【CN110004138A】固定化酶及其制备方法【专利】

固定化酶的化学制备方法固定化酶是指将酶在一定条件下固定在某种多肽或多糖材料中，使其具有较高的稳定性和重复使用性。

固定化酶制备方法有很多种，下面就简单介绍一下常用的几种方法。

第一种是物理固定化法。

这种方法是通过将酶分子与载体材料表面的静电作用、氢键作用等力量结合在一起，从而实现酶的固定化。

常用的物理固定化方法包括吸附、沉淀、共价键等把酶与载体结合在一起。

吸附法是一种较简便、经济的酶固定化方法，但稳定性较差，适用于临时使用。

沉淀法是一种先定制载体材料，再将酶溶液与载体材料混合沉淀制成的固定化方法，能增强酶的稳定性。

共价键法则通过选择适当的交联剂将酶与载体基质之间形成强化学键，形成高度稳定的固定化酶。

第二种是化学固定化法。

这种方法是以某种化学反应方式将酶与载体结合，常见的方法有选择性基团反应和交联剂交联反应两种方法。

选择性基团反应是先在载体表面引入一些特定的官能团，再通过这些官能团再将酶基质固定在载体上，这种方式可以提高酶的活性和稳定性。

交联剂交联反应则是将酶与载体结合的过程中，通过交联剂，形成交联的结构，这种方法稳定性较高、经济实用，但固定化酶的活性较低，不适用于活性较高的酶。

第三种是生物固定化法。

生物固定化法是通过生物体系的作用将酶基质固定在载体材料上，这种方式主要适用于多肽、多糖等含有复杂生物结构的材料。

这种方法优点是酶的活性和特异性较高，但固定化酶的稳定性一般较差。

以上三种方法都可以用来制备固定化酶，不同的固定化方法适用于不同的酶类型、活性、载体材料等。

在实际制备过程中，需要根据实际情况选取相应的方法，以获得稳定和活性高的固定化酶。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810191556.1(22)申请日 2018.03.08(71)申请人 中国海洋大学地址 266100 山东省青岛市崂山区松岭路238号(72)发明人 毛相朝　黄文灿　薛长湖　(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司11332代理人 巩克栋(51)Int.Cl.C12N 11/10(2006.01)C12N 11/14(2006.01)(54)发明名称一种固定化酶及其制备方法(57)摘要本发明涉及一种固定化酶及其制备方法，其以甲壳素纳米纤维为载体，所述酶通过共价连接固定在该载体上；其中，所述甲壳素纳米纤维的羟基氧化为羧酸基团，用于酶与所述甲壳素纳米纤维的共价连接。

本发明通过将甲壳素纳米纤维的羟基氧化为羧酸基团，从而使得酶可以通过羧酸基团进行共价连接，从而固定在载体上，辅助用交联剂进一步固定所述酶，两种方法配合，使得酶的固定量进一步增大，酶的稳定性提高，还提高了酶的催化效率。

权利要求书2页 说明书9页CN 110241109 A 2019.09.17C N 110241109A1.一种固定化酶，其特征在于，其以甲壳素纳米纤维为载体，所述酶通过共价连接固定在该载体上；其中，所述甲壳素纳米纤维的羟基氧化为羧酸基团，用于酶与所述甲壳素纳米纤维的共价连接。

2.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述甲壳素纳米纤维的C6上的伯羟基氧化为羧酸基团；优选地，所述甲壳素纳米纤维的长度为30-300nm，优选为50-200nm；优选地，所述酶为糜蛋白酶、α琼胶酶、β琼胶酶、磷脂酶D、脂肪酶或虾青素酯酶中的任意一种或至少两种的组合。

3.根据权利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于，所述载体上还修饰有氨基化的磁性纳米材料；优选地，所述磁性纳米材料为氨基功能化四氧化三铁、氧化硅或氧化铝中的任意一种或至少两种的组合，优选为四氧化三铁；优选地，所述酶还通过交联作用与所述甲壳素纳米纤维载体相连；优选地，所述交联通过交联剂戊二醛实现。

专利名称：一种可重复利用的固定化酶制备方法及其应用专利类型：发明专利
发明人：游力军,丁冠军,施鑫明
申请号：CN202110024689.1
申请日：20210108
公开号：CN112574983A
公开日：
20210330
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种可重复的固定化酶制备方法及其应用，属于生物催化领域。

