下载文档原格式
《巴丹吉林沙漠淡水湖和盐湖沉积物微生物群落结构与功能研究》篇一一、引言巴丹吉林沙漠，位于我国内蒙古高原的西部，以其独特的地理环境和丰富的自然资源而闻名。
该地区拥有众多的淡水湖和盐湖，这些湖泊的沉积物中蕴藏着丰富的微生物资源。
这些微生物在湖泊生态系统中扮演着重要的角色，不仅参与了碳、氮等元素的循环，还对湖泊的环境变化有着敏感的反应。
因此，对巴丹吉林沙漠淡水湖和盐湖沉积物微生物群落结构与功能的研究，对于理解湖泊生态系统的运行机制和应对环境变化具有重要意义。
二、研究区域与方法本研究选取巴丹吉林沙漠的几个代表性淡水湖和盐湖作为研究对象，通过采集沉积物样品，运用现代微生物学技术手段，对沉积物中的微生物群落结构与功能进行研究。
在采样过程中，我们选择了不同深度、不同距离湖岸的沉积物样品，以保证样品的多样性和代表性。
在实验室中，我们运用高通量测序技术对沉积物中的微生物群落结构进行分析，同时结合生物信息学方法对测序数据进行处理和分析。
此外，我们还通过培养实验和生理生化实验等方法，对微生物的功能进行探究。
三、结果与讨论1. 微生物群落结构通过对沉积物样品的测序数据分析，我们发现巴丹吉林沙漠淡水湖和盐湖沉积物中的微生物群落结构具有明显的差异。
在淡水湖沉积物中，以细菌和古菌为主，其中以放线菌门、厚壁菌门等为主要类群；而在盐湖沉积物中，则以耐盐古菌和极端嗜盐菌等为主要类群。
这表明不同的湖泊环境对微生物群落的结构有着重要的影响。
2. 微生物功能通过培养实验和生理生化实验等方法，我们发现巴丹吉林沙漠淡水湖和盐湖沉积物中的微生物具有多种功能。
其中，一些微生物能够参与碳、氮、磷等元素的循环，对湖泊生态系统的物质循环和能量流动起着重要的作用。
此外，还有一些微生物能够产生多种酶类，对有机物的分解和转化具有重要作用。
同时，我们还发现，一些耐盐微生物能够在高盐环境下生存并发挥重要的生态功能。
在比较淡水湖和盐湖微生物功能时，我们发现两者在有机物分解和转化方面存在差异。
《青藏高原草地土壤不同微生物类群和线虫多样性及驱动因子》篇一青藏高原草地土壤：不同微生物类群与线虫多样性及驱动因子一、引言青藏高原，作为地球上最大的高原，拥有独特的生态环境和丰富的生物多样性。
草地土壤中的微生物和线虫是生态系统的重要组成部分，它们在有机物分解、养分循环和土壤结构形成等方面发挥着重要作用。
本文旨在探讨青藏高原草地土壤中不同微生物类群和线虫的多样性，以及影响其多样性的驱动因子。
二、研究区域与方法1. 研究区域本研究选取青藏高原的若干典型草地生态系统作为研究对象，包括高寒草甸、高寒草原等。
2. 研究方法（1）土壤样品采集：在研究区域内，按照一定的空间分布和深度，采集土壤样品。
（2）微生物和线虫分离与鉴定：采用分子生物学和显微镜技术，对土壤中的微生物和线虫进行分离和鉴定。
（3）数据分析：运用生物统计学和生态学方法，对数据进行处理和分析。
三、青藏高原草地土壤微生物类群与线虫多样性1. 微生物类群多样性青藏高原草地土壤中的微生物类群丰富多样，包括细菌、真菌、放线菌等。
不同类群的微生物在数量、种类和分布上存在差异，这与其所处的生态环境和土壤性质密切相关。
2. 线虫多样性青藏高原草地土壤中的线虫种类繁多，数量丰富。
线虫在土壤中扮演着重要的角色，它们通过摄食、运动和分泌物等行为，影响土壤结构和养分循环。
四、驱动因子分析1. 环境因子环境因子是影响青藏高原草地土壤微生物类群和线虫多样性的重要因素。
包括气候、地形、植被等。
例如，气候因素如温度和降水对微生物和线虫的生长发育有显著影响。
2. 土壤性质土壤性质也是影响微生物和线虫多样性的关键因素。
包括土壤类型、pH值、有机质含量等。
这些因素直接影响土壤中微生物和线虫的数量、种类和分布。
五、结论与展望本文通过对青藏高原草地土壤中不同微生物类群和线虫的多样性进行研究，发现青藏高原草地土壤中的微生物和线虫种类丰富，数量庞大。
环境因子和土壤性质是影响其多样性的重要驱动因子。
