非特异性染色的消除方法（免疫荧光和免疫组化）-丁香园

免疫组化染色过程降低染色背景的步骤1.引言免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于检测组织标本中目标蛋白的表达情况。

然而，在进行免疫组化染色时，常常会遇到染色背景过高的问题，这会影响结果的准确性和可靠性。

因此，降低染色背景是很重要的。

本文将介绍一些操作步骤，帮助您降低免疫组化染色的背景。

2.材料和方法2.1样本制备首先，收集您所需的组织标本，并进行固定和包埋等常规处理，以保持标本的完整性和结构。

确保样本处理过程中的所有试剂和材料都是高质量的，以减少可能的背景干扰。

2.2抗体选择选择高特异性和高亲和力的一抗和二抗，以确保染色结果的准确性和强度。

在选择抗体时，可以参考之前的文献报道或与专家进行咨询。

此外，购买商业化的优质抗体也是一个不错的选择。

2.3样本预处理在进行免疫组化染色前，可以对样本进行预处理，以减少非特异性背景信号。

预处理的方法包括热处理、酶解等。

具体的预处理方法应根据样本的特性和需要进行优化。

2.4去除内源过氧化物酶活性内源过氧化物酶（en d og en ou sp er ox ida s e）是造成染色背景的一个常见原因。

为了减少内源过氧化物酶的活性，可以使用过氧化氢和二甲基亚砜（D MS O）的混合液对样本进行预处理。

该预处理步骤通常在抗原修复之后进行。

2.5阻断非特异性结合位点在进行染色前，应对样本进行阻断处理，以减少非特异性结合位点的背景信号。

常用的阻断方法包括使用蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白）、小鼠免疫球蛋白等。

根据具体实验需求，选择适当的阻断剂，并在充分搅拌的条件下进行阻断。

2.6优化孵育时间和温度在进行一抗和二抗的孵育过程中，合理地优化孵育时间和温度可以减少染色背景并提高检测信号。

孵育时间一般在1至2小时之间，而温度则可以根据抗体的推荐条件进行设置。

2.7染色反应时间控制染色反应的时间控制也是降低染色背景的重要步骤之一。

根据染色试剂的说明书，控制染色反应的时间，避免染色剂过多或反应时间过长导致背景增加。

免疫荧光非特异性染色的消除方法免疫荧光非特异性染色是在进行免疫荧光染色实验时常常出现的一种问题。

它指的是在一些情况下，由于实验操作不当或试剂配制不当等原因，导致荧光信号出现在与目标分子无关的细胞或组织区域上。

这种非特异性染色会严重影响实验结果的准确性和可解释性。

因此，为了得到可靠和准确的免疫荧光染色结果，研究人员需要采取措施来消除免疫荧光非特异性染色。

以下是一些常用的消除免疫荧光非特异性染色的方法：1.优化抗体浓度和孵育时间：非特异性染色常常与抗体过多或过长的孵育时间有关。

因此，在进行免疫染色实验前，应该对抗体的浓度和孵育时间进行严格的优化。

一般来说，应该根据厂家提供的建议，进行初步的实验，然后根据实验结果调整抗体浓度和孵育时间。

2.阻断非特异性结合位点：有些细胞或组织可能存在一定程度的非特异性结合位点，导致非特异性染色。

在这种情况下，可以使用特异性抗体前处理样本，以阻断非特异性结合位点。

常用的前处理方法包括用1%牛血清白蛋白（BSA）或非特异性抗血清预处理样本等。

3.优化固定条件：样本处理过程中的不恰当固定条件也可能导致非特异性染色。

所以，在固定样本的时候，应该选择适当的固定剂和固定时间，并避免过度固定。

4.混合多种报告物质：对于存在非特异性染色的样本，可以尝试混合多种报告物质来进行染色，以提高特异性。

常用的报告物质包括荧光标记的二抗、荧光标记的标记物等。

5.设置适当的阴性对照：在进行免疫染色实验时，应该设置适当的阴性对照来排除非特异性染色的可能性。

阴性对照是使用与目标分子无关的抗体或未激光的样品，可以通过对比阴性对照和实验样品的染色结果来判断是否存在非特异性染色。

总之，在进行免疫荧光染色实验时，消除非特异性染色是至关重要的。

通过优化抗体浓度和孵育时间、阻断非特异性结合位点、优化固定条件、混合多种报告物质和设置适当的阴性对照等方法，可以有效地消除免疫荧光非特异性染色，从而获得准确、可靠的实验结果。

免疫组化常见问题及解决方法 生物谷网站当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。

对照/标本无染色①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。

③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。

比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。

④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。

⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。

⑥