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可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。
第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ；依次类推…第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10,记为1E—5 uL ；第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E—6 uL ；换句话说：如果在加入1E—5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/（1E—5）=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。
稀释计数法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。
放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养.第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后,吸取10 μL 加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001)。
吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。
第四天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数.假设为X 和Y，则滴度(TU/mL）=（X+Y×10）×1000/2/X 孔的病毒液的含量（μL）.定量PCR 法病毒感染1 天前，取6 孔板接种HOS 细胞.每孔细胞为5×100 000 个。
可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。
第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ；依次类推…第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ；第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ；换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。
稀释计数法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293 T 细胞消化计数后稀释至1×100 000/mL，加入96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备10 个孔。
放入37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。
第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5mL EP 管，每管加入90 μL 培养液，往第一个管中加入10 μL 病毒原液，混匀后，吸取10 μL 加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。
吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。
第四天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3．PFU（空斑形成单位）4．TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4．TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1． VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2． GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3． PFU（空斑形成单位）4． TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2． GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP 或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3． PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4． TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
病毒滴度测定方法
病毒滴度测定是一种用于确定病毒在溶液中的浓度的方法。
它通常用于病毒学研究、疫苗生产和药物研发等领域。
正确的病毒滴度测定方法可以帮助科研人员准确地评估病毒的活性和浓度，从而为相关研究工作提供可靠的数据支持。
下面将介绍几种常用的病毒滴度测定方法。
一、细胞培养法。
细胞培养法是一种常用的病毒滴度测定方法。
首先，将待测病毒样品与细胞培养基混合，然后在培养皿中接种一定数量的细胞，并将混合液加入培养皿中。
接下来，将培养皿放入恒温培养箱中，培养一定时间后观察细胞的感染情况，根据感染细胞的数量可以计算出病毒的滴度。
二、血凝法。
血凝法是另一种常用的病毒滴度测定方法。
这种方法利用病毒对红细胞的凝集作用来确定病毒的滴度。
首先，将一定浓度的病毒样品与红细胞混合，然后在琼脂培养皿中进行凝集反应。
根据凝集的程度和范围可以计算出病毒的滴度。
三、动物接种法。
动物接种法是一种直接将病毒样品接种到动物体内，通过观察动物的感染情况来确定病毒滴度的方法。
这种方法通常用于病毒毒力的测定。
通过确定50%动物传染单位（TCID50）或50%致死剂量（LD50）来表示病毒的滴度。
总结。
以上介绍了几种常用的病毒滴度测定方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在进行病毒滴度测定时，需要根据实际情况选择合适的方法，并严格按照操作规程进行操作，以确保测定结果的准确性和可靠性。
希望本文对您有所帮助。
吉凯基因慢病毒滴度检测方法逐孔稀释滴度测定法:一：样品准备1.检测前一天，对293T 细胞传代，每个24 孔中加１×105 个细胞，体积为500μL；2.次日，准备7~10 个无菌的Ep 管，在每个管中加入90 μL 的培养基（DMEM+10%FBS）；3.取待测定的病毒原液10μL 加入到第一个管中，混匀后，取10 μL 加入到第二个管中。
继续相同的操作直到最后一管；4.选取所需的细胞孔，吸去90 μL 培养基。
加入稀释好的病毒溶液。
放入37℃5%CO培养箱中培养；25.48 小时后，加入新鲜培养基500 μL。
小心操作，不要吹起细胞；6. 4 天后，抽提RNA 准备做RT-qPCR。
二：Real time 定量PCR 法测定滴度具体操作内容参考“吉凯基因慢病毒包装手册”14页“2) Real time 定量PCR 法测定滴度”三：滴度计算方法1.加入不同病毒量的细胞样品，通过提取总RNA后反转录为cDNA，然后进行定量PCR检测，通过比较control组和试验组的Ct值差异判断滴度值。
通常情况下，认为Ct值差异2以上存在显著差异。
2.反转录反应所获得的20 μL cDNA中只取了1 μL用于实时定量检测，所以该结果仅表示1/20样品的情况，所以在滴度计算时应该乘以系数20。
3.例如：若某次滴度检测中，1.00E-05 μL组样品和control组样品的Ct值存在2个左右差异，则认为在1.00E-05 μL组样品中存在病毒颗粒。
假定该组样品含有至少有1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：1/(1.00E-05) *20＝2.00E+6 TU/μL=2.00E+9 TU/ml。
四：融解曲线说明由于SYBR GreenⅠ与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。
通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。
由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBR Green Real-Time PCR定量结果。
二、空斑测定法空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。
这一方法得到的结果往往最不稳定。
1．5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。
或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。
2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。
第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。
稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。
稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。