中国湖泊微生物多样性及方法研究摘要：本文对我国湖水微生物种群多样性分布及研究方法进行综述，有利于阐明淡水湖泊微生物群体对营养环境的反应变化规律，也有利于全面剖析湖泊湿地生态系统的结构与功能，有利于开发利用微生物资源，还可望为预测湖泊生态系统水环境变化提供依据。
关键词：多样性；细菌多样性；16SrRNA1.中国湖泊资源介绍湖泊是由湖盆、湖水及水中所含的矿物质、有机质和生物等所组成的复杂的生态经济系统，是自然万物和人类文明的繁盛之地。
通常按湖水含盐量的高低，将其分为淡水湖、咸水湖和盐湖三类。
中国古代就有关于各大湖的位置、面积、变证、水位、沙情、围垦和渔业等情况的记载。
对全国面积大于10平方公里的湖泊分类统计，其中淡水湖245个，面积3.1万平方公里，储水量约2231亿立方米，其面积和储水量分别占总面积和总储水量的40%和30%。
咸水湖215个，面积2.8万平方公里，储水量4610亿立方米，面积和储水量分别占总面积和总储水量的36%和62%。
盐湖133个，面积和储水量分别占13%和8%。
干盐湖44个，面积占11%[3]。
2.我国湖泊微生物多样性的研究现状湖泊是重要的淡水系统，是自然界中重要的生态系之一。
由于湖泊生境类型的各不相同，使得湖泊微生物的多样性非常丰富。
2.1古细菌域随着分子生物学技术的发展，人们发现古细菌不只生存于极端的高盐、高温、厌氧等环境中[4]，在非极端环境中同样存在。
古细菌在不同湖泊中的种类和数量分布极其不平衡。
湖泊中大多数的古细菌都属于Eurvarchaeota和Crenarchaeota。
2.2细菌域目前已报到的从湖泊中分离得到的主要细菌类群大多数都属于变形细菌门，拟杆菌门，蓝细菌门，放线菌门，疣微菌门，绿菌门，浮霉菌门，厚壁菌门等。
2.3真核生物域微型真核生物是单细胞真核生物的统称，也地球上数量最多的真核生物，其粒径的大小在0.22 μm和2-3 μm之间。
主要广泛存在于全球海洋生态系统中，其丰度高达102-104CFU/mL，主要包括：甲藻、绿藻等主要种类，并有大量未分类未知菌群的存在，可见其多样性非常丰富。
《巴丹吉林沙漠淡水湖和盐湖沉积物微生物群落结构与功能研究》篇一一、引言巴丹吉林沙漠，位于我国北方，以其独特的地理环境和丰富的自然资源而闻名。
该地区分布着众多的淡水湖和盐湖，这些湖泊的沉积物中蕴藏着丰富的微生物资源。
这些微生物在湖泊生态系统中扮演着重要的角色，不仅影响着湖泊的生态环境，还可能为生物地球化学循环、环境修复等领域提供新的研究思路和应用价值。
因此，对巴丹吉林沙漠淡水湖和盐湖沉积物微生物群落结构与功能的研究具有重要意义。
二、研究区域和方法2.1 研究区域本研究选择巴丹吉林沙漠的多个淡水湖和盐湖作为研究对象，包括湖泊的沉积物和湖水。
2.2 研究方法本研究采用分子生物学和生物信息学方法，结合传统的微生物培养技术，对巴丹吉林沙漠淡水湖和盐湖沉积物中的微生物群落结构与功能进行研究。
（1）样品采集：在巴丹吉林沙漠的多个淡水湖和盐湖中采集沉积物样品，并记录采样点的地理位置、水深等信息。
（2）微生物群落分析：利用高通量测序技术对样品中的微生物群落进行测序分析，了解微生物的种类、丰度和分布情况。
（3）功能预测：结合测序结果和相关数据库，对微生物的功能进行预测和分析。
（4）数据分析：利用生物信息学软件对测序数据进行处理和分析，包括OTU聚类、物种分类、丰度分析等。
三、结果与分析3.1 微生物群落结构通过对巴丹吉林沙漠淡水湖和盐湖沉积物样品进行高通量测序分析，我们发现不同湖泊的微生物群落结构存在差异。
在门类水平上，主要存在的微生物类群包括细菌、古菌等。
在属类水平上，各湖泊的微生物种类有所不同，但普遍存在的微生物种类包括一些耐盐菌、放线菌等。
此外，我们还发现，同一湖泊的沉积物中，不同深度的微生物群落结构也存在差异。
随着深度的增加，一些耐盐菌的丰度逐渐降低，而一些厌氧菌的丰度逐渐增加。
这表明，不同深度的环境条件对微生物群落的结构和分布有一定的影响。
3.2 微生物功能预测根据测序结果和相关数据库，我们对巴丹吉林沙漠淡水湖和盐湖沉积物中的微生物功能进行了预测和分析。