本发明将聚乙烯亚胺交联接枝到壳聚糖上形成磁性三元网络互穿复合物，制备得到表面富氨基的磁性复合材料，将其固定化辣根过氧化物酶用于降解酚类污染物；该材料合成过程设计合理，磁性多孔结构与材料表面的高密度氨基官能团于一体，有效提高固定化酶的活性和重复利用能力。

此外，固定化之后的辣根过氧化物酶应用于污水中酚类化合物的处理，制备的固定化酶对苯酚降解速率明显高于游离酶和载体。

申请人：福州大学
地址：350108 福建省福州市闽侯县福州大学城乌龙江北大道2号福州大学
国籍：CN
代理机构：福州元创专利商标代理有限公司
更多信息请下载全文后查看。

固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。

只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。

是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。

常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。

离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。

最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。

离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。

影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。

2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。

3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。

4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。

5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。

6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。

多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。

吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。

吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。

（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。

(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。

固定化酶制备及酶活力测定实验者张玲玲绿药1班[1**********]6 同组者金雨馨、管青青实验日期2015/3/13 报告完成日期2015/3/20实验指导易喻摘要酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。

酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。

本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。

结果表明固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。

关键词固定化酶酶活力包埋法AbstractEnzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. Inthis article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity.前言酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。

专利名称：一种固定化酶载体材料及其制备方法与应用专利类型：发明专利
发明人：苏海佳,张泽福,赵怡琳,王耀强,李子柔
申请号：CN201910459981.9
申请日：20190529
公开号：CN112011532A
公开日：
20201201
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种固定化酶载体材料，该载体材料由片层石墨烯包裹纳米花状磁性纳米球构成，具有较大比表面积，其无毒无害、对酶结合量大、结合稳定、对酶活力影响小、能够较好地维护酶分子空间构象，且适用范围广。

本发明还涉及上述固定化酶载体材料的制备方法，采用该方法能够成功制备具有上述优良性能的酶载体材料。

将上述固定化酶载体材料用于制备固定化碳酸酐酶，所制得的固定化碳酸酐酶酶活力较高，稳定性好，能够应用于工业生产，降低生物酶使用成本。

申请人：北京化工大学
地址：100029 北京市朝阳区北三环东路15号
国籍：CN
代理机构：北京睿邦知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：方莉
更多信息请下载全文后查看。

专利名称：固定化生物酶及制备方法
专利类型：发明专利
发明人：来文庆,袭著革,林本成,张伟,田蕾,闫峻,边立平,刘焕亮,李康
申请号：CN201911333092.4
申请日：20191220
公开号：CN111172148A
公开日：
20200519
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种固定化生物酶及制备方法，其中，制备方法包括如下步骤：(1)分散：将氧化石墨烯分散于PBS中得到氧化石墨烯分散液；(2)氨基化石墨烯：将分散液加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基丁二酰亚胺，再加入氨基化试剂，使氧化石墨烯表面氨基化，得到氨基化氧化石墨烯分散液；(3)固定化：将氨基化氧化石墨烯分散液离心，得到氨基化氧化石墨烯，将所述的氨基化氧化石墨烯分散均匀后加入戊二醛，向其中加入生物酶水溶液，共价固定氧化石墨烯表面的生物酶，洗涤，干燥，得到固定化生物酶。

