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附件1保健食品中75种非法添加化学药物的检测BJS 2017101 范围本方法规定了保健食品中利血平、格列喹酮、羟基豪莫西地那非、硫代艾地那非、格列苯脲、格列美脲、豪莫西地那非、伐地那非、西地那非、那红地那非、伪伐地那非、那莫西地那非、瑞格列奈、红地那非、格列吡嗪、洛伐他汀羟酸钠盐、尼莫地平、辛伐他汀、氨氯地平、洛伐他汀、美伐他汀、氨基他达拉非、他达拉非、佐匹克隆、尼索地平、脱羟基洛伐他丁、哌唑嗪、非洛地平、格列波脲、尼群地平、罗格列酮、吡咯列酮、罗通定、醋氯芬酸、硝苯地平、三唑仑、青藤碱、呋塞米、咪达唑仑、格列齐特、劳拉西泮、酚酞、二氧丙嗪、氯硝西泮、阿普唑仑、扎来普隆、氯氮卓、氢氯噻嗪、艾司唑仑、奥沙西泮、地西泮、硝西泮、西布曲明、文拉法辛、氯苯那敏、氯美扎酮、甲苯磺丁脲、阿替洛尔、N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明、沙丁胺醇、司可巴比妥、褪黑素、芬氟拉明、苯巴比妥、可乐定、异戊巴比妥、卡托普利、苯乙双胍、巴比妥、麻黄碱、丁二胍、氨甲环酸、二甲双胍和烟酸的液相色谱-串联质谱检测方法。
本方法适用于片剂、口服液、硬胶囊和软胶囊保健食品中的利血平、格列喹酮、羟基豪莫西地那非、硫代艾地那非、格列苯脲、格列美脲、豪莫西地那非、伐地那非、西地那非、那红地那非、伪伐地那非、那莫西地那非、瑞格列奈、红地那非、格列吡嗪、洛伐他汀羟酸、尼莫地平、辛伐他汀、氨氯地平、洛伐他汀、美伐他汀、氨基他达拉非、他达拉非、佐匹克隆、尼索地平、脱羟基洛伐他丁、哌唑嗪、非洛地平、格列波脲、尼群地平、罗格列酮、吡咯列酮、罗通定、醋氯芬酸、硝苯地平、三唑仑、青藤碱、呋塞米、咪达唑仑、格列齐特、劳拉西泮、酚酞、二氧丙嗪、氯硝西泮、阿普唑仑、扎来普隆、氯氮卓、氢氯噻嗪、艾司唑仑、奥沙西泮、地西泮、硝西泮、西布曲明、文拉法辛、氯苯那敏、氯美扎酮、甲苯磺丁脲、阿替洛尔、N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明、沙丁胺醇、司可巴比妥、褪黑素、芬氟拉明、苯巴比妥、可乐定、异戊巴比妥、卡托普利、苯乙双胍、巴比妥、麻黄碱、丁二胍、氨甲环酸、二甲双胍和烟酸共75种非法添加物质的检测，同样适用于片剂、口服液、硬胶囊、软胶囊类声称具有保健功效的食品中上述75种物质的检测。
附件食品中那非类物质的测定（BJS 201805）1 范围本标准规定了食品（含保健食品）基质中90种那非类物质的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。
标准中方法一超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中90种那非类物质的定性和定量测定。
标准中方法二超高效液相色谱-串联高分辨质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中90种那非类物质的筛查和定性确证。
方法一超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法2原理试样经甲醇超声提取，过滤后，滤液供超高效液相色谱—三重四极杆串联质谱仪测定，外标法定量。
3试剂和材料注：水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂3.1.1 甲醇（CH3OH）：质谱级。
3.1.2 甲酸（HCOOH）：质谱级。
3.1.3 乙酸乙酯（C4H8O2）：分析纯。
3.1.4 盐酸（HCl）：分析纯。
3.2 试剂配制3.2.1 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1mL用水稀释至1000mL，用滤膜（4.3）过滤后备用。
3.2.2 盐酸甲醇溶液（1+99）：取盐酸1mL用甲醇稀释至100mL。
3.2.3 甲醇水溶液（1+1）：将甲醇与水等体积混合。
3.3 标准品西地那非等90种物质标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见附录A表A.1，纯度≥98%。
3.4 标准溶液配制—1 —3.4.1标准储备液（200 μg/mL）：分别精密称取Lodenafil carbonate（46罗地那非碳酸酯）、Sildenafil dimer impurity（63西地那非二聚体杂质）、Vardenafil dimer（69伐地那非二聚体）标准品（3.3）各10mg，用盐酸甲醇溶液（1+99）溶解并稀释至50mL，摇匀；分别精密称取其余87种标准品（3.3）各10 mg，用甲醇溶解并稀释至50mL，摇匀，制成浓度为200 μg/mL标准储备液。
