DNA重组的载体简介

DNA重组的原理
DNA重组是一种实验技术，用于将来自不同来源的DNA片段重新组合在一起形成新的DNA分子。

它的原理基于DNA的
双链结构和其特有的互补碱基配对规则。

首先，需要获取来自不同来源的DNA片段。

这些片段可以来
自同一生物体的不同基因，也可以来自不同生物体的DNA。

每个DNA片段都有自己特定的基因序列。

接下来，将目标DNA片段和载体DNA准备好。

载体DNA是
一个可以自我复制的DNA分子，常用的载体有质粒和噬菌体。

目标DNA片段和载体DNA都需要进行酶切，使用特定的限
制酶将它们切割成互补的DNA末端。

然后，将目标DNA片段和载体DNA连接在一起。

这一步需
要使用DNA连接酶，将目标DNA片段和载体DNA的互补末
端连接起来，形成一个新的DNA分子。

连接的过程中会形成
磷酸二酯键。

最后，将重组后的DNA分子导入宿主细胞中。

这可以通过转
化或转染的方法实现。

宿主细胞会接受重组后的DNA，并将
其复制和传递给子细胞，从而产生大量拥有重组DNA的细胞。

通过DNA重组，可以将不同基因或DNA片段组合在一起，
创建新的DNA分子。

这项技术被广泛应用于基因工程、遗传
学研究以及生物制药等领域。

DNA重组技术的基本工具DNA重组技术是一种重要的分子生物学技术，用于改变基因组中的DNA序列，使之具有特定的功能。

这项技术的应用范围广泛，可以在基础研究、医学诊断、药物开发等领域发挥重要作用。

DNA重组技术的基本工具包括DNA片段的制备、限制性内切酶、DNA连接酶、质粒和载体等。

首先，DNA片段的制备是DNA重组技术的第一步。

通过PCR（聚合酶链反应）或限制性内切酶切割，可以从某个DNA源中获取特定的DNA片段。

PCR是一种体外扩增技术，可以将特定的DNA序列进行快速放大。

限制性内切酶是一类特殊的酶，可以识别特定的DNA序列并在该序列上切割DNA链。

通过PCR和限制性内切酶的组合应用，可以制备出需要的DNA片段。

其次，限制性内切酶是DNA重组技术中的重要工具之一。

限制性内切酶可以特异性地切割DNA链，并产生一定的粘性或平滑的DNA末端。

这些末端的特性决定了DNA片段连接的方式。

常用的限制性内切酶有EcoRI、BamHI、HindIII等。

当两个DNA片段具有相同的限制性内切酶切割位点时，它们可以通过限制性内切酶的连接来形成一个新的DNA分子。

接下来，DNA连接酶也是DNA重组技术中必不可少的工具之一。

DNA连接酶能够将两个DNA片段在适当的条件下连接在一起。

常用的DNA连接酶有T4 DNA连接酶和DNA聚合酶。

通过合适的实验条件和适当的连接酶，可以使两个DNA片段有效地连接成为一个整体。

此外，质粒和载体也是DNA重组技术中的重要工具。

质粒是一种小环状DNA分子，在细菌细胞中存在，并能自我复制。

载体则是质粒或其他DNA分子，用于携带所需的DNA片段。

通过将需要插入的DNA片段连接到载体上的限制性内切酶切割位点上，并将该载体转化至宿主细胞中，就可以实现外源DNA的导入。

在实际应用中，DNA重组技术的基本工具往往是共同配合使用的。

通过PCR或限制性内切酶的组合，可以制备出所需的DNA片段；通过限制性内切酶的连接和DNA连接酶的应用，可以将不同的DNA片段连接起来形成一个新的DNA分子；通过质粒和载体的应用，可以将需要插入的DNA片段导入到宿主细胞中实现转化。

dna重组的基本类型及特点
DNA重组是指通过改变DNA分子的序列和组合方式，创造新的DNA 分子的过程。

它是生物学中一种重要的基因工程技术，经过多年的发展和完善，已经成为人类改造生命的重要手段之一。

DNA重组的基本类型包括：基因克隆、DNA片段重组、基因修饰
和转基因技术。

其中，基因克隆是指将一个完整的基因拷贝到另一个载体上，形成一个新的DNA分子；DNA片段重组是指将多个DNA片段重新组合，形成一个新的DNA序列；基因修饰是指对已有的基因进行改造，使其表达方式或功能得到优化；转基因技术是一种通过将外源基因嵌入到宿主细胞中，使其表达而获得新的性状或功能的技术。

