒或颗粒体病毒,在
0.05MNa_2CO_3-0.01M EDTA-0.17M NaCl(pHl0.9)的碱解液中碱解之后,直接用苯酚抽提,乙醇沉淀DNA,DNA在照有透析膜的Enpendorf离心管内以TE缓冲液透析,这样提取的DNA用凝胶电胶检查仅为单一DNA带,其2600D/2800D的比值为1.82。

【总页数】2页(P56-57)
【作者】孟小林
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】Q93－33
【相关文献】
1.刺桫椤DNA的简便快速提取方法 [J], 王经源;黄儒珠
2.快速提取酵母线粒体DNA的简便方法 [J], Gargo.,A;柯永培
3.一种简便快速提取细菌质粒的方法改进 [J], 黄前川
4.高质量甘蔗基因组DNA的简便快速提取方法研究 [J], 黄东亮;覃肖良;廖青;高轶静;方锋学
5.用于PCR检测对虾皮下及造血组织坏死杆状病毒(HHNBV)的一种快速提取DNA方法 [J], 王馗;史成银;黄倢
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昆虫微生物分离方法
昆虫微生物分离方法主要包括以下步骤：
1. 选择适当的培养基：根据需要分离的微生物的特性，选择适合该微生物生长的培养基。

2. 采集昆虫样品：从昆虫体表、肠道等部位采集样品。

3. 制备昆虫微生物悬液：将采集的昆虫样品放入无菌的容器中，加入适量的无菌水或生理盐水，用玻璃棒搅拌均匀，制备成悬液。

4. 分离微生物：将悬液倒入适宜的培养基中，培养一段时间后，观察是否有微生物生长。

若微生物生长，则进行下一步纯化。

5. 纯化微生物：在分离出初步的微生物后，可以通过划线分离法、涂布分离法等方法进行纯化，使微生物的纯度提高。

6. 鉴定微生物：通过形态观察、生理生化实验、分子生物学等方法对分离得到的微生物进行鉴定，确定其种类和特性。

7. 保存微生物：将分离纯化得到的微生物在适宜的培养基中培养，并进行低温或冷冻保存，以备后续的研究或生产使用。

需要注意的是，昆虫体表的微生物种类和数量较多，分离过程需要注意无菌操作，避免污染。

同时，不同种类的昆虫可能携带不同的微生物，因此在进行昆虫微生物分离时，需要根据具体的昆虫种类和实验目的进行操作。

蝗虫dna的提取原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蝗虫是一种危害性极大的农业害虫，它们具有强大的食草能力，能够严重破坏农作物，给农民带来巨大的经济损失。

为了有效地控制蝗虫的数量，科研人员需要深入研究蝗虫的生物特性，其中蝗虫的DNA提取工作就显得尤为重要。

本文将介绍蝗虫DNA提取的原理及步骤，希望能对相关科研工作者提供帮助。

我们需要了解蝗虫DNA提取的原理。

蝗虫DNA提取的基本原理是通过破碎蝗虫细胞壁和细胞膜，释放出蝗虫细胞内的DNA，然后利用化学方法将DNA从其他细胞组分中进行分离和纯化。

DNA提取的关键在于破坏细胞结构，使得DNA能够尽可能地释放出来，并且保持其完整性，以确保后续实验的准确性和可靠性。

蝗虫DNA提取的步骤一般包括以下几个主要步骤：第一步，样品的准备。

首先需要收集蝗虫的样品，可以是完整的蝗虫体或者蝗虫的组织样品，比如蝗虫的头部、足部等。

样品的收集需要在无菌条件下进行，以避免外源性DNA的污染。

第二步，细胞破碎。

将收集的样品加入到含有细胞破碎液的离心管中，然后进行机械破碎或化学破碎的操作，以破坏蝗虫细胞的结构，释放出DNA。

机械破碎一般使用超声波破碎器或者高压均质机进行破碎，而化学破碎则可以利用酶或蛋白酶进行。

第三步，DNA的纯化。

将蝗虫细胞破碎液经过离心等操作，去除碎片和其他细胞组分，然后使用有机溶剂进行DNA的提取和纯化。

有机溶剂可以将DNA从其他细胞组分中分离出来，得到相对纯净的DNA样品。

第四步，DNA的沉淀和洗涤。

将纯化后的DNA溶液加入到加盐的醇溶液中，使得DNA沉淀出来，然后用醇洗和乙酸洗的操作来去除杂质和盐离子，最终得到纯净的DNA沉淀。

第五步，DNA的溶解和保存。

将DNA沉淀用适当的缓冲液进行溶解，然后进行质量和浓度的检测，最后可以将DNA样品保存在-20℃或更低的温度下，以确保DNA的稳定性和保持其完整性。

通过以上步骤，我们可以比较完整地提取出蝗虫的DNA样品，然后可以进行后续的PCR扩增、测序、基因克隆等实验操作，以深入研究蝗虫的遗传特性和生物学特性，为蝗虫的防治和控制提供科学依据。

收稿日期：2022-03-12基金项目： 广东省地方畜禽品种保护与利用促进项目（2018-143）；国家自然科学基金项目（31860686）作者简介：费世港，男，硕士，主要从事昆虫病毒研究通信作者：孙京臣，E-mail：*************.cn ·研究论文·CSBV 的分离鉴定及其感染幼虫后的应答反应摘 要：本研究旨在为了解江西某蜂场蜜蜂是否感染中蜂囊状幼虫病病毒（CSBV ）并探究CSBV 感染中蜂幼虫后的应答反应。