青海盐湖地区嗜盐菌的分离纯化及抑制植物病原菌的活性初探沈硕;王舰【摘要】以番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、菊芋菌核菌(Jerusalem artichoke Sclerotium)、油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、蚕豆根腐菌(Fusarium solani)及豌豆根腐菌(Aphaomyces euteiches Dreehsler)等6种植物病原真菌为供试菌株,采用滤纸片法对植物病原菌提取液的抑菌活性进行了测定.为了获得对这几种植物病原菌具有较高抑制作用的嗜盐菌菌株,对供试菌株进行了液体发酵及发酵液的活性筛选.经滤纸片法测定,青海盐湖嗜盐菌菌株对辣椒疫霉菌具有较强的拮抗作用,并用最小抑制浓度法(MIC)测定了嗜盐菌提取物对辣椒疫霉菌的最小抑菌浓度范围为9～12 mg/mL.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2013(040)001【总页数】4页(P79-81,88)【关键词】嗜盐菌;次级代谢产物;滤纸片法;抑菌活性【作者】沈硕;王舰【作者单位】青海省农林科学院生物技术研究所/青藏高原生物技术教育部重点实验室,青海西宁810016【正文语种】中文【中图分类】S482.2+92盐湖广泛分布于世界各地，是嗜盐微生物高度集中的极端环境。
目前被重点研究的盐湖有美国的大盐湖，肯尼亚的死海和马加迪湖。
我国新疆维吾尔自治区和青海省也有大量的盐湖分布。
研究表明，盐湖中微生物多样性极为丰富，存在着大量高密度的未知微生物资源[1]。
其中，拮抗微生物的生物防治方法近年来日益受到重视。
理论研究方面,人们对嗜盐菌的嗜盐机理尤感兴趣,生存在极端环境中的微生物,通常是通过代谢作用适应其所处生境而得以存活并发挥作用,集中表现在细胞膜、细胞壁结构性成分和功能性成分的稳定性、反应动力学、酶系的性质、代谢途径及信息传递、蛋白质核酸成分及构象等方面为了适应高盐环境而具有的特异性。
盐湖地区土壤微生物多样性与功能研究进展盐湖地区土壤微生物多样性与功能研究进展土壤微生物是地球生物圈中重要的组成部分，对于土壤生态系统的功能发挥具有重要的作用。
在盐湖地区，土壤中存在着特殊的生态环境和极端的气候条件，这对土壤微生物的多样性和功能产生了一定的影响。
随着生物技术的快速发展，对盐湖地区土壤微生物多样性及其功能的研究也取得了一系列进展。
盐湖地区的土壤微生物多样性受到多种因素的影响，其中盐分和水分是最主要的两个因素。
盐湖地区土壤中的盐分浓度较高，这导致土壤中的微生物群落结构与一般土壤有所不同。
研究发现，盐湖地区土壤中的嗜盐微生物（halophiles）占据了主导地位。
嗜盐微生物能够适应高盐浓度环境，其菌群组成和功能特性与常规土壤微生物存在差异。
此外，盐湖地区的土壤常常存在水分亏缺的情况，这对土壤微生物的生存和繁殖也带来了一定的挑战。
某些微生物通过分泌特殊的生物胶物质（如胞外多糖）来保持细胞在干旱条件下的稳定性，并在水分恢复后重新激活生命活动。
盐湖地区土壤微生物的功能研究表明，它们参与了多种重要的土壤生态过程和功能。
首先，土壤微生物是土壤有机质的分解者和转化者，能够分解复杂的有机物质为可利用的养分，为植物提供养分来源。
嗜盐微生物在高盐环境中也能够分解有机物，维持土壤生态系统的健康。
其次，土壤微生物参与了土壤固氮过程，一些嗜盐微生物具有固氮功能，能够将空气中的氮转化为植物可利用的形式。
此外，土壤微生物还参与了土壤中的硫、磷等元素的循环过程，对土壤中的元素转化和循环有着重要的影响。
近年来，通过高通量测序技术的快速发展，对盐湖地区土壤微生物多样性和功能的研究取得了一系列的进展。
通过对土壤样品中的16S rRNA基因和功能基因的测序，可以了解到盐湖地区土壤微生物的群落组成、结构及其功能潜力。
同时，还可以探索土壤微生物群落的变化规律和驱动因素，为盐湖地区土壤生态系统的保护和可持续利用提供科学依据。