用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。
换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。
然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。
注意：每次稀释时都必须换用新枪头。
3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。
4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。
5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。
21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。
结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。
三、50%组织培养感染剂量法此方法基于最高稀释度下在细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法（一）细胞准备：1．收集一瓶细胞，计数。
2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。
3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。
（二）准备稀释病毒液1．第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。
半数组织培养感染剂量法测定淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒优势分析连亨宁成都军区总医院呼吸内科，成都610083摘要：目的寻找简便的淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒LCMV病毒滴度测定方法。
方法采用半数组织培养感染剂量(TCID50)法检测LCMV病毒滴度，记录期间细胞形态变化。
结果实验后第5天获得与空斑实验一致的病毒滴度结果,但实验流程更为简单。
结论TCID50法测定LCMV病毒滴度相对于空斑实验更为简便。
关键词：半数组织感染剂量；空斑实验；淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒；病毒滴度中图分类号：Q939.47 文献标识码：AThe advantage of Lymphocytic Choriomeningitis Virus quantification by 50% Tissue culture infective doseLian Hengning（Department of Respiratory Medicine ，Chengdu Military General Hospital ，Chengdu 610083）Abstract：To determine a convenient method to quantify Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV) ,LCMV titer was measured by the 50% Tissue culture infective dose (TCID50) method . The result was got 5 days post-infection , similar with plaque assay ,but the protocol is easier than plaque assay .This experiment showd that TCID50 is more convenient than plaques assay .Key words:50% Tissue culture infective dose(TCID50);Plaques assay;Lymphocytic Choriomeningitis Virus (LCMV); Virus titer空斑实验是检测病毒滴度最为经典的方法[1]。
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P11）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P16)2.病毒载体及包装质粒病毒载体：DNA组构建及中量提取；包装质粒：商品化产品（Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf （P12）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P17)）或DNA中量提取（目前唯一使用来源）；3.细胞转染方法一：Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P12）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P17)；方法二：按照Lipofectamine?LTX&PlusReagent进行，简要中文说明如下：a.转染前24小时，把4–5x106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%；b.293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基；c.用之前充分混匀PLUSReagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNAPlasmidDNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUSReagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube1，温和混匀，室温孵育5分钟；d.充分混匀MixLipofectamineLTX，在EP管中加入45ul的MixLipofectamineLTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube2，温和混匀；e.将Tube1的溶液加到Tube2中，温和混匀，室温孵育5分钟；Tube1(PlasmidDNA) Tube2(LTX)15ugDNAMIX(pLVX-shRNAPlasmidDNA：455μl Opti-MEMpMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)15μl PLUSReagent 45μl MixLipofectamineLTX Upto500μl Opti-MEM 500μlTotalVolume500μlTotalVolumef.将1ml转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。
病毒滴度测定有很多名词都用来描述病毒溶液的滴度。
1． VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）2． GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU类似）3． PFU（空斑形成单位）4． TCID50（50%组织培养感染剂量）不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。
1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。
用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒颗粒。
因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。
2． GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数量。
这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。
如果重组腺病毒含有报告基因如GFP 或LacZ等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。
3． PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒裂解空斑的形成。
空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。
一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技术员操作也很少能得到相同的结果。
4． TCID50已被用于测定许多种病毒的滴度，但以前并不用于腺病毒。
病毒稀释液与细胞在96孔板进行培养，然后监测每孔是否CPE。
TCID50方法相对PFU方法而言有几个优点，如速度是PFU的2倍，结果更具预料性，在不同操作个体间也更稳定。
所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有关。
许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会影响结果。
最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。