保健食品卫生学理化检验规范（征求意见稿）Standards for Hygienic Physical and Chemical Examination of Health Food目录第一部分总则.................................................. 错误!未定义书签。
一、主题内容和适用范围 ...................................... 错误!未定义书签。
二、基本要求................................................. 错误!未定义书签。
第二部分二十五种功效成分和标志性成分检验方法.................. 错误!未定义书签。
一、保健食品中红景天苷的测定.................................. 错误!未定义书签。
二、保健食品中大蒜素的测定 ................................... 错误!未定义书签。
三、保健食品中芦荟苷的测定 ................................... 错误!未定义书签。
四、保健食品中肉碱的测定 ..................................... 错误!未定义书签。
五、保健食品中α-亚麻酸、γ-亚麻酸的测定...................... 错误!未定义书签。
六、保健食品中人参皂苷的测定.................................. 错误!未定义书签。
七、保健食品中原花青素的测定.................................. 错误!未定义书签。
八、保健食品中核苷酸的测定 ................................... 错误!未定义书签。
九、保健食品中洛伐他汀的含量测定.............................. 错误!未定义书签。
谷胱甘肽含量测定测定原理：还原型GSH：DTNB能被-SH基团还原，产生等克分子2-硝基-5-巯基苯甲酸。
硝基巯基苯甲酸阴离子呈黄色，在可见光412nm波长处有吸收峰，可用于测定巯基总谷胱甘肽：类上，只不过多了一个辅酶Ⅱ还原体系利用2GSH的氧化还原DTNB生成2TNB+2H+,氧化后的GSH（GSSG）又被NADPH还原；在反应中，NADPH量逐渐减少，TNB量逐渐增加，TNB在412nm光吸收增加速率（△A412/min）与总GSH量呈正比。
由于GSH和GSSG循环交替，周而复始，总量不变，故称循环法。
仪器：分光光度计试剂：1）5%磺基水杨酸2）磷酸盐缓冲液：0.1mol/l 磷酸钾缓冲液PH8.0 含1mmol/l EDTA（分子量372）3）1mmol/l DTNB（分子量396.35）用1%柠檬酸钠溶液配制：0.396354）1%柠檬酸钠溶液5）NADPH（分子量833.4）1mmol/l6) GR酶液（现配现用）：酶标品20ul (NH4)2SO4(3.6M)930ul7）1mmol/L的GSH（分子量307.33）注：分子量：EDTA(372),DTNB(396.35) KH2PO4(136.09) K2HPO43H2O(228.22)样品的处理：取样品，加入５％磺基水杨酸１ml,冰浴迅速研磨匀浆；6000rpm8分钟左右取上清标准曲线的绘制：（由于测GSH和总GSSG共用了同一个反应，可以绘制一条标准曲线）GSH(um) 0 20 40 60 80 1001.0mmol/L GSH(ml)0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25双蒸水0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.250.1mol/L PBS 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0DTNB试剂0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5混匀，5min内412nm比色，以双蒸水调零。
