Anne in V和PI染色步骤及注意事项

Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit一、试剂盒说明在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS ）由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca 2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V 进行荧光素FITC 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI ）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。

二、试剂盒组份 组份(20 assays) (50 assays) (100 assays) 储存条件 AnnexinV-FITC100 μL 250μL 500 μL Propidium Iodide100 μL 250μL 500 μL Binding Buffer 10.0 mL 25 mL 50 mL 注：1、Annexin V-FITC 组份建议按需分装小份冻存于-20℃，避免反复冻融； 2、Propidium Iodide 和Binding Buffer 组份不用时可放置于4℃保存，Propidium Iodide 需要避光。

3、Store at -20℃ for 12 months三、试剂盒以外自备仪器和试剂流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器 1.5m L Microtube 、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS 、不含EDTA 的胰酶消化液四、使用注意事项1.微量试剂取用前请离心集液。

凋亡操作步骤Annexin V-FITC／PI法检测细胞凋亡1.将细胞收集到离心管中，1000rpm离心10min，除去上清，用4℃预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心10min，再重复一次，最后除去上清；2.在冰浴上，加入500μl的上样缓冲液到离心管中，用吸管吹打使细胞重悬，然后转移到1.5ml EP管中；3.先加入5μl AnnexinV-FITC，振荡均匀后4℃避光孵育15min，然后再加入5μlPI，同样孵育5min；4.孵育后立即上流式细胞仪分析。

注意：●需制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：a.没有染色的细胞；b.经过处理，仅用AnnexinV-FITC染色的细胞；c.经过处理，仅用PI染色的细胞。

●理想样品浓度调至105-106 cells/ml，一般实验只需0.5 ml的样品。

周期操作步骤1.细胞培养●药物作用后，将细胞胰酶消化，轻轻吹打下细胞至15ml离心管。

●1000 rpm×5 min离心，弃上清。

2.细胞固定●加入3ml 预冷PBS重悬细胞，1000 rpm×5 min离心，弃上清。

●加入500ul PBS，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个，在V ertex上低速涡旋震荡（1档），逐滴加入到1.5 ml 100%乙醇（4℃），使其终浓度为75% ，4℃放置过夜固定。

（注意：这里是细胞悬液逐滴加入到100%乙醇中）3.细胞标记●取出固定的样品，1000 rpm×5 min离心，弃上清。

●加入3 ml预冷PBS重悬细胞，1000 rpm×5 min离心，弃上清，收细胞。

●加入150 μl RNaseA（250 μg/ml PBS稀释）重悬细胞，37℃消化30分钟。

●加入150 μl PI（100 μg/ml ,PBS溶解），4℃避光染色30分钟。

●转至流式检测管，分析细胞DNA含量的变化及细胞周期。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。

将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

方法
1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。

注意事项
1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。

3. 保证细胞的状态，避免出现过多的死亡细胞
4. 操作过程避免过度用力，以免出现机械性细胞死亡
5. 使用去离子水准备所需溶液
6. 4-8℃避光保存试剂盒
7. 使用一次性吸头，避免出现交叉污染。

FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞一、实验目的a)了解凋亡细胞的变化及检测方法。

b)了解FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞的原理及方法。

二、实验原理a)细胞凋亡是细胞内由多个基因控制的死亡程序被活化而导致的细胞自杀（cell suicide）。

膜磷脂酰丝氨酸原来位于细胞膜的内部。

在细胞凋亡早期，细胞膜上的膜磷脂酰丝氨酸外翻与AnnexinV结合，使其被染成绿色。

在细胞凋亡晚期，细胞膜破裂，使得PI进入细胞当中与DNA结合，使其被染成红色。

b)细胞坏死（cell necrosis）：是由外部化学、物理或生物因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解，也被描述为细胞谋杀（cell murder）。

c)喜树碱（camp tothecin，CPT）是一种植物来源的抗肿瘤药物，可诱导肿瘤细胞凋亡。

d)Annexin V是一种可与磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）特异结合但不能通过正常细胞膜的物质。

碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一种发出红色荧光的DNA结合染料，也不能透过活细胞完整细胞膜。

e)细胞凋亡早期，细胞膜PS由膜脂双层内侧转位至外侧，FITC标记的AnnexinV（AnnexinV-FITC）即可与其结合，使细胞膜处呈绿色。

细胞凋亡中晚期，膜通透性变大，PI可进入细胞与核内DNA结合。

f)激光共聚焦显微镜（LSCM）以单色激光作为光源，并用附设光源针孔(pinhole)使光源成为点光源.除此之外，在检测器前方也有一个检测针孔，点光源对标本内焦平面上的每一检测针孔后的光电点扫描，标本上的被照射点在检测针孔成像，由倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像，光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，焦平面以外的点不会在检测针孔成像，这就是所谓的“共聚焦”，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。

1.细胞处理，注意设置阴性对照。

2.准备1x Annexin-binding buffer(Component C)，5ml5X Annexin-binding buffer+20ml去离子水.3.准备100ug/ml的PI工作液。

（初始保存液(Component B) 浓度为1mg/ml，用1X Annexin-binding buffer 稀释10倍。

5ul(Component B) +45ul 1x Annexin-binding buffer）,将没用完的储存起来。

下次使用。

4.用预冷的PBS洗两次细胞，然后用500ul pbs将细胞吹下来，然后4°离心，1500r,7min,弃上清，然后用100ul 1xbuffer重悬，每管加入5ulannexinV和1ul PI工作液。

5.室温孵育15min.搜集细胞。

上流式1.细胞处理，注意设置阴性对照。

2.准备1x Annexin-binding buffer(Component C)，1ml5X Annexin-binding buffer+4ml去离子水.3.准备100ug/ml的PI工作液。

（初始保存液(Component B) 浓度为1mg/ml，用1X Annexin-binding buffer 稀释10倍。

5ul(Component B) +45ul 1x Annexin-binding buffer）,将没用完的储存起来。

下次使用。

4.配制染液（每孔100ul 1X buffer+5ul AnnexinV+1ul 1X PI）5.用预冷的PBS洗两次细胞，然后每孔加100ul上述染液。

6.室温孵育15min.7.每孔补加400ul1XAnnexin-binding buffer。

吹下来。

上流式。

磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。

磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。

体内的吞噬细胞可通过识别磷脂酰丝氨酸来清除凋亡细胞。

Annexin-V（green）是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合，细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期坏死细胞可能为阴性），是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。

将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测的发生。

PI和Annexin-V双标：碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

*注意：时其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。

在分析结果时应该注意。

活细胞不能被Annexin V-FITC或PI染色（右图左下象限）。

早期凋亡细胞因磷脂酰丝氨酸的暴露及具有完整细胞膜，故呈Annexin V-FITC染色阳性及PI染色阴性（右图右下象限）。

坏死或晚期凋亡的细胞呈Annexin V-FITC及PI染色双阳性（右图右上象限）。

*注意：未处理的对照细胞进行常规培养的过程中也有一小部分的细胞死亡发生。

悬浮细胞的染色：Ⅰ、将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（×106）用PBS洗2次，加入200μlBinding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10μl及PI(50ug/ml)5μl,室温避光30min,加入400μlPBS，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1小时），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。

Annexin V凋亡检测常见问题盘点Annexin V是一种分子量约35kDa的钙依赖性磷脂结合蛋白。

可与细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）高亲和力特异性结合，是检测细胞凋亡的最常用的试剂之一。

AnnexinⅤ偶联FITC、EGFP 等荧光标记，并与膜不通透型DNA荧光染料PI（碘化丙啶）或7-AAD（7-氨基放线菌素D）联用可以区分早期凋亡与晚期凋亡或坏死细胞。

本文中，小尚总结了Annexin V凋亡检测常见的一些问题，帮助大家做出更准确的实验结果。

Q染色时间是多长？A通常为室温避光染色10-15min，染色时间过长并不会显著增加染色强度，反而可能因为长时间室温及不适宜细胞存活的染色环境导致假阳性影响实验稳定性。