DNA重组的特点包括：高效、精准和可控性强。

通过DNA重组技术，科学家们可以针对特定的基因或DNA序列进行精确的改造和修饰，使其表达方式或功能得到优化。

此外，DNA重组技术具有高度的可控性，可以控制新的DNA分子在宿主细胞中的表达和功能，为人类创造出更多的生物医药、农业和工业应用奠定了基础。

总之，DNA重组技术是一种非常重要的基因工程技术，具有基因克隆、DNA片段重组、基因修饰和转基因技术等多种形式。

它具有高效、精准和可控性强等特点，已经成为人类改造生命的重要手段之一。

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重组dna技术的三大基本元件
重组DNA技术是一种基因工程技术，是用来改变或修饰DNA序列的技术。

它主要由三大基本元件组成：
酶：重组DNA技术中使用的酶主要有限制性内切酶和连接酶。

限制性内切酶能够在特定位置将DNA片段切开，而连接酶则能够将被切开的DNA片段连接在一起。

载体：载体是用来携带重组DNA片段的载体,常见载体有质粒, 条件克隆质粒, 人造chromosome, 以及转基因植物,动物等。

特异性识别元件：特异性识别元件是用来识别目标DNA序列的元件，如引物和探针等。

这些元件能够特异性地识别目标DNA序列,使得重组DNA片段能够高效地插入到目标DNA序列中。

DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组的载体-3在作为载体时，这些噬菌体有一个很大的优点，即克隆到M13mp载体的外源DNA片段（双链），在子代噬菌体便成为了单链形式。

故应用M13mp进行克隆，可方便地分离到大量含有外源DNA某一单链的DNA分子。

这种单链DNA可在下列工作中作模板：①主要用作双脱氧链终止法进行DNA序列测定的模板；②制备仅有一条链得到放射性标记的杂交用DNA探针；③利用寡核苷酸进行定点诱变。

M13mp18/M13mp19三、真核细胞的克隆载体无论是原核还是真核系统的基因克隆载体，作为载体都应具备三个相似的基本条件，即具备在宿主中进行复制的复制信号、适当的单一酶切位点和方便的选择标记。

在原核载体的基础上进行适当的改造，可构建出带有真核细胞复制信号的穿梭载体，使之能在真核系统中扩增。

若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核表达载体，能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因。

为了鉴定和获得阳性转染细胞株，真核系统载体还必需具备适当的筛选标记。

一种筛选标记是，使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补（如TK基因产物）。

另一种普遍使用的是抗新霉素基因。

真核系统载体种类很多，各具特色和用途，并且正在不断被改进、完善，我们仅举例简要介绍。

㈠ SV40（猿猴病毒）载体SV40基因组为约5.2kb的双链DNA分子，碱基顺序已完全清楚，且对其生活习性和各基因的调控也有较深的了解。

同其他哺乳动物的DNA病毒一样，SV40能在细胞中形成较高的拷贝数并具有强大功能的启动子。

因此，当今许多真核表达载体中的调控元件大都取材于SV40的调控顺序和复制信号。

一般以取代方式构建SV40重组子，天然SV40中能插入2.5kb的外源DNA片段。

用SV40作为载体有两种方式：①用SV40 DNA 与外源DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒；②重组子不包装成病毒颗粒，而象质粒一样在细胞中复制或整合到染色体组中。

生物化学丨重组DNA技术医学联络官Medical Liaison officer Club重组DNA技术是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA 的一类内切酶。

限制性核酸内切酶可以把DNA切成长度不同的片段，是重组DNA中重要的工具酶。

（三）目的基因应用DNA重组技术的目的：分离、获取某一感兴趣的基因或DNA序列；获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）。

这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。

即纯化的特定基因（靶基因）。

基因载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达的有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

在重组DNA中常用的载体包括质粒DNA、噬菌体DNA、柯斯质粒载体（粘粒）、病毒DNA和人工染色体等类型。

基因工程基本原理（一）目的基因的获取目的基因主要有以下几种来源：1.cDNA文库以mRNA做模板通过反转录的方式获得的DNA。

2.基因组DNA文库用限制性内切酶切割组织或细胞染色体，得到所需DNA基因片断。

3.聚合酶链式反应（PCR）用体外快速扩增方法得到所需目的基因。

4.化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列用DNA合成仪合成。

（二）克隆载体的选择克隆载体的选择的标准：①能自主复制；②具有两个以上的遗传标记物便于重组体的筛选和鉴定；③有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；④分子量小，以容纳较大的外源DNA。