以标准GSH溶液为X轴，相应的吸光度为Y 轴，绘制标准曲线，并求得回归方程样品液GSH测定：试剂测定管空白管待测样品液0.1 0.10.1mol/L PBS 4.4 4.4DNTB 0.5 ------双蒸水——0.5混匀，5分钟内，412nm处读取光密度样品液总谷胱甘肽测定反应体系：0.1ml 样+0.1mlDTNB+0.1mlNADPH+0.05mlGR+0.65mlPBS测△A412=（A412）2—（A412）1对于谷胱甘肽还原酶的用量影响最终测定结果，故每批测定必须同时做标准曲线。
尿中反反式粘糠酸苯巯基尿酸和8 羟基脱氧鸟苷的测定
苯是一种广泛存在于工业和生活环境中的化学污染物。
基于苯对人体的危害性，世界诸多发达国家均制订了工作场所相应的职业卫生标准以保护职业苯接触工人的身体健康，但由于作业环境苯浓度的监测数据并不能完全客观地反映个体接触的实际情况和个体易感性，尤其不能反映机体体内蓄积作用(内暴露剂量)，用于对长期低剂量职业苯接触工人的危险度评价有一定的局限性。
苯的生物标志物因其灵敏度高，特异性强，更能客观、全面、准确反映工人的实际接苯状况，因此更适合作为职业苯接触工人暴露水平检测、健康监护、暴露危害性评价。
生物标志物根据性质不同可分为接触标志物、效应标志物。
目前研究较多的苯接触标志物有反-反式粘糠酸（tt-MA）与苯巯基尿酸（S-PMA）。
表1为2种接触标志物的比较。
进入机体的苯约2%-25%通过体内代谢酶的作用转化为tt-MA，但食品中的防腐剂山梨酸回产生正干扰，目前通用的检测技术是液相色谱-紫外检测法，能够满足我国卫生限值3.0 mg/g肌酐对检测的要求。
S-PMA转化比例低，为0.1%-0.5%，但有更长的生物半减期和更高的特异性，该化合物的检测必须要使用质谱检测器才能满足美国卫生限值25 μg/g肌酐（我国尚无卫生限值）对检测检出限的要求。
总之，S-PMA生物监测的应用价值明显优于tt-MA，但对检测技术的要求更高。
表1 2种接触标志物的比较
代谢物名称苯转化比例特异性检测技术限值
反-反式粘糠酸2%-25% 有干扰HPLC-UV 3.0 mg/g肌酐
8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是研究最的早期效应标志物。
8-OHdG是主要的DNA氧化产物之一，是评价DNA氧化损伤的通用指标。
虽不是苯暴露的特异性标志物（除苯暴露外，如多环芳烃类和丁二烯等也可诱导DNA氧化损伤），但可以通过8-OHdG反映DNA损伤情况来间接评价苯暴露情况。
目前报道的检测方法为液相色谱电化学检测法，尿液中8-OHdG的含量0-15ng/ml。
目前国内为尚没有对尿中反-反式粘糠酸、苯巯基尿酸和8-羟基脱氧鸟苷3种物质同时检测的报道。
本文报道了尿中8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG，DNA 氧化损伤后代谢产物）、反-反式粘糠酸（tt-MA，苯接触者尿中代谢标志物）、苯巯基尿酸（S-PMA，苯接触者尿中代谢标志物）含量测定的高效液相色谱-串联质谱法。
1 范围
本方法适用于尿中8-羟基脱氧鸟苷、反-反式粘糠酸、苯巯基尿酸的同时测定。
本检测方法的最低检出浓度：8-羟基脱氧鸟苷为0.3 μg/L，反-反式粘糠酸为9 μg/L，苯巯基尿酸为0.15 μg/L。
2 原理
尿样经解冻、离心、调节pH、C18固相萃取柱富集净化后，用液相色谱-质谱/质谱法进行测定和确证，外标法定量。
测定结果用尿肌酐进行校正。
3 试剂和材料
3.4 甲醇溶液（10%）：90ml水中加入10ml甲醇，混合，超声脱气，用于配置标准溶液。
3.5甲酸铵溶液（1 mol/L）：准确称取6.3 g甲酸铵于100ml 烧杯中，用水溶解，转移到100容量瓶，定容至刻度，混匀后冷藏备用。
3.6甲酸-甲酸铵溶液I：10ml 1 mol/L甲酸铵溶液，2ml甲酸，88ml水混合而成。
用于样品上SPE 小柱前对样品进行pH调节。
3.7甲酸-甲酸铵溶液II：2.5ml 1 mol/L甲酸铵溶液，0.5ml甲酸，500ml水混合而成。
此溶液作为流动相中
的水相。
3.8 甲酸-甲酸铵-甲醇溶液：甲酸-甲酸铵溶液II/甲醇=90/10（V/V），此溶液作为样品上机前的溶剂。
3.9标准品：8-羟基脱氧鸟苷，反-反式粘糠酸，苯巯基尿酸3种标准品的纯度大于98%。
3.10标准储备液（100μg /ml）：精密称取10mg标准品于100ml容量瓶中，用10%甲醇溶液作溶剂定容。
冷藏避光保存，此溶液可以使用3个月。
3.11 混合标准中间液（8-羟基脱氧鸟苷1μg /ml、反-反式粘糠酸10μg /ml、苯巯基尿酸1μg /ml）：取适量标准储备液于1.0ml进样小瓶中，用10%甲醇溶液作溶剂稀释而成，冷藏避光保存，此溶液可以使用1周。
