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精氨酸的免疫机制及其在动物生产中的应用王庆争;王尚圣;谢晓红;雷岷;郭志强;李周权【摘要】精氨酸广泛存在于动物组织细胞内,不仅具有营养的作用,而且还具有复杂的免疫功能.目前发现精氨酸的免疫机制主要包括:ARG-1催化L-Arg产生鸟氨酸和尿素,鸟氨酸转化成多胺来调节细胞增殖和创伤愈合;iNOS催化L-Arg生成NO,是多种免疫调节的信号分子;L-Arg能够促进激素的分泌,特别是生长激素,进而提高机体免疫能力;L-Arg能够促进多种免疫细胞因子的产生,来调节免疫过程以及精氨酸能够促进T细胞的增殖和成熟等.本文就精氨酸的免疫机制以及在动物中的应用进行综述,以期为精氨酸免疫机制的研究提供参考.%Arginine is widely found in the cells of animal tissues and it has not only nutrition function, but also has complex immunity function.At present,the immune mechanism of arginine discovery mainly includes:Arginine catalyzes the production of urea and ornithine by arginase,and then the ornithine is converted into polyamines to modulate cell proliferation and wound healing.iNOS catalyzes the production of NO by arginine,and NO is the signal of many kinds of immune regulation.Arginine can promote the secretion of hormones,especially the growth hormone,which can accelerate the response of immune function. Arginine can promote the production of a variety of immune cytokines to regulate immune processes.In order to provide reference significance for arginine in immune research,the immune mechanism of arginine and the applications of arginine in the animals were reviewed in this paper.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2018(000)001【总页数】6页(P49-54)【关键词】精氨酸;免疫;机制;动物【作者】王庆争;王尚圣;谢晓红;雷岷;郭志强;李周权【作者单位】西南大学,重庆北碚400715;四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室,四川成都610066;山东省沂南县畜牧兽医局经济开发区畜牧兽医站,山东沂南276033;四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室,四川成都610066;四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室,四川成都610066;四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室,四川成都610066;西南大学,重庆北碚400715【正文语种】中文【中图分类】S816.71886年，Schlus从植物羽扇豆苗中分离提取到精氨酸；1895年，Hedin在哺乳动物的蛋白质中发现了精氨酸；到了20世纪初，精氨酸的分子结构已经清楚并且能够人工合成（孙红暖等，2014）。
激酶入核的条件
激酶入核是指激酶分子从胞质进入细胞核的过程。
激酶入核对于细胞信号传递和基因调控起着重要作用。
1.核定位信号（NLS）：激酶蛋白通常通过核定位信号（NLS）来进入细胞核。
核定位信号是一段氨基酸序列，可以被核定位蛋白（例如importin家族蛋白）识别和结合，从而促进激酶进入细胞核。
核定位信号通常包含正电荷氨基酸，如赖氨酸（lysine）和精氨酸（arginine），并呈现出一定的序列特征。
2.激酶激活状态：激酶进入细胞核通常需要处于激活状态。
激活的激酶可能与其他蛋白质或结构分子相互作用，通过激酶激活状态来调控激酶的进入和活动。
例如，磷酸化可以调控激酶的激活状态，从而影响其进入细胞核。
3.细胞环境调控：细胞环境中的一些因素也可以影响激酶的核定位。