Q染色后怎么处理数据？A荧光显微镜下可以配合细胞计数板，对活细胞、凋亡前期细胞、凋亡后期及死细胞进行分别计数，计算各部分细胞的比例。

流式则可以根据软件自带的系统分析各部分细胞比例。

Q染色后怎么区分凋亡前期与后期的细胞？A以Annexin V-FITC/PI双染为例，凋亡前期的细胞只带FITC荧光，凋亡后期及坏死细胞除FITC 荧光外还会带PI荧光，从流式和荧光显微镜结果来看的话见下图示例：左图：SF9细胞（SNL-170）高密度培养24h后通过Annexin V-FITC染色检测，采用荧光显微镜观察（白光+FITC荧光+PI荧光三色合成图片），无荧光为正常细胞，FITC荧光（绿色）为凋亡早期细胞，FITC荧光（绿色）+PI荧光（红色）为凋亡后期或死细胞。

右图：Jurkat 细胞用5μM 喜树碱处理4h后通过Annexin V-FITC染色检测，采用流式细胞仪检测，左下分区（无荧光）为正常细胞，右下分区（FITC荧光）为凋亡前期细胞，右上分区（FITC+PI荧光）为凋亡后期或死细胞。

Q染色后样本检测无荧光怎么办？A首先检查各试剂是否在有效期内，是否正确使用各组分，仪器是否正常工作；其次可以配合台盼蓝染色检查细胞样本本身是否死亡偏少，若确实偏少可以调整药物处理浓度和时间；最后可以提高染色液浓度2倍对样本再次进行染色。

注意事项丨艾美捷Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒( Annexin V-FITC/ PI Apoptosis Detection Kit)是用FITC融合的重组人Annexin V来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸(PS)的一种细肥凋亡检测试剂盒。

可以使用流式细胞仪、荧光微镜或其它荧光检测设备进行检测。

图源：网络Annexin V是一种分子量为358kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,广泛分布于真核细胞胞浆内,参与细胞信号转导。

Annexin V能与磷酯酰丝氨酸( phosphatidylserine简称PS)高亲和力、特异地结合。

在正常细胞要分布在细胞膜内侧,在细胞发生凋亡的早期,细胞膜上的PS会外翻到细胞表面。

用带有绿色荧光的Annexinv-fitc标识出凋亡细胞。

艾美捷Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒还提供了碘化丙啶（PI），PI可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞,呈现紅色荧光,用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后,正常的活细胞不被Annexin V-FITC和PI染色;凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC染色,PI染色呈阴性;坏死細胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FTC和PI双重染色,以区别凋亡早期细胞。

艾美捷Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒注意事项：1.该试剂盒只能检测活细胞,而不能用于切片、擦刮、固定或浸润细胞样品的检测。

2.细胞凋亡是一种持续变化的动态过程,选择合适的诱导时间对观察凋亡比较重要。

染色后宜尽快检测,时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加3.如果有细菌或真菌污染,会严重影响检测效果。

4.PBS洗涤细胞,洗掉残留的胰酶,否则残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FTC,最終导致染色失败。

AnnexinV-FITCPI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作说明细胞凋亡是细胞的基本特征之一,它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。

在细胞凋亡过程中,细胞内膜的磷酯酰丝氨酸外翻到细胞外膜,而Annexin V(膜联蛋白V)对其有天然的高亲和能力,故可以用FITC标记(绿色荧光)的Annexin V来检测细胞凋亡,但本方法的缺点是不能区分早期和晚期的凋亡细胞。

早期和晚期的凋亡细胞的一个重要区别在于细胞膜的完整性(凋亡早期细胞没有丧失膜的完整性),故可以用碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)来染色加以区分。

图源：网络Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒特点：1. 即开即用,不需要专门花时间准备各种成分。