总结起来，盐湖地区的土壤微生物多样性受到盐分和水分的影响，其中嗜盐微生物占据了主导地位。
西藏扎布耶盐湖嗜盐菌、藻的发现和地质生态学雏议
扎布耶盐湖是中国西藏自治区的一个盐湖，位于西藏的墨脱县。
这是一个由岩石盐构成的天然盐湖，盐度很高，达到了25%。
扎布耶盐湖的发现是在20世纪60年代，当时在进行地质勘探工作时发现了这个盐湖。
在扎布耶盐湖中，发现了一些嗜盐菌和藻类生物。
嗜盐菌是一类生物，能够在高盐浓度的环境中生存和繁殖。
它们通常生活在盐湖、盐碱土壤和海水中。
藻类生物是一类水生植物，能够在低光照条件下生长。
它们在扎布耶盐湖中主要分布在盐湖的水面上，可以在高盐浓度的环境中生存。
扎布耶盐湖的地质生态学研究是一个新兴的研究领域，研究的重点是研究盐湖的地质演化和盐湖中生物的生态学特征。
目前，研究工作还处于初步阶段，需要进一步深入研究才能得出完整的结论。
西藏扎布耶盐湖晚第四纪孢粉植物群的初步研究
萧家仪;吴玉书;郑绵平
【期刊名称】《微体古生物学报》
【年(卷),期】1996(13)4
【摘要】扎布耶盐湖位于西藏青藏高原腹地。
通过该湖ＺＫ２钻孔的孢粉分析，揭示了约３６０００ａＢ．Ｐ．以来扎布耶地区的气候和湖盆演变。
约在３６０００－３３０００ａＢ．Ｐ．，扎布耶地区为森林草原，气候冷、湿；约３３０００－３００００ａＢ．Ｐ．，为灌丛草原，气候温、干；约３００００－２７５００ａＢ，Ｐ．为干旱草原，气候偏暖、湿；约１８０００－１２０００ａＢ．Ｐ．，为干旱草原，环境寒冷，干燥；约１２０００－４０００ａＢ．Ｐ．，扎布耶地区各类草本植物繁茂，气候偏温、干。
另外，根据水生藻类化石群的分析，自３６０００ａＢ．Ｐ以来，扎布耶盐湖有三次湖进、淡水湖期，同时也有三次湖退事件。
【总页数】5页(P395-399)
【关键词】第四纪;孢粉组合;植物群;扎布耶盐湖;西藏
【作者】萧家仪;吴玉书;郑绵平
【作者单位】南京师范大学地理系,中国科学院植物研究所,地矿部地科院矿床研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q913.84
【相关文献】
1.西藏扎布耶盐湖盐田盐渍土渗水试验初步研究 [J], 林清华;张永生;方雪松
2.西藏扎布耶盐湖晚更新世沉积学及古气候意义 [J], 李明慧;郑绵平
3.西藏扎布耶盐湖地区现代花粉雨的初步研究 [J], 吴玉书
4.基于LightGBM的盐湖锂浓度遥感反演研究
——以西藏扎布耶盐湖北湖为例 [J], 刘婷玥;代晶晶;赵元艺;田淑芳;叶传永
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
青藏高原盐湖细菌群落与超盐环境因素的相关性朱德锐;韩睿;石晴;沈国平;龙启福;双杰【期刊名称】《中国环境科学》【年(卷),期】2017(037)012【摘要】以青藏高原极端盐湖为研究对象,采用16S rRNA基因(V3~V4区)高通量测序方法分析盐湖细菌的群落结构差异和超盐环境因子的制约相关性.结果显示,超盐环境样本中细菌的群落结构组成相对稳定,进化趋同,且复杂度和多样性指数显著低于非超盐环境.青藏高原超盐环境中细菌的优势类群是厚壁菌门Firmicutes(74.04%~81.04%)、次为变形菌门Proteobacteria(15.51%~20.06%)、拟杆菌门Bacteroidetes(2.68%~4.84%)和放线菌门Actinobacteria(0.71%~2.45%).比较分析其它类型超盐环境,青藏高原超盐环境具有高丰度的特色属群芽孢杆菌属Bacillus(50.63%~58.35%)、乳球杆菌属Lactococcus(9.28%~11.81%)和海洋芽孢杆菌属Oceanobacillus(8.41%~10.52%).基于典范对应CCA分析,表明优势属群(Bacillus、Lactococcus、Pseudomonas、Oceanobacillus、Stenotrophomonas、Psychrobacter、Myroides、Brochothrix和Arthrobacter)和超盐样本的聚集,与环境因子(总盐度、Cl-、K+、Mg2+和CO32-浓度)呈明显的正相关.