例如，离子浓度、ATP水平、细胞结构等因素可能对激酶入核起调控作用。
此外，其他蛋白质、RNA或小分子可以与激酶相互作用并影响其进入细胞核。
4.激酶与转运蛋白相互作用：激酶通过与一些转运蛋白相互作用，来调节其进入细胞核的过程。
转运蛋白可以作为激酶进入核内的载体，通过与激酶结合并帮助其通过核孔复合物进入细胞核。
总的来说，激酶入核是一个复杂的过程，受到多种条件的调控。
这些条件包括核定位信号、激酶的激活状态、细胞环境调控以及与转运蛋白的相互作用等。
这些条件相互作用，共同决定了激酶的入核效率和精确性，从而对细胞的信号传递和基因表达起到重要的调控作用。
肌酸合成相关基因的详细介绍如下：
肌酸是由精氨酸和甘氨酸反应，先生成胍基乙酸（GAA），再由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基，即生成肌酸。
这一合成过程涉及到几个关键酶和基因：
1.精氨酸-甘氨酸脒基转移酶（AGAT）：这是肌酸合成的限速酶，催化精氨酸和甘氨酸反应生成胍基乙酸。
此酶在肾脏和胰腺中活性较高。
2.胍基乙酸甲基转移酶（GAMT）：此酶催化胍基乙酸和S-腺苷-L-甲硫氨酸生成肌酸和S-腺苷高半胱氨酸。
此酶在肝脏中活性较高。
3.肌酸转运蛋白1（CT1）：这是一个编码肌酸转运蛋白的基因，负责将肌酸从细胞外转运进入细胞内。
4.肌酸激酶（CK）：此酶催化肌酸的磷酸化反应，有助于肌酸的储存和运输。
此外，肌酸合成过程中可能涉及到的其他基因包括：甘氨酸脒基转移酶基因（GATM）、精氨酸脒基转移酶基因（GARG）、肌酸激酶基因（CKM）等。
需要注意的是，这些基因的突变或缺陷可能导致肌酸合成、转运的异常，进而影响中枢神经系统的正常功能。
因此，
对于这些基因的深入研究有助于理解肌酸的合成机制，为相关疾病的治疗提供新的思路。
捻转血矛线虫病的研究进展李芳芳;张挺;周彩显;冯新港;杜爱芳;索勋;李祥瑞;朱兴全;胡敏【摘要】捻转血矛线虫病是由主要寄生于反刍动物皱胃的捻转血矛线虫引起的一种重要的寄生线虫病,在我国草地牧区普遍流行,可引起宿主消瘦、贫血等慢性消耗性症状,严重感染甚至可引起死亡,给我国养殖业带来巨大的经济损失.由于基层养殖人员常常忽视寄生线虫病的危害,缺乏基本的防控常识和驱虫意识,从而错过了预防和治疗该病的最佳时机,最终导致动物大批感染,极大的降低了动物的品质和养殖的经济效益.本文从捻转血矛线虫的形态和生活史着手,介绍了捻转血矛线虫病的危害和症状、诊断和治疗、防控方法及感染和致病的相关分子机制研究进展,希望能为该病的防控提供一定的指导.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2019(027)003【总页数】5页(P107-111)【关键词】捻转血矛线虫病;感染;致病分子机制;防控【作者】李芳芳;张挺;周彩显;冯新港;杜爱芳;索勋;李祥瑞;朱兴全;胡敏【作者单位】农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院,武汉430070;农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院,武汉 430070;农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院,武汉 430070;中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;浙江省动物预防医学重点实验室浙江大学动物科学学院,杭州 310029;中国农业大学动物医学院,北京 100193;南京农业大学动物医学院,南京 210095;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州 730046;农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院,武汉 430070【正文语种】中文【中图分类】S852.731捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属于毛圆科，血矛属，主要寄生在牛、羊、骆驼等反刍动物的第四胃即皱胃中，偶见于小肠。
2020年上海市九峰实验学校高三生物第二次联考试题及参考答案一、选择题：本题共15小题，每小题2分，共30分。
每小题只有一个选项符合题目要求。
1. 下列现象中，属于渗透作用的是A.水分子通过细胞壁渗出细胞B.K+通过原生质层进入液泡C.水分子通过原生质层渗出液泡D.葡萄糖分子通过细胞膜进入细胞2. 同位素标记技术在生物学的研究中已被广泛应用下列有关叙述正确的是（）A. 在唾液腺细胞中注射3H标记的色氨酸科学家可以依次在核糖体高尔基体内质网和细胞膜中检测到放射性B. 用H218O浇灌植物一段时间后，可以在（CH2O）中检测到18OC. 用32P标记某精原细胞的一个DNA，放入含31P的培养液中让其完成一次减数分裂，则形成的精细胞中有25%是有放射性的D. 用35S和32P同时标记噬菌体的蛋白质和DNA，并以此噬菌体去侵染细菌，证明了DNA是主要的遗传物质3. 图甲为黑藻在适宜温度下O2释放速率随光照强度的变化。