一种是用更小体积的病毒液进行感染并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进行离心（1000 RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。
这两个实验室所得到的结果更为稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。
迄今为止，尚无一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。
对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果往往相差100倍以上，典型的数据见表6。
所有结果都只是大概的，目前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到1个感染性颗粒/2个颗粒。
下一部分，我们将详细描述3种不同的测定病毒滴度的方法。
选择滴定方法要考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏感性、易用性和耗时。
无论选择那种方法，稀释和滴定过程必须重复操作以得到精确结果。
一般来说，用TCID50方法得到的病毒保存液的滴度应为：106~107 第一代细胞经冻融后108~109 100倍数量的细胞经过冻融后1010~1011 用氯化铯方法纯化后表6：各滴度测定方法特性方法类型时间可重复性滴度* 评注VP 物理学方法 2小时好 5×1012GTU 生物学方法 2天可变 2×1011PFU 生物学方法 21天变化很大 5×1010 传统方法TCID50 生物学方法 10天可变 2.5×1011 昆腾公司标准方法以VP法测得的5×1012的病毒保存液为标准5.8.1 O.D.260 nm（VP/ml）这种方法只是通过DNA量来表示病毒滴度。
相关系数为1.1×1012/ OD260 单位。
由于大多数分光光度计在OD值小于0.1时不够精确，而样品准备过程中又至少要稀释10倍，因此如果 OD值大于0.1，我们可以估计病毒量大于1012。
这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中的病毒，因含血清培养基会干扰吸光度。
同时，它也要求病毒浓度足够高，并且不含缺陷性颗粒。
1． 4℃融化病毒保存液。
2．在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB）（0.1%SDS，10mMTris PH7.4，1mMEDTH）准备二个病毒稀释度。
最小需要量为： s病毒裂解液病毒稀释度52ul 52ul 1：2（稀释液1）168ul 42ul 1：5（稀释液2）注意：病毒滴度高时（1013/ml）用1：10和1：20稀释度，滴度低时用低稀释度，保证OD 值在0.1~1.0之间。
3． 56℃震荡培养10分钟。
0 uf'gbjf4．准备1ml含有VLB和透析缓冲液的空白对照溶液，比例同上，以缓冲液代替病毒裂解液。
5．测定260nm处吸光值：稀释液1再稀释1：5，为稀释液3。
稀释液2再稀释1：5和1：10，分别为稀释液4和稀释液5。
测定稀释液5（2次）、4、3的OD260，取此4值的平均值作为最终结果。
例如1．将450ulVLB和50ul稀释液即透析缓冲液加入比色杯中。
2．记下空白管读数后弃去，不要冲洗。
3．加入450ulVLB和50ul 1：5稀释样本（稀释液2），组成稀释液5。
4．记下读数后弃去。
5．清洗比色杯，加入样本重复测一次。
6．清洗比色杯，加入400ul VLB和100ul 1：5稀释空白液。
7．记下空白管读数后弃去，不要清洗。
8．加入400ul VLB和100ul 1：5稀释样本，组成稀释液4。
9．记下读数后弃去。
10．清洗比色杯，加入400ul VLB和100ul 1：2稀释空白液。
11．记下空白读数后弃去，不要清洗。
12．加入400ul VLB和100ul 1：2稀释样本，组成稀释液3。
13．记下读数后弃去。
将吸光值与稀释度相关系数相乘即可得出病毒滴度：OD260×病毒稀释度×测定稀释度×1.1×1012= OPU/ml5.8.2 空斑测定法空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。
这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。
由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。
1． 5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。
或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。
2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。
第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。
稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。
稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。
用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。
换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。
然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。
注意：每次稀释时都必须换用新枪头。
3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。
4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。
5． 37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。
21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。
结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。
5.8.3 50%组织培养感染剂量法此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。
5.8.3.1 细胞准备：1．收集一瓶QBI-293A细胞，计数。
2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。
3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。
5.8.3.2 准备稀释病毒液1．第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。
第1管中再加入0.1ml病毒保存液。
2．上下吸打5次混匀。
3．换用新枪头。
4．从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。
5．反复稀释至最高稀释度。
6．用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。
7．最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。
阴性对照孔中加入0.1ml DMEM 2%监测细胞存活情况。
加样时从最高稀释度开始。
8． 37℃培养10天。
9． 10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。
只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。
10．计算每一排中出现阳性的孔数。
如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本测试即为有效。
图7：TCID50的典型结果稀释度孔对照稀释度比率 3v q- / 210-10 0/10=0 uc% ?\0jo#10-9 0/10=0 F78?54dN]210-8 2/10=0.2 ' 7]<Qo ¬g10-7 6/10=0.6 HG1gai 7Z#10-6 10/10=1 |_?1%0rv>10-5 10/10=1 oQ = | d,10-4 10/10=1 iE +F ' 510-3 10/10=1 D 8| *gu&o在这一例子中，当稀释度为10-6时出现100%阳性，当稀释为10-9时出现0%阳性。
因此，滴度可以用KARBER统计法精确算出：对于100ul的稀释液，滴度为T=101+d（s-0.5）d=log10稀释度=1（对于10倍的稀释度而言）s=阳性比率之和（从第1个10倍稀释度开始）=1+1+1+1+1+1+0.6+0.2+0+0=6.8。
虽然一些低稀释度在测定中省略了（如10-1和10-2），但在计算时仍应以阳性比率为1来算。
滴度：T=101+1（6.8-0.5）=107.3（100ul病毒保存液中）T=100.3≈2×108 TCID50/ml。
说明：我们已经证实，TCID50法测到的滴度d=log10值比标准空斑法高0.7。
将TCID50/ml转换为PFU/ml：T=1×108.3 TCID50/ml=1×108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6 PFU/ml≈4×107 PFU/ml。
两次重复试验得到的滴度值应相差≤0.7个log10值（100.7）。