【总页数】10页(P4657-4666)【作者】朱德锐;韩睿;石晴;沈国平;龙启福;双杰【作者单位】青海大学医学院,基础医学研究中心,青海西宁 810016;青海大学农林科学院,青海省蔬菜遗传与生理重点实验室,青海西宁 810016;青海大学医学院,基础医学研究中心,青海西宁 810016;青海大学医学院,基础医学研究中心,青海西宁810016;青海大学医学院,基础医学研究中心,青海西宁 810016;青海大学医学院,基础医学研究中心,青海西宁 810016【正文语种】中文【中图分类】X171.1【相关文献】1.山西运城盐湖嗜盐细菌的系统发育与种群多样性 [J], 李坤珺;龙健2.基于高通量测序的内蒙古姆州诺尔盐湖细菌群落组成分析 [J], 杨丽;殷婷婷;尹馨;顾笑赫;温洪宇3.布氏乳杆菌和甲酸对青藏高原不同物候期燕麦青贮饲料发酵品质和细菌群落的影响 [J], 陆永祥;赵嫚;陈良寅;成启明;游明鸿;李达旭;陈仕勇;白史且;李平4.青藏高原小柴旦盐湖微生物群落结构及多样性 [J], 刘静;张欣;沈国平;封希媛;龙启福;朱德锐5.土壤水盐因子对盐湖防护林体系植被群落分布的影响 [J], 冯亚亚;汪季;党晓宏;魏亚娟;管雪薇;李镯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Re sea rch Pape r 研究报告微生物学报A cta M icrobiologica S inica 50(3):334-341;4March 2010I SS N 0001-6209;CN 11-1995/Q htt p://j ournals .i m .ac .cn /acta m icr ocn基金项目:国家自然基金项目(40772065;40572059)3通信作者。
Tel:+86210268999550;Fax:+86210268999076;E 2mail:kfjbj2002@yahoo 作者简介:张现辉(1983-),男,河南人,硕士研究生,主要从事极端环境微生物方面的研究。
E 2mail:xhman66@1261com 收稿日期:2009211203;修回日期:2009212225西藏扎布耶盐湖细菌多样性的免培养技术分析张现辉1,2,3,孔凡晶1,2,33(1中国地质科学院矿产资源研究所,北京 100037)(2国土资源部盐湖资源与环境重点实验室,北京 100037)(3中国地质科学院盐湖与热水资源研究发展中心,北京 100037)摘要:【目的】利用免培养技术,获得有关西藏高原高盐度、高海拔盐湖的细菌多样性认识。
【方法】从西藏扎布耶盐湖沉积样品中提取微生物总DNA,利用细菌引物f530/r1492扩增16S r RNA 基因,然后构建16S r RNA 基因质粒文库。
采用Hae Ⅲ和Hha Ⅰ两种内切酶对阳性克隆质粒DNA 进行ARDRA 分型分析,根据分型结果挑选克隆进行测序。
得到它们的16S r RNA 基因部分序列,根据获得的序列构建构建系统发育树。
【结果】在系统发育树上,部分克隆(占总克隆数的57114%)与已知细菌属归于同一分支,主要分布在γ2变形菌纲、α2变形菌纲、δ2变形菌纲、拟杆菌门(Bacter oidetes )、厚壁菌门(Fir m icutes )和疣微菌门(Verrucom icr obia )的23个嗜盐细菌属之中。
其余的克隆为未培养序列,与前者差异很大,在进化树上形成了独立的分支。
【结论】研究结果显示出扎布耶茶卡湖中的细菌组成具有极其丰富的多样性。
关键词:扎布耶盐湖,细菌多样性,免培养技术;16S r RNA 基因;ARDRA 中图分类号:Q938 文献标识码:A 文章编号:000126209(2010)0320334208 盐湖是一种咸化水体,通常是指湖水盐度不低于315%(w /v )的湖泊,也包括表面卤水干涸、由含盐沉积与晶间卤水组成的干盐湖以及地下卤水湖[1]。