2. 整合了Annexin V-FITC和PI检测法的优点,提高了凋亡细胞检测的灵敏度和特异性,本方法是目前极为灵敏的细胞凋亡检测方法。

3. 跟流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测兼容。

Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作步骤：(一)获得目的基因1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

(二)构建重组表达载体1、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

(三) 获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp 或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。

（Annexin V－FITC）/ PI双染法检测肿瘤细胞坏死及凋亡情况：原理：细胞膜组分磷脂酰丝氨酸（PS）在正常情况下位于细胞膜内侧，当细胞坏死或凋亡时，则迁移至细胞膜外侧。

磷脂结合蛋白V（Annexin V）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与PS具有高度的结合力。

荧光素FITC 标记的Annexin V 可以作为探针检测暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸，指示坏死或凋亡的细胞。

FITC-Annexin V结合到细胞后，在蓝色光的激发下，发出绿色荧光。

碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一种核酸染料，它不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染，而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞则不会有红色荧光产生。

联合应用Annexin V-FITC和PI对培养体系中的细胞进行染色，Annexin V(-)/PI(-)代表健康活细胞，Annexin V(+)/PI(-)代表早期凋亡细胞，Annexin V(+)/PI(+)代表晚期凋亡细胞和坏死细胞，后两者之和即为受损细胞总量。

步骤：1．如上法构建杀伤体系靶细胞0.5ml、效细胞0.5ml，分别加入24孔培养板，置37℃、5％CO2培养箱中分别孵育3h、6h、12h；2. 把杀伤体系中的细胞培养液吸出至一合适离心管内（内含已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞）；3. PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化细胞，室温孵育至轻轻吹打可以使细胞吹打下来时，吸除胰酶，避免胰酶消化不够或消化过度；4. 加入收集的细胞培养液，轻轻吹打均匀，转移到离心管内，1000g 离心5min，弃上清，用1ml PBS轻轻重悬细胞并计数（细胞数量不少于1×105），然后1000g离心5min，收集细胞；5. 加入400μl 1×Binding Buffer 轻轻重悬细胞；6. 加入5μl AnnexinV-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15 min；7. 加入10μl PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5min；8. 在30min内进行流式细胞仪检测，AnnexinV-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。

Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。

以标记了FITC的Annexin Ⅴ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

将Annexin Ⅴ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。

产品组成（50／25次反应）：· Annexin V-FITC 500ul／250ul（20ug /ml）· Binding Buffer 40ml／20 ml· Propidium Iodide (PI) 250ul／125ul（50ug /ml）保存条件: 2-8℃储存，有效期一年。

注意事项：1.为保证得到理想的实验结果，在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项；2.试剂（尤其是小瓶装的试剂）在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落；3.Propidium iodide（PI）能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用；4.此试剂盒仅供科研使用，不宜用于临床诊断；5.本试剂盒中提供的PBS为随试剂赠送，并非试剂盒的真正组成成分；细胞的洗涤同常规方法。

操作注意要点：1.整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作；2.反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变；3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光；4.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的；5.在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果；6.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。

a n n e i n v和p i染色步骤及注意事项集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。

磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。

体内的吞噬细胞可通过识别磷脂酰丝氨酸来清除凋亡细胞。

Annexin-V（green）是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合，细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期坏死细胞可能为阴性），是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。

将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测的发生。

PI和Annexin-V双标：碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

*注意：时其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。

在分析结果时应该注意。

活细胞不能被Annexin V-FITC或PI染色（右图左下象限）。

早期凋亡细胞因磷脂酰丝氨酸的暴露及具有完整细胞膜，故呈Annexin V-FITC染色阳性及PI染色阴性（右图右下象限）。

坏死或晚期凋亡的细胞呈Annexin V-FITC及PI染色双阳性（右图右上象限）。

*注意：未处理的对照细胞进行常规培养的过程中也有一小部分的细胞死亡发生。

凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒一、原理在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V进行荧光素（FITC、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

与FITC 的绿色荧光信号相比，FITC的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点，故本试剂盒采用FITC作为荧光标记探针。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