（三）外源基因与载体的连接目的基因与载体DNA片段连接成一个完整的重组体分子。

1.粘性末端连接。

2.平端连接。

限制性内切酶切割产生的平端、粘端补齐或切平形成的平端。

4.人工接头连接。

由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

外源重组DNA导入宿主细胞后，首要任务是要筛选含有目的基因的转化菌并加以扩增。

抗药性标记选择是筛选重组体最常用的方法。

免疫学方法特异性强、灵敏度高，尤其适宜于筛选无任何选择标志的基因。

DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组的载体-2二、噬菌体载体作为细菌寄生物的噬菌体，大多数具有编码多种蛋白质的基因，能利用宿主细胞的蛋白质合成体系，进行生长和增殖。

构建的噬菌体载体，以λ噬菌体、M13和粘粒最为常用。

㈠λ噬菌体载体野生型λDNA是一种基因组为4.8 kb的线性双链DNA，全部序列已知，共编码50多个基因。

其中约一半基因参与了噬菌体的生命周期活动，称为必需基因；另一部分基因，当被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能。

另外，在分子两端各有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，称cos位点。

野生型的λ噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体，即既能进入溶菌性生命周期又能进入溶源性生命周期。

λ噬菌体感染细菌后，λDNA通过粘性末端而环化。

既可溶菌性生长（裂解），即λDNA在宿主中多次复制并合成大量基因产物，装配成噬菌体颗粒，最后裂解宿主菌；又可以溶源性生长，即λDNA整合到宿主染色体基因组D NA中，与之一起复制并遗传给子代，但宿主细胞不被裂解。

裂解途径和溶源途径的选择取决于宿主与噬菌体之间的许多因素的相互作用，以及噬菌体基因组的精确调控。

λ噬菌体具有二个重要特征，使之成为一类重要的、很有价值的基因克隆载体。

①除必需基因外的功能相关（溶源生长和重组）基因成簇排列在一起位于中间部分，约占全基因组的30%，不是溶菌生长所必需的。

因此，该区可缺失或作外源DNA的插入区。

②噬菌体颗粒成熟的包装过程（外壳蛋白包装DNA），只要重组DNA不小于野生型λDNA全长75%和大于105%，均可被包装成具有噬菌体活性的成熟颗粒。

因此大约可插入长达15kb的外源DNA。

当外源DNA片段克隆到插入型载体上，噬菌体便丧失某些生物学功能，即插入失活效应。

又可分为免疫功能失活的和β-半乳糖苷酶失活的两种亚型。

①免疫功能失活的插入型载体。

插入位点位于基因组中的免疫编码区，外源DNA片段插入后，就会使载体合成阻遏蛋白的能力被破坏，导致不能进入溶源生长周期。

第五章DNA重组技术DNA重组技术是指在体外将目的DNA片段与质粒（plasmid）等能够自主复制的载体（vector）连接形成重组DNA分子，再导入合适的受体细胞。

由于重组DNA可以在受体细胞中复制，目的DNA片段同时也可以扩增获得大量拷贝，因此这项技术也被称为分子克隆（molecluar cloning）。

与PCR技术相比，通过分子克隆得到的拷贝错误率更低，并且获得重组DNA的受体细胞可以无限传代，目的片段可以更长久的保存，并能进行筛选、突变、融合、序列分析等一系列基因操作。

此外，如果载体在插入目的基因的区域具有合适的启动子、核糖体结合位点、转录终止子等序列，目的DNA片段所含基因还有可能能在受体细胞中大量表达，获得目的蛋白或其它表达产物。

通过DNA重组技术表达的蛋白又称为重组蛋白。

目前，DNA重组技术在基础研究、基因诊断、生物制药、基因治疗等方面都得到广泛的应用。

第一节DNA重组技术的常用工具酶在DNA重组技术中，需要利用一些酶来对基因进行操作，我们可以把这些酶称为工具酶。

工具酶的用途涵盖DNA重组技术的各个方面，包括目的DNA的获得、DNA的切割、片段的连接等。

一、目的DNA获得相关工具酶在DNA重组技术中，目的DNA的获得有多种方法。

其中通过酶扩增来获得是重要的一类方法，其中需要多种工具酶。

（一）Klenow片段Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，是DNA聚合酶I通过木瓜蛋白酶部分水解得到的大片段，保留了DNA聚合酶I的5’-3’的聚合和3’-5’的核酸外切酶的活性，去除了5’-3’的核酸外切酶活性。

Klenow片段可用于在体外扩增DNA片段。

由于其具有3’-5’的核酸外切酶活性，因此可以校正聚合中可能出现的错误，具有一定的保真性。

但由于其不耐热，聚合活性弱，在体外合成DNA的效率较低，随着PCR技术的发展，Klenow片段的应用已日趋减少。

现主要用于DNA双链末端的补齐和标记操作。