图乙是将黑藻放在适宜温度的密闭环境中，（不同时间内光照强度不同）测得的密闭环境中CO2浓度随时间的变化情况。
下列叙述错误的是（）A. 图甲中，当光照强度相对值为2时，黑藻的氧气产生速率相对值为0B. 图甲中，当光照强度相对值为7时，若要提高黑藻光合速率，可适当增加CO2浓度C. 图乙中黑藻的光合速率等于呼吸速率的时间段是4～6h、8～10hD. 由图乙分析，黑藻在该密闭环境中经过12h后有机物的含量上升4. 图1表示某运动员在运动前血糖浓度的变化，图2表示信号分子A对靶细胞发挥作用的过程。
图3为巨噬细胞避免过度炎症反应的机制，下列相关叙述不正确的是（）A. 图1中cd段血糖升高是肝糖原水解成葡萄糖所致，图3中VEGFR-3的化学本质最可能是糖蛋白B. 若图2所示细胞为垂体细胞，则信号分子A可能是抗利尿激素或促甲状腺激素释放激素等C. 若图2中信号分子A为淋巴因子，则图2所示细胞可能是浆细胞D. 图3中抑制TLR4-NF-KB介导的炎症反应是通过抑制NF-KB的作用来实现5. 如图是靶细胞与特定激素结合的方式示例。
精氨酸(Arginine)，分子式为C6 H14 N4 O2。
分子质量为174.2，为白色晶体或晶体状粉末。
在自然界中有两种异构体存在：D-精氨酸(D-Arg)和L-精氨酸(L-Arg)，动物体内主要以L-精氨酸的形式存在。
Arg 在人医方面的研究较多，但是对于家禽的研究较少，早期的研究大多集中在1994年以前。
当前随着人们认识的深入，人们对L-Arg的研究主要集中在L—Arg提高免疫力，在感染、烧伤、手术、动脉粥样硬化及胎儿发育障碍等的治疗方面开展系列研究。
1 精氨酸来源与代谢动物机体精氨酸主要有三个来源：①来源于日粮；②机体蛋白质的分解；③机体内其他氨基酸(谷氨酸和瓜氨酸等)的转化[1]。
日粮中氨基酸是动物机体合成蛋白质的重要来源。
内源性合成的精氨酸主要来源于小肠和肾脏。
虽然精氨酸只是健康成年哺乳动物的条件性氨基酸，但对禽类而言，精氨酸却是必需氨基酸。
主要原因在于家禽机体缺乏如氨甲酰磷酸酶等关键酶，因而不能通过生化途径(如鸟氨酸循环途径)来合成精氨酸，因此只能由日粮来满足。
精氨酸是体蛋白的组成部分，可以由动物内源合成。
血浆瓜氨酸和线粒体内的鸟氨酸是其合成的前体，瓜氨酸在细胞液中合成精氨酸。
在提供瓜氨酸的情况下，家禽可在肾和巨噬细胞内合成精氨酸，但效率很低。
精氨酸体内代谢途径有：①通过精氨酸酶分解为尿素和鸟甘酸。
鸟甘酸是合成多胺类物质的前体，它们是调节细胞生长的重要物质，是细胞增殖的促进剂；②通过氧化途径，经一氧化氮合成酶(NOS)催化生成具有生物活性的一氧化氮(NO)。
NO是一种内皮舒张因子，有利于维持血管的通透性，改善肠道的缺血缺氧功能。
③精氨酸可以由甘氨酸转脒基酶分解为鸟氨酸和肌酐酸，由精氨酸分解酶降解为鸟氨酸和尿素。
精氨酸在相关酶作用下最终分别转化成腐胺、脯氨酸和谷氨酰胺，腐胺可以生成亚精胺和精胺，三者统称为多胺，谷氨酰胺可进入三羧酸循环，氧化供能产生CO2 。
④精氨酸在家禽体内通过鸟氨酸循环分解成氨后，合成嘌呤，然后降解为尿酸排出[2]。
精氨酸产生菌的代谢机制及选育进展伊廷存1，袁建国2*，李 峰3，高艳华3（1. 山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014；2. 山东省食品发酵工业研究设计院，山东 济南 250013；3. 济南京鲁生物技术研发中心，山东 济南 250013）摘 要：L-精氨酸是氨基酸的一种，是蛋白质和肌酸的重要组成成分。
作为一种条件必需性氨基酸，L-精氨酸在营养生理、医药工业和饲料工业方面有重要作用和良好的应用前景，本文综述了精氨酸的代谢机制及精氨酸产生菌的选育研究进展。
关键词：精氨酸；代谢；选育；诱变；基因工程中图分类号：Q538 文献标识码：A 文献编号：1672-9791（2010）05-0203-04收稿日期：2009-10-28作者简介：伊廷存（1982-），男，山东蒙阴人，硕士，研究方向为微生物资源与发酵工程*通讯作者：袁建国，男，研究员 E-mail:yitc_999@Metabolism and Advances in Research of High Yielding Strains of L -ArginineYI Ting-cun 1, YUAN Jian-guo 2, LI Feng 3 ,GAO Y an-hua 3（1 .College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014, China;2. Shandong Food & Fermentation Industry Research & Design Institute, Jinan 250013，China;3.JingluBiotechnology