二、试剂盒组份三、操作步骤1．用适当的方法诱导细胞凋亡，同时设立阴性对照组，并收集细胞；2．用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min）收集1~5×105细胞；3．吸取250μL的2×Binding Buffer和250μL灭菌去离子水（用户自备），混匀；4．用上述500μL的1×Binding Buffer悬浮细胞；5．加入1μL Annexin V-FITC混匀后加入5 μL Propidium Iodide，然后混匀；6．避光室温反应5min；根据不同的分析方法选择步骤A或B。

A．荧光显微镜观察1．滴一滴经过步骤1~6处理过的细胞悬浮液于载玻片，并用盖玻片盖上细胞；2．对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；（1）将细胞于盖玻片上生长，用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡，并设立阴性对照组；（2）用PBS洗涤细胞两次；（3）吸取250μL 的2×Binding Buffer和250μL灭菌去离子水（用户自备），混匀；（4）加入1μL Annexin V-FITC混匀后加入5 μL Propidium Iodide，然后混匀；（5）将（4）步骤的溶液滴加于盖玻片表面，使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖；（6）避光室温反应5 min。

流式细胞仪1，使用特定的方法诱导细胞凋亡，设置一个没有处理的control组2，在一定孵育期后收获细胞，用冰冷的PBS清洗3，准备1X的annexin结合液，例如，对于10个实验来说，加1ml 5X annexin 结合液（组分C）到4ml 去离子水中4，准备一个100ug/ml的PI工作液，例如，通过稀释5ul 1mg/ml的PI储存液（组分B）到45ul 1X annexin 结合液中。

没有使用的这部分工作液用于以后的实验。

5，再次离心2步骤中洗过的细胞，弃上清用1X annexin 结合液重悬。

调整细胞密度，用1X的annexin 结合液稀释到大约1x106/ml，为每个实验准备100ul 足够的体积。

6，加5ul Alexa Fluor 488 annexin V(组分A)和1ul 100ug/ml PI工作液（4步骤中准备的）到每100ul的细胞悬液中。

7，室温孵育细胞15min.显微镜观察1，使用特定的方法诱导细胞凋亡，设置一个没有处理的control组2，在一定孵育期后收获细胞，用冰冷的PBS清洗3，准备1X的annexin结合液，例如，配置1ml，加200ul 5X annexin 结合液（组分C）到800ul去离子水中4，准备一个100ug/ml的PI工作液，例如，通过稀释5ul 1mg/ml的PI储存液（组分B）到45ul 1X annexin 结合液中。

没有使用的这部分工作液用于以后的实验。

5，再次离心2步骤中洗过的细胞，弃上清用1X annexin 结合液重悬。

调整细胞密度，用1X的annexin 结合液稀释到大约1x106/ml，为每个实验准备足够的体积。

6，加5-25ul的annexin V缀合物（组分A）和1-2ul(100ug/ml)PI工作液到100ul 的细胞悬液中。

高浓度的annexinV缀合物会产生较好的结果；最佳染色浓度需要凭借经验7，室温孵育细胞15min8，1X annexin 结合液清洗细胞9，用一个合适方法使细胞固定在载玻片上，用一个适当的滤镜观察荧光效果。

一文掌握AnnexinV-FITCPI细胞凋亡实验方法一、技术原理细胞凋亡（apoptosis）是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制控制，按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。

细胞凋亡受凋亡相关基因调控，故又称为程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。

一般来说，凋亡早期，主要涉及胞内一些蛋白的变化，例如蛋白量的增高、位置的迁移、状态的改变等，还有一些磷脂、Ca2+的变化等；中晚期则伴随着DNA的断裂、凋亡小体的形成；而细胞形态的改变则伴随着整个凋亡过程。

二、产品应用目前可以采用单染色法和双染色法对细胞进行染色，流式细胞仪检测或荧光显微镜观察来检测细胞凋亡，其中Annexin V/PI法是当下较为流行的检测细胞凋亡的方法。