大多为内陆湖泊,可以形成相对封闭的微生物生态系统。
湖中微生物主要由真核绿藻、硅藻、原生动物、真菌、蓝细菌、光合细菌、好氧革兰氏阴性有机营养细菌和古菌等组成[2-3]。
嗜盐和耐盐生物在三域中均有分布[4]。
其中的细菌类群是盐湖微生物的重要组成部分,它们适应了高盐环境,并参与湖中多种物质的循环与能量的传递过程。
因此研究盐湖中细菌的多样性对于完整地理解盐湖生态系统功能、开发利用极端环境微生物资源具有重要的意义。
我国是个多盐湖的国家,按照时空分布特点可以将全国的盐湖分为4个区:青藏高原盐湖区、西北部盐湖区、东北部盐湖区和东部分散盐湖区[5]。
我国盐湖主要集中在青藏高原盐湖区和西北部盐湖区。
其中尤以青藏高原盐湖区最为独特。
扎布耶盐湖地处西藏高原腹地西部,冈底斯山北侧,湖面海拔4421m ,面积242km 2,日照辐射84万J /c m 2・a,年均日照率7211%,太阳照度在145000Lux 以上,昼夜温差29℃,年均风速411m /s [6]。
扎布耶盐湖地理位置独特,具有高海拔、高寒、高盐、富含锂元素等特征。
从理论上讲,独特的生境孕育独特的生物资源。
但是由于青藏高原海拔高、高寒、缺氧等恶劣的环境条件导致采样极度困难,所以对于西藏盐湖中微生物资源的研究鲜见报端。
范华鹏[7]等曾研究过扎布耶盐湖古菌的多样性,而尚未见到对扎布耶盐湖细菌多样性的相关报道。
本文拟就扎布耶盐湖张现辉等:西藏扎布耶盐湖细菌多样性的免培养技术分析./微生物学报(2010)50(3)细菌的多样性问题开展研究,为了解盐湖极端微生物生态功能,开发利用极端微生物资源打下基础。
1 材料和方法111 材料11111 样品采集:样品于2008年9月17日采集自西藏扎布耶茶卡北湖南岸(N31°23′,E84°04′,湖面海拔4421米),包括湖边泥样和岸边湖水样品,其中湖水的实时测量盐度为23%(W/V),pH值为9,属于碱性卤水。
扎布耶湖水离子组成为:K+ 1112g/L,Na+6113g/L,S O2-42715g/L,Ca2+小于10mg/L,Mg2+14,1mg/L,P小于5mg/L,B r 8610mg/L,Cs5161mg/L,Cl-7514g/L,HCO-30, CO2-31112g/L,N2119mg/L(国家地质测试中心,北京)。
样品采集后,带回实验室,存于-80℃冰箱备用。
11112 主要试剂和仪器:高速冷冻离心机为Beckman Counter公司的64R台式离心机,电泳系统为北京市六一仪器厂的稳压稳流电泳仪DYY—B,凝胶检测及成像为ALPHA I notech公司的紫外凝胶成像系统;PCR扩增仪为B i o2Rad公司的i Cycler。
112 样品总D NA的提取DNA提取流程参考Mouné等[8]改进而来。
具体流程如下:取3g泥样,加入12mL50mmol/L的磷酸钠缓冲液(pH810),涡旋5m in。
6000×g, 10m in,弃上清回收细胞;沉淀中加入6mL裂解混合液1(0115mol/L NaCl,011mol/L EDT A, pH810),涡旋混匀,加入100μL15mg/mL的溶菌酶,混匀后37℃温浴1h;加入6mL混合液2 [015mol/L NaCl;50mmol/L Tris2HCl,pH810; 10%S DS(w/v)]冰浴10m in,65℃热浴10m in,循环3次;冰上冷却,加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提;6000×g,离心10m in,4℃;取上清,加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),抽提。
6000×g,离心10m in,4℃;取上清,加入等体积的冷异丙醇,-20℃静置1h;10000×g,10m in,回收DNA;干燥后加入400μL的TE缓冲液,存于-20℃备用。
所提总DNA用1%(w/v)琼脂糖进行电泳分离,紫外凝胶成像仪进行检测。