采集该蜂场疑似感染CSBV 的蜜蜂，采用RT-PCR 的方法检测CSBV 核酸，取阳性的蜜蜂样品进行病毒分离纯化、电镜观察及测序。

将纯化鉴定后的CSBV 对3日龄的中蜂幼虫进行人工感染，进行转录组测序，分析中蜂幼虫感染CSBV 的应答反应。

通过RT-PCR 验证和电镜观察成功鉴定CSBV ，并命名为CSBV-JX 。

CSBV-JX 电镜观察直径为25～30 nm 。

对其进行分段扩增测序，发现基因组序列为8781 bp ，对其进行系统发育分析，表明东方蜜蜂的SBV （AcSBV ）与西方蜜蜂的SBV （AmSBV ）明显分为两个分支，具有较强的地域分化性。

转录组测序分析发现，中蜂幼虫在感染CSBV-JX 后2 h 有59个基因上调表达，83个基因下调表达；感染后12 h 有68个基因上调表达，86个基因下调表达。

本研究成功分离鉴定一株中蜂囊状幼虫病毒并命名为CSBV-JX 。

同时对CSBV-JX 感染中蜂幼虫的转录组学分析发现，CSBV-JX 感染2 h 和12 h 引起宿主的响应较小，这可能是CSBV-JX 感染的2 h 和12 h 为病毒增殖的早期阶段病毒载量低，引起的宿主免疫响应小所导致。

在CSBV-JX 感染中蜂幼虫的2 h 和12 h 期间引起的差异基因与代谢通路关联较大，研究结果为阐明解析CSBV 感染中蜂的分子机制提供了基础。

关键词：中蜂囊状幼虫病毒；分离鉴定；系统发育分析；转录组学中图分类号：S895.133文献标志码： A文章编号：1674-6422（2024）02-0089-08Isolation and Characterization of Chinese Sacbrood Bee Virusand ExperimentalInfection in LarvaeFEI Shigang 1, LIU Heyong 1, WANG Yeyuan 1, FENG Min 1, WANG Zilong 2, SUN Jingchen 1(1. College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. Bee Research Institute, Jiangxi AgriculturalUniversity, Nanchang 330045, China)费世港1，刘合永1，王叶元1，冯 敏1，王子龙2，孙京臣1（1.华南农业大学动物科学学院，广州510642；2.江西农业大学蜜蜂研究所，南昌330045）Abstract: The objectives of the present study were to investigate whether the bees on an apiary were infected with Chinese Sacbrood bee virus (CSBV) and to explore the infection features in Apis cerana. The bees suspected to be infected with CSBV were collected from the apiary and the presence of CSBV nucleic acid was examined by RT-PCR. The positive bee samples were collected for virus isolation and purifi cation, electron microscope observation and sequencing. Three-day-old Apis cerana were experimentally infected with the purifi ed and identifi ed CSBV and transcriptome sequencing was performed to analyze the infection features of Apis cerana. As a result, a CSBV-JX strain was isolated and identifi ed through RT-PCR and electron microscope observation. T he diameter of CSBV-JX was observed by an electron microscope to be 25-30 nm. The CSBV-JX was amplifi ed and sequenced in segments and the genome sequence was found to be 8781 bp. Phylogenetic analysis showed that the SBV of the Apis cerana (AcSBV) and the SBV of the Apis mellifera (AmSBV) were divided into two branches with solid regional diff erence. Transcriptome sequencing analysis revealed that 59 genes were up-regulatedChinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2024,32(2):89-96· 90 ·中国动物传染病学报2024年4月蜜蜂作为一种重要的授粉昆虫，全球约三分之一的特色农作物需要蜜粉进行授粉，其不仅对农业生产有益，且是生态环境平衡不可或缺的[1]。

14.2 His 标签蛋白表达纯化1、把His 标签蛋白表达质粒，进行转化，转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中，冰上放置30min，加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h，然后涂板，于37℃培养箱中进行过夜培养。

2、第二天，小心地挑取培养菌落中的单克隆，加入到10mL 的加有适当抗性的LB液体培养基中，放在37℃的摇床中培养过夜。

3、把过夜培养的菌液倒入800mL 加有适当抗性的LB 液体培养基中，于37℃摇床中摇到大约OD600 值在0.6～0.8 之间，就可以拿出，把菌液放置于4℃冷却菌液20～30min。

4、在超净台中，加入诱导剂IPTG 至终浓度0.1mM，诱导蛋白表达，于18℃摇床中培养6-8h。

5、诱导完成以后，8000 rpm 离心10min，沉淀收集菌体。

6、在沉淀后的细菌菌体中，加入lysis buffer（10 mM 咪唑，300 mM NaCl，50 mMNaH2PO4，用NaOH 调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂）中重悬，1g 湿重的菌体沉淀用5mL 的裂解缓冲液，进行超声破碎，然后12000rpm 离心20min，离心后取上清。

7、在上清中加入1 mL Ni-NTA beads 到4 mL 裂解液中，于4℃冰箱中轻轻地混合60 min 左右。

8、加入4 mL 的wash buffer（300 mM NaCl，20 mM 咪唑，50 mM NaH2PO4，用NaOH 调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂），在冰上洗4 次，每次孵育10min。

9、加入elution buffer（250 mM 咪唑，300 mM NaCl，50 mM NaH2PO4，用NaOH调节pH 值至8.0，蛋白酶抑制剂）洗脱重组蛋白4 次，每次用500μl。

14.3 GST 融合蛋白的表达与纯化1、把GST 标签蛋白表达质粒，进行转化，转到大肠杆菌的感受态细胞BL21 中，冰上放置30min，加入新鲜的LB 培养基孵育大约1h，然后涂板，于37℃培养箱中进行过夜培养。