Research and Development Center of Shandong Province ，Jinan 250013, China ）Abstract: L -arginine is one kind of amino acid, and a building block of proteins and creatine. As a conditionally essential amino acid, it plays an important role and has good application prospects in nutrition physiology, medicine industry and feed industry. This paper reviews the metabolic mechanism and breeding development of L -arginine-producing strains.Key Words: L -arginine; metabolism; breeding; mutagenesis; genetic engineeringL -精氨酸是具有多种用途的氨基酸。
精氨酸对畜禽营养调控及肠道屏障功能的影响研究进展李建慧;苗志强;车向荣;杨玉【摘要】在畜禽体内,精氨酸是一种条件性必需氨基酸,参与多种营养物质的合成与代谢,同时对胃肠道的发育及功能有重要作用.肠道屏障功能是肠道主要生理功能之一,文章阐述了精氨酸对畜禽肠道屏障功能的重要作用;重点从Toll样受体途径等方面简述精氨酸对肠道免疫屏障的影响,为深入了解精氨酸在畜禽生产中的调节作用提供参考.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)002【总页数】6页(P407-412)【关键词】精氨酸;营养调控;肠道屏障【作者】李建慧;苗志强;车向荣;杨玉【作者单位】山西农业大学动物科技学院,太谷030801;山西农业大学动物科技学院,太谷030801;山西农业大学动物科技学院,太谷030801;山西农业大学动物科技学院,太谷030801【正文语种】中文【中图分类】S815.1精氨酸是目前发现的动物细胞内功能最多的氨基酸，不仅是细胞质和核酸蛋白的主要成分，还是肌酐酸唯一的氮来源，是生成高能磷酸化合物的中间体；其作为尿素循环的中间体可以解除氨中毒，避免因氨过量造成的代谢紊乱；还能够分别通过多胺和一氧化氮(NO)来调控细胞生长和分化[1]。
在猪体内肠上皮细胞可以将瓜氨酸和鸟氨酸转化成精氨酸，但是对于哺乳仔猪来讲，乳源的精氨酸不能满足其生长需要，必须通过外源来补充精氨酸的不足，且精氨酸对仔猪断奶应激的改善作用也已被广泛报道。
而在家禽体内不能自身合成L-精氨酸[2]，家禽体内的精氨酸易受到同类碱性氨基酸如赖氨酸的抑制。
当肉鸡日粮中赖氨酸比例过高时会抑制肉鸡生长，而高比例精氨酸则不会对肉鸡的生长造成抑制[3]。
精氨酸在发挥营养调控作用的同时，还在保护肠道完整性和功能方面发挥重要作用。
作者旨在综述精氨酸对畜禽的营养调控作用和对肠道功能的影响，并分析发挥作用的可能机制。
1.1 精氨酸的来源精氨酸是旋光化合物，具有旋光性，分为L型精氨酸和D型精氨酸，在动物体内具有生理作用的是L型精氨酸。
巨噬细胞mtorc1 精氨酸代谢（中英文实用版）Title: Macrophage mTORC1 and Arginine Metabolism英文：The mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) is a key regulator of cell growth, survival, and metabolism.In macrophages, mTORC1 plays a critical role in controlling inflammation and immune responses.One of the important functions of mTORC1 is to regulate the metabolism of arginine, an essential amino acid.Arginine metabolism is essential for macrophage function, and imbalances in arginine metabolism have been associated with various diseases, including cancer, diabetes, and cardiovascular diseases.中文：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1（mTORC1）是细胞生长、生存和代谢的关键调节器。
在巨噬细胞中，mTORC1在控制炎症和免疫反应中发挥关键作用。
mTORC1的一个重要功能是调节精氨酸代谢，精氨酸是一种必需氨基酸。