113 16S rRNA基因的PCR扩增选用一套引物530F(5′2GTGCCAGC MG CCGCGGT AA23′)和1492R(5′2T ACGGYT ACCTTG TT ACG ACTT23′),用来扩增细菌特异性的16S r RNA基因[9]。
PCR反应体系为50μL,包括50μmol/L的引物各1μL,5μL10×buffer,1μL 10mmol/L dNTP,2U Taq DNA聚合酶,模板DNA溶液1μL,ddH2O补足50μL体系。
PCR扩增程序如下:95℃预变性1m in,95℃热变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环,72℃延伸10m in。
114 克隆和转化PCR扩增产物根据琼脂糖回收试剂盒说明书(天根生化,北京)进行纯化回收,回收产物用pGE M2T载体系统(Pr omega,US A)进行酶联,连接产物转化到Escherichia coli DH5α高感受态细胞(天根生化,北京),构建16S r RNA基因文库。
将转化产物平铺到含有I PTG、X2gal及氨苄青霉素的平板上过夜培养,筛选阳性克隆。
115 核糖体D NA扩增片段限制性内切酶分析(AR D RA)克隆子接种到含氨苄的液体培养基中,经过夜摇菌培养后,取115mL用质粒小提试剂盒(天根生化,北京)提取质粒DNA。
对于阳性克隆,选用T OY OBO的HaeШ对含克隆片段的质粒进行酶切,采用10μL酶切反应体系:内切酶115U,DNA 012-1μg,10×缓冲液2μL,37℃温浴1h,酶切失活条件为:80℃,20m in,终止反应。
取6μL进行电泳检测,电泳参数为:2%(w/v)琼脂糖,80V,40m in。
将电泳后的琼脂糖胶在E B 溶液中染色15m in,脱色15m in,紫外凝胶成像检测,统计操作分类单元(OT U s)的数量。
对于含有较多克隆片段的OT U1,用HhaⅠ二次酶切,10μL酶切反应体系如下:10×缓冲液,10×BS A,内切酶2U,37℃温浴1h,65℃20m in终止反应。
电泳检测方法如上所述。
116 D NA测序与序列分析选择不同OT U s的阳性克隆送到上海生工公司进行测序,测序结果用DNAman进行序比对后删除序列头部中所含的载体序列,根据测序图谱去除尾部信号杂带,余下700-800bp序列用作后续分析。
提交序列到GenBank中进行序列同源性比对,找到各序列的最佳匹配的16S r RNA序列。
分别从NCB I 中调出这些相似序列,采用MEG A410软件包中的Ki m ura22Para meter D istance模型进行多序列匹配排列。
根据排列结果,删除匹配结果中多余的部分序列后,余下全部比对序列长度都在700bp左右,用这些序列再次进行多序列比对,根据比对结果用邻接法((Neighbor2j oining method)构建系统发育树[10]。
根据所得到的序列分析结果,进一步分析扎533Xianhui Zhang et al ./A cta M icrobiologica S inica (2010)50(3)布耶盐湖中的细菌多样性。
117 GenBank 数据库登录号(Accessi on nu m ber)经Gen Bank 上Vecscreen 在线检测去除克隆载体污染序列后,共向GenBank 提交102个16S r RNA 基因的部分序列,数据库登录号为G U130304-G U130405。
2 结果211 D NA 提取和PCR 扩增从扎布耶盐湖沉积样品中,我们成功提取了总DNA ,DNA 条带单一、完整,说明上述方法适合于高盐生境样品中总总DNA 的提取。
以总DNA 为摸板,利用细菌引物组合530F +1492R,扩增出来了长度约1kb 的细菌16S r RNA 基因片段。
212 AR D RA 分型结果根据蓝白斑筛选的原理,在平板上显示白色的克隆为插入了16S r RNA 基因片段的阳性克隆,本研究共分析了309个阳性克隆。