正常细胞中，磷脂酰丝氨（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡细胞中，PS会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。

用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生；碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。

因此将Annexin-V 与PI结合使用，就可以检测出细胞群体中的早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞。

Apoptosis-AnnexinV 检测示意图碘化丙啶PI检测示意图三、使用方法1悬浮细胞，2000rpm离心5min收集细胞;对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短(过长细胞膜破碎，造成假阳性，过短，细胞黏连影响检测)最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶消化液，加入细胞培养液终止消化，，2000rpm离心5min收集细胞；24℃预冷PBS，洗涤细胞2次（2000rpm x 5min）,收集细胞2～5×105 ；3离心弃上清，加入500μL结合缓冲液，轻轻吹打重悬细胞；4加入5μL Annexin V-FITC，轻轻吹打混匀，加入5μL PI 轻轻吹打混匀,室温避光孵育5-15min。

Annexin V-FITC / PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒货号: P-CA-201规格: 20Assays / 50Assays / 100Assays / 200Assays产品编号产品名称20Assays 50Assays 100Assays 200Assays Storage P-CA-101 Annexin V-FITC 染色液100 μL250 μL500 μL 1 mL 2~8℃. 避光P-CA-151 Annexin V Binding Buffer(10×) 1.4 mL×2 5.5 mL 11 mL 11 mL×2 2~8°C 碘化丙啶(PI)染色液P-CA-161 100 μL250 μL500 μL 1 mL 2~8℃, 避光说明书一份保存条件2~8℃可保存1年。

Annexin V-FITC禁止冷冻保存。

实验原理Annexin V-FITC/PI 荧光双染细胞凋亡检测试剂盒，可用于检测悬浮细胞和贴壁细胞的凋亡。

Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸(PS) 有高度亲和力。

当细胞发生凋亡时，膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS) 外翻到膜表面，而被荧光染料FITC标记的Annexin V结合，可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。

由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，而碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）可与双链DNA特异性结合并产生强烈的荧光，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。

本试剂盒检测喜树碱诱导的Jurkat细胞凋亡效果如下图所示：Jurkat细胞用 5 μM喜树碱（Camptothecin）(左) 或未加药(右) 处理4 h，本试剂盒染色后流式检测。

Annexin V-FITC单阳细胞为早期凋亡细胞，AnnexinV-FITC和PI双阳细胞为坏死或晚期凋亡细胞，PI单阳细胞为裸核细胞。

BD556547凋亡试剂盒使⽤⽅法⼀、概述在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发⽣凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这⼀变化早于细胞皱缩、染⾊质浓缩、DNA⽚断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。

AnnexinV是⼀种磷脂结合蛋⽩，与磷脂酰丝氨酸有⾼度亲和⼒，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之⼀。

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是⼀种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜⽽使细胞核染红。

因此将Annexin V与PI匹配使⽤，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

⼆、BD 556547 AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒的组份：556547a Annexin V Binding Buffer, 10X conc (51-66121E）556547b Annexin V-FITC (51-65874X)556547c Propidium Iodide Staining Solution(51-66211E)三、BD 556547 AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒的操作步骤：贴壁细胞需⽤0.25%的胰酶消化。

注意过度消化可损伤细胞。

在消化时可加2％的BSA可防⽌消化过度。

如果⽤含EDTA的胰酶消化时，注意必须清除EDTA：在标记前⽤1×PBS或1×bindingbuffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2＋螯合，影响Annexin V的结合。

（1）⽤去离⼦⽔将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer；（2）细胞收集。

悬浮细胞收集：离⼼5分钟；贴壁细胞：⽤不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合），于室温2000rpm离⼼5～10分钟，收集细胞）（3）细胞洗涤：⽤预冷1×PBS（4℃）重悬细胞⼀次，2000rpm离⼼5～10分钟，洗涤细胞；（4）加⼊300µL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞；（5）Annexin V-FITC标记：加⼊5µL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；（6）PI标记：上机前5分钟再加⼊5µL的PI染⾊。