精氨酸代谢对巨噬细胞功能至关重要，精氨酸代谢失衡与多种疾病有关，包括癌症、糖尿病和心血管疾病。
英文：The mTORC1 pathway is activated by nutrient availability, growth factors, and other signals.In the context of arginine metabolism, mTORC1 promotes the synthesis of arginine by regulating the expression ofarginine-related genes.This synthesis is important for macrophage proliferation and survival.Additionally, mTORC1 activates the translation of arginine-rich proteins, which are involved in various cellular processes, including translation, transcription, and cell signaling.中文：mTORC1途径通过调节营养素可用性、生长因子和其他信号来激活。
精氨酸在液体制剂中作为蛋白稳定剂和变性剂的考察作者：陈海林来源：《中国科技博览》2017年第23期[摘要]在动物的代谢方面，精氨酸有着非常重要的作用和功能，是其重要的氨基酸，与此同时，其在多种多样的行业生产中得到了广泛的应用。
同时，精氨酸在液体制剂中还是一种蛋白稳定剂和变性剂，对其进行相应的考察。
在本文中，对精氨酸的来源和代谢以及精氨酸生理作用进行了相应的阐述，并且研究了精氨酸在液体制剂中作为蛋白稳定剂和变性剂的应用。
[关键词]精氨酸；液体制剂；蛋白稳定剂；变性剂中图分类号：TQ934 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）23-0097-01精氨酸的分子式是C6H14N4O2，分子质量是174.2，是一种白色晶体或者是晶体状粉末。
精氨酸在自然界中有着两个异构体存在，分别是D-精氨酸和L-精氨酸，在动物体中，其主要的存在形式是L-精氨酸。
在多个方面对其进行了相应的应用，主要包括人医和家禽等。
目前，人们对其的认知在不断深入地过程中，人们对L-精氨酸的研究主要集中在提高免疫力方面。
一、精氨酸的来源和代谢从动物机体精氨酸的来源的角度进行相应的说明，其主要的来源包括三个方面，其一，日粮；其二是机体蛋白质的分解；其三，机体内其他的氨基酸的转化。
在日粮中氨基酸是动物机体合成蛋白质的重要来源。
内源性合成的精氨酸主要的来源是小肠和肾脏。
从禽类的角度来说，精氨酸是非常必要的一种氨基酸[1]。
这是有着一定的原因的，主要是因为家禽的机体中缺少相应的关键酶，所以，是不可以通过生化途径进行精氨酸的合成的，那么，如果要对其进行有效的满足，只能是通过日粮来实现。
在体蛋白中，精氨酸占据着非常重要的位置，是其重要的组成部分，是可以进行相应的合成的，是通过动物内源实现的。
要进行合成，是有着相应的前提的，主要是血浆瓜氨酸和线粒体中的鸟氨酸，在细胞液中，瓜氨酸能够合成精氨酸。
精氨酸的体内代谢途径主要包括四种，其一，对精氨酸酶进行充分的应用，以此对尿素和鸟苷酸进行有效的分解。
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化报告题目藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名余姣班级学号0801/2008114010130指导教师汪劲松完成时间2011年5月生物学实验教学中心目录摘要........................................................................ 错误！未定义书签。
引言.. (2)1 实验材料 (2)2 实验方法 (3)2.1菌种活化 (3)2.2扩大培养 (3)2.3 IPTG诱导AK的表达 (3)2.4 AK的提取及其纯化 (3)2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (3)2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳 (4)3 结果与分析 (4)3.1 提取物的层析谱图与分析 (5)3.2 提取物SDS-PAGE电泳图与分析 (6)总结 (6)参考资料 (7)藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）摘要：精氨酸激酶（AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。
本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。
