酶联免疫吸附试验检测呕吐毒素测量不确定度评定
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酶联免疫吸附试验检测小麦中呕吐毒素测量不确定
度评定的探讨
摘要目的探讨酶联免疫吸附试验( E L I S A) 检测呕吐毒素( DON ) 测量不确定度的评定。
方法按照《GB/T5009.1113-2003 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定第二法》，分析测量过程的不确定度分量,合成各试剂盒检测系统的扩展不确定度。
结果总扩展不确定是 ( K= 2 ) 。
结论含有测量不确定度的结果基本能反映测量的真实水平，有助于了解目前国产 E L I S A试剂手工法检测低水平 H B s A g的实际情况。
关键词呕吐毒素；酶联免疫吸附试验；测量不确定度
酶联免疫吸附试验原理是将已知抗原吸附在固相载体表面，洗除未吸附抗原，加人一定量抗体与待检试样（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物。
洗除多余抗体成分，然后加人酶标记的抗免疫球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物结合，加人酶底物。
在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，根据标准曲线计算被测试样中的抗原量。
酶联免疫吸附试验( E L I S A) 已广泛应用于食品、饲料、中药材中化学成分的测定，国标方法《GB/T5009.1113-2003 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》第二法规定了检测呕吐毒素的免疫测定（ELISA）方法。
该方法具有简便、快速同时又不需要复杂的实验设备的优势。
但缺点是在样品处理、加样、孵育、洗板、比色等实验过程中存在诸多影响实验结果的不确定因素，对其测量不确定度的评定显得非常重要。
本文以《测量不确定度评定与表示》( JJ1059-1999 )为依据，测定粮食中呕吐毒素含量为例，应用酶标分析仪测定标液和样本的OD值，根据实验原理建立数学模型，分析使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中呕吐毒素，不确定度的计算方法和步骤，建立了酶联免疫吸附法测定呕吐毒素的评定方式。
1材料和方法
1.1材料
（1）呕吐毒素酶免检测试剂盒批号：20120201，江苏省苏微微生物研究有限公司；（2）小麦：送检样品。
1.2仪器
（1）万分之一电子天平( 岛津公司)，型号AEL-200，量程0 g~200 g 最大允许误差±0.02（2）A级50 mL 单标线吸量管最大容量允差±0.050 mL。
（3）A级5 mL移液管最大容量允差±0.015 mL。
（4）200 uL 可调移液器，芬兰雷勃公司公司，经检定合格容量允许误差（%）±3.0重复性（%）≤ 1.5。
（5）酶标仪(奥地利SUNRISE公司) 经计量部门检定合格，给出的重复性为0.0006；1.3方法
按照《GB/T5009.1113-2003 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定第二法》进
行测定。
2 建立数学模型
样品中呕吐毒素含量的定量数学模型为： DON 浓度（ng/g ）=m
1D v v c 21⨯⨯⨯
式中：c —呕吐毒素含量，单位为纳克（ng ），对应标准曲线按数值插入法求。
V1—试样提取液的体积，单位为毫升（mL ）。
V2—滴加样液的体积，单位为毫升（mL ）。
D —稀释倍数。
m —试样质量，单位为克（g ）
3测量的不确定度分量的来源分析
按标准规定和试剂盒说明书， 测量 HB s A g 基本流程为：称取5g 粉碎样品于100ml 带塞三角瓶中，加入50ml 蒸馏水。
充分振荡3分钟，然后用定性滤纸过滤，收集滤液。
取滤5ml ，加入5ml 超纯水或蒸馏水，混匀，定性滤纸过滤，此为样品待检液。
分别加标准品或待测样品50μl ，然后再加入DON 抗体50μl 。
酶标板避光室温反应30分钟。
弃去孔内液体，甩干，用洗涤液洗板4次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干。
每孔加酶标二抗 100μl ，37℃，30分钟。
温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板4次，每次浸泡1-2分钟，200μl/每孔，甩干；依序每孔加显色液100μl ，避光室温反应10分钟，依序每孔加终止溶液50μl ，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
因此测量不确定度分量包含测 量重复性、 实验操作以及酶标仪比色的不确定度。
3.1测量不确定度的来源
( 1 )测量样品重复性引入的不确定度； ( 2 )标准曲线制备引入的不确定度； ( 3 )使用移液管和移液器时引入的不确定度； ( 4 )电子天平引入的不确定度；
( 5 )由酶标仪测定 O D 值引入的不确定度。
3.2 测量标准不确定度的评定
3.2.1重复测量样品DON 含量引入的标准 表1 DON 总重复性u rel- 0
平均值（ug/kg ） 964.7； 单次测量的标准偏差（ug/kg ） 19 平均值的标准偏差（ug/kg ） 6.0
相对标准偏差u rel- 0= 0.12/3.47 ×100%=0.39% 3.2.2工作曲线拟合引入的标准不确定度u （c ），
由质量浓度分别为0,12.5,25,50,100,200ng/ml 的DON 标准溶液绘制标准曲线。
DON 标准溶液曲线见表2。
表2 DON 标准溶液曲线 吸光度 浓度ng/ml 标准1 1.701 0 标准2 1.385 12.5 标准3 1.131 25 标准4 0.800 50 标准5 0.532 100 标准6 0.301 200
采用最小二乘法进行线性回归，方程为： y= bc + a ．
式中：y ——吸光度du 值测定值；
c ——理论含量； b ——斜率； a ——截距。
根据表2求得标准工作曲线回归方程为： y=O ．077 1 x+1．229 1．r=O ．999 5． 被测量c 的标准不确定度为：
()()()
∑=--++=n
1
i 2
i
2
r
c c
c c n
1p 1b s c u。