本发明的固定化生物酶粒径均一，对高温，强酸强碱稳定性较好。

申请人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
地址：300050 天津市和平区大理道1号
国籍：CN
代理机构：北京丰浩知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：李学康
更多信息请下载全文后查看。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711186695.7(22)申请日 2017.11.24(71)申请人 宁夏乙征生物工程有限公司地址 755000 宁夏回族自治区中卫市沙坡头区美利工业园区(72)发明人 苏二正　杨猛　孙伊伊　陈龙　(51)Int.Cl.C12N 11/14(2006.01)C12N 11/12(2006.01)C12N 11/08(2006.01)C12N 11/04(2006.01)(54)发明名称一种固定化酶的制备方法(57)摘要本发明公开了一种吸附—覆膜联合固定化酶的制备方法，其制备包括以下步骤：(1)将酶溶解于缓冲液中制成酶溶液，并与吸附材料混合，振荡吸附一定时间，滤出，得到吸附固定化酶；(2)将覆膜保护剂溶解于缓冲液中制成保护剂溶液，将吸附固定化酶置于保护剂溶液中，振荡处理一定时间，滤出沥干，得到保护剂处理过的吸附固定化酶；(3)将覆膜材料溶解在溶剂中制成覆膜溶液，将保护剂处理过的吸附固定化酶与覆膜溶液混合，振荡覆膜一定时间，滤出干燥；(4)最后，用去离子水或缓冲液冲洗后得吸附—覆膜联合固定化酶。

本发明吸附、覆膜过程条件温和，酶活回收率高，固定化酶的稳定性高，操作简单、成本低。

权利要求书2页 说明书9页 附图5页CN 107893065 A 2018.04.10C N 107893065A1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将酶溶解于缓冲液中制成酶溶液，并与吸附材料混合，振荡吸附一定时间，滤出，得到吸附固定化酶；(2)将覆膜保护剂溶解于缓冲液中制成保护剂溶液，将吸附固定化酶置于保护剂溶液中，振荡处理一定时间，滤出沥干，得到保护剂处理过的吸附固定化酶；(3)将覆膜材料溶解在溶剂中制成覆膜溶液，将保护剂处理过的吸附固定化酶与覆膜溶液混合，振荡覆膜一定时间，滤出干燥；(4)最后，用去离子水或缓冲液冲洗后得到吸附—覆膜联合固定化酶。

专利名称：一种固定化酶及制备方法
专利类型：发明专利
发明人：吴松海,臧金金,任海涛,韩煦,刘勇申请号：CN201210537509.0
申请日：20121212
公开号：CN103013971A
公开日：
20130403
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种固定化酶的制备方法，步骤为：(1)将聚乙烯醇加入水中，搅拌下，加入APTES，再滴加盐酸水溶液，搅拌，得到改性聚乙烯醇的溶液；(2)将改性聚乙烯醇溶液与壳聚糖溶液混合，搅拌，抽真空除去溶液中的气泡，得到均相的混合液，滴于氢氧化钠溶液中，固化，用蒸馏水洗至中性，过滤，得到复合小球载体；(3)将复合小球载体置于戊二醛-缓冲液溶液中，震荡活化得到活化后的载体小球；(4)将活化后的载体小球置于酶-缓冲液溶液中，震荡，得到的固定化酶小球；本发明的方法制备的固定化酶酶活高，热稳定性、重复使用性很好。

在重复使用9次后，还能够保留80%以上的初始酶活。

而且固定化酶颗粒直径有3-4mm，便于分离。

申请人：天津大学
地址：300072 天津市南开区卫津路92号
国籍：CN
代理机构：天津市北洋有限责任专利代理事务所
代理人：陆艺
更多信息请下载全文后查看。

专利名称：制备固定化酶的方法及固定化酶和茶渣的用途专利类型：发明专利
发明人：祁峰,黄建忠,晋豆,罗艺献,杨金花,顾苏宜,苏愉
申请号：CN202110156497.6
申请日：20210204
公开号：CN112831490A
公开日：
20210525
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种制备固定化酶的方法及固定化酶和茶渣的用途。

该方法包括如下步骤：称取0.05～0.1g的茶渣，粉碎，过筛，收集粒径均一的茶渣；将处理后的茶渣用有机溶剂浸润，并超声波处理1～6h，离心后一次烘干，再用10～20g/L的山梨醇溶液浸润6～10h，二次烘干；向处理后的茶渣中加入浓度为0.5wt％～1.5wt％的交联剂150～300μL，一次孵育1～5h，洗涤、烘干，再加入30～100μL的酶液，二次孵育5～10h，洗涤、烘干，即得固定化酶。

本发明的方法以茶渣作为固定化酶载体，充分利用茶渣资源，且制备的固定化酶重复利用率高。

申请人：福建师范大学
地址：350007 福建省福州市仓山区上三路8号
国籍：CN
代理机构：北京悦成知识产权代理事务所(普通合伙)
更多信息请下载全文后查看。