当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。
接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。
采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱）纯化AK，最后SDS-PAGE电泳，鉴定。
关键词：精氨酸激酶亲和层析光谱分析精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）引言：蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。
目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。
为学习和掌握蛋白质的提取方法，对精氨酸激酶进行提取及其鉴定。
无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP 上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。
1 实验材料与仪器卡那青霉素：100mg/mL。
LB培养基：10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，加水调至1L，新配制的并用新配制的NaCl、Hcl调节PH至7.0。
分装后高压蒸汽灭菌。
IPTG诱导液：400mg/mL。
裂解液: 主要成分为Tris，NaCl，EDTA。
Stripping buffer：10mL EDTA，20mM Tris base, pH=8.0, 加蒸馏水调至1升。
Binding buffer: 100mM Nacl, 20mM Tris base, pH=8.0, 加蒸馏水调至1升。
含配基咪唑的洗脱液：梯度为50 mM和200mM处理液主要成分：溴酚蓝指示剂，SDS变性剂。
考马斯亮蓝R-250染色液：50mL甲醇+10mL乙醇+40mL蒸馏水+0.25g考马斯亮蓝。
12%的分离胶5mL：Tris-cl pH8.8 1.3mL, 30%丙烯酰胺2mL, 10%SDS 0.05mL, 10%过硫酸铵0.05mL, H2O 1.6mL, TEMED光催化剂0.002mL。
(这些药品都需按顺序加入柱子中，最后加水使水与胶之间的界面保持在一条平行线上。
）12%的浓缩胶2mL：Tris-cl pH6.8 0.25mL, 30%丙烯酰胺0.33mL,10%SDS 0.02mL, 10%过硫酸铵0.02mL, H2O 1.4mL, TEMED光催化剂0.003mL。
分离胶仪器：紫外分光光度计U－4300，电脑恒温层析柜、ORION pH计、紫外检测仪、冷冻离心机、超声破壁仪、雪山制冰机、超纯水机、低温恒温槽电泳仪、电子天平、振荡培养箱、单人单面净化工作台、电热恒温鼓风干燥箱、高压灭菌锅2 实验方法2.1菌种活化取100 µL表达菌种接入6 mL的LB液体培养基（含有卡那青霉素，其工作浓度为50 µg/mL）中，于37 ℃摇床振荡培养8-12小时。
2.2扩大培养将试管中活化的菌液6mL接种到100 mL LB培养基，同时加入卡那青霉素（终浓度50 µg/mL）培养基于37℃恒温培养箱中培养2-3 小时。
2.3 IPTG诱导AK的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当温度为22 ℃，OD=0.6-0.8时，IPTG终浓度为0.5 mM时AK的表达量达到最大。
2.4 AK的提取及纯化蛋白质的提取（1）将上述各管于4 ℃，5000 r/m离心10分钟；（2）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g 沉淀加5 mL裂解液；（3）在冰上进行10分钟，间隔为2秒钟的超声波破壁,直到沉淀变得澄清为止；（4）于4 ℃，12000 rpm，离心10分钟，取上清，得到AK的粗提液。
2.5 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白His-tag所用层析凝胶的基质上连接了一个NTA氮基三乙酸，可以与Ni离子结合，而Ni离子与目标蛋白的6xHis之间会产生吸引力，从而上样即粗提液流经柱子时，带有His-tag标记的AK被吸附在柱子上而与其他杂蛋白区分开来。
AK的纯化：预处理:依次用Stripping buffer（20min）蒸馏水（30min）；0.5MNaOH(1h)、Binding buffer （20min）、蒸馏水（30min）；1MNaCl（1h）、Binding buffer（20min）蒸馏水（30min）；150mL0.1MNiSO4洗树脂柱子使Ni柱再生，最后用蒸馏水洗至穿流物为无色。
平衡：6倍柱床体积Binding Buffer(pH=8.0)平衡。