3.12固相萃取柱：填料为苯磺酸化的聚苯乙烯- 二乙烯基苯高聚物，键合相为C18，规格为60 mg/3 mL。
使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水活化平衡。
4 仪器（略）
5 样品处理
5.1 试样净化前的准备
冷冻尿样室温解冻。
用移液器移取2ml到子弹头塑料离心管中，12000rpm离心10分钟。
移取1ml上清液于另一只子弹头塑料离心管中。
加入甲酸-甲酸铵溶液I 0.2ml，混匀，静置10分钟后进行净化。
5.2 样品净化-上样
将 5.1 中的待净化液用移液器全部转移至已经活化的固相萃取柱中。
待样液吸附在柱床后，用洗耳球吹去柱床中的液体，上样过程中小柱流出的液体弃去。
5.2 样品净化-洗脱
用移液器精密移取1.0ml 甲醇到小柱中，收集洗脱液于小试管中，待柱床上部甲醇流完后，用洗耳球吹净柱床中的甲醇。
把小试管置于氮吹仪上，在温度50 ℃加热下用小流速氮气吹干，残留物（相当于 1.0 ml 样品）中加入1.0 mL甲酸-甲酸铵-甲醇溶液，超声1分钟使溶解，用手震摇混匀或涡旋半分钟，转移到子弹头离心管，12000rpm 离心15分钟，用移液器转移到进样小瓶，上机测定。
6 仪器测定
6.1 液相色谱参考条件
6.1.1 色谱柱：Waters symetty C18柱（5.0μm、2.1mm i.d. ×150mm）。
6.1.2 柱温：40℃。
6.1.3 进样体积：20μL。
6.1.4 流速：0.40mL/min。
6.1.5 流动相：A液为甲醇，B液为甲酸-甲酸铵溶液II，梯度洗脱，洗脱程序如表2所示。
表2 液相色谱流动相梯度洗脱程序
时间/min 甲醇/% 甲酸-甲酸铵溶液II/%
0 10 90
1.5 10 90
7.0 90 10
9.0 90 10
9.2 10 90
15 10 90
6.2质谱参考条件：
四种目标物的特征离子见表3。
表3 参考质谱条件
化合物保留时间母离子（m/z）锥孔电压子离子（m/z）碰撞能量/eV
/min /V
8-OHdG 2.3 284.2 ESI+ 80 168.0 10
tt-MA 3.5 141.0 ESI- 60 97.0
53.0
1
4
S-PMA 7.5 238.1 ESI- 70 109 16 注：表2中8-OHdG与S-PMA只有一个子离子。
6.3 基质标准曲线的绘制
基质空白尿液很难获取，所以取刘华良2010-08-05尿液作为基质尿液，按照5进行处理。
用所得的样品溶液将混合标准中间液逐级稀释得到的浓度为0、0.001（0.01）、0.005（0.05）、0.01（0.1）、0.05（0.5）、0.1（1.0）μg/mL 的标准工作液（其中括号中为反-反式粘糠酸的浓度，比其余2种化合物浓度大10倍），浓度由低到高进样检测，以定量子离子峰面积（y）-浓度（x）作图，得到基质标准曲线回归方程。
基质匹配加标的样品LC-MS/MS 多反应监测质量色谱图参见图1、图2、图3。
6.4 结果计算
由于刘华良2010-08-05尿液并非完全空白基质，所以，由线性回归方程计算得到的质量浓度要加上刘华良2010-08-05尿液的质量浓度（由线性方程计算，Y=0时，X值即为刘华良尿液中待测物浓度），两者之和用肌酐校正后(WS/T 97-1996 尿中肌酐分光光度测定方法)，以μg/L为单位报结果，保留一位小数且不超过三位有效数字。
计算公式略。
7 空白实验
用水代替尿样，其余同样品检测过程进行。
理论上空白试验应为未检出。
8 回收率
添加浓度为10μg/L时，8-羟基脱氧鸟苷、苯巯基尿酸的平均回收率为85.1%、85.6%；
添加浓度为100μg/L时，8-羟基脱氧鸟苷、苯巯基尿酸的平均回收率为97.4% 、97.2%；
添加浓度为100μg/L时，反-反式粘糠酸的平均回收率为93.7%；
添加浓度为1000μg/L，反-反式粘糠酸的平均回收率94.1%。
9 允许差
对不同浓度的基质加标溶液，连续进样6次得到仪器方法精密度，用相对标准偏差表示，见表4。
表4 仪器方法相对标准偏差
浓度8-OHdG tt-MA S-PMA
10μg/L 1.2% - 0.8%
100μg/L0.8% 5.2% 0.8%
1000μg/L- 1.2% -
图1 8-羟基脱氧鸟苷的质量色谱图（左图浓度为100μg/L；右图浓度为1.0μg/L，S/N=10）
图2 反-反式粘糠酸的质量色谱图（左图浓度为1000μg/L；右图浓度为10μg/L，S/N=3）
图3苯巯基尿酸的质量色谱图（左图浓度为100μg/L；右图浓度为1μg/L，S/N=20）。