上样：插A280滤光片，调A值（1）、T值（100）；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。
将粗提液45 mL上柱，流速约为1.6-1.8mL/min。
洗脱：上样完后，继续用Binding Buffer （pH=8.0）淋洗。
待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（50 mM、200 mM）洗脱。
在280 nm处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。
分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。
2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳：（1）安装双垂直板电泳槽；（2）配12%的分离胶5mL，浓缩胶2mL；（3）制样：分别取原样AK粗提取液、未挂上柱的样品即穿流物、收集的目标蛋白（共3个管）40 µL与样品缓冲液10 µL混合，加入EP管并分别做上记号，用封口膜封口，泡沫塑料固定，于100 ℃热水中加热5分钟；（4）上样：用微量注射器加样15-20 µL（5）电泳：在凝胶上加40 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；（6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；（7）脱色并扫描电泳图：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色后扫描电泳图。
3 结果与分析3.1提取物的层析图谱与分析分析：如图1所示，图中共出现了3个波峰，第一个波峰是AK粗提取液上样后经Binding buffer洗脱而将未挂在柱子上的杂蛋白洗脱下来了；第二个波峰显示的是用较低浓度为50 mM的咪唑洗脱液流经柱子竞争性结合连接在柱子上的AK，从而将其洗脱下来；第三个波峰显示的是用高浓度的为200 mM的咪唑洗脱液流经柱子将那些结合比较紧的AK洗脱下来。
我们还可以发现后两个波峰较第一个低，这说明杂蛋白的含量较AK的多，故280nm处的吸收值高些。
3.2提取物SDS-PAGE电泳图与分析1 2 3 4 5注：泳道1：原液;泳道2：穿流液;泳道3:10mM咪唑洗脱液；泳道4:10mM-250mM咪唑洗脱液; 泳道5:250mM咪唑洗脱液（AK）分析：有电泳图谱可知在250mM咪唑洗脱液洗脱时AK的收集效果做好，由10mM-250mM 咪唑洗脱液洗脱时洗脱液的浓度越高AK收集的越多。
2—7管在同一水平线上且只有一条带说明该AK只由一条多肽链组成。
总结虽然身心疲惫但感到前所未有的高兴；虽然错误百出但有丰富的收获。
对于研究生的生活似乎有了一点点的理解。
作为实验者在做实验前就需要对整个项目的目的、实验过程、所需材料药品用非常了解，主要有以下这些：（1）实验仪器要严格按照说明书使用，尤其是第一次使用的、精密仪器使用时务必得小心。
（2）扩大培养时应当多做3-4个培养基，以防止某个实验组的培养基有问题，尽量考虑到备用组。
（3）药品的配置应当比实验所需的量适量多些，考虑到必要的损失，但也不可太多而造成药品的浪费。
（4）实验一定要考虑到每一步大约所需的时间、下一步所要做的是什么和应该怎样做才更科学，不可糊糊涂涂到时候不知如何下手。
（5）不管实验中途出现什么问题都要静下心来坚持做下去，然后根据实验条件和问题分析问题原因。
总结实验得失，为以后的实验打下基础。
改进与期望1．实验中我们用到了超声波破壁技术，以获取E.coli表达释放到胞质中的AK。
由此我们可以想到释放到细胞外的分泌蛋白，只需离心或过滤就可以分离分泌蛋白和细胞。
那么我们能不能将AK基因与E.coli内的某一基因融合而使AK分泌表达呢？据了解，科学工作者们已经在构建重组蛋白生产系统，使外源蛋白能够分泌到细胞外做了很多努力，但效果不怎么好。
所以重组蛋白细胞外分泌是人们所研究的目标。
2．实验中我们可以用阿拉伯糖操纵子+AK基因的重组质粒代替用诱导剂IPTG诱导lac操纵子+AK的重组基因的表达。
我们知道IPTG有毒，且诱导效果较高时需要高温，然而本实验受菌种生长温度以及AK活力温度的影响，将温度设为37度，所以效果较差。
因此用Ara操纵子效率更高。
3．在检测AK时我们可以在加样孔中加入已知分子质量蛋白质的混合物，这样我们可以通过以已知分子量蛋白在胶中迁移的距离L为纵坐标，以分子量对数lgMr为纵坐标作图，会得到lgMr与L的线性关系，将AK移动的距离代入公式就可大概求出AK 的相对分子质量。
最后，感谢老师在本实验中的细心指导和同学的帮助！参考资料1.《蛋白质分子生物化学与生物技术》【爱尔兰】G.沃尔什著化学工业出版社。
2.《生物化学》（第三版）王境岩朱圣庚徐长法主编高等教育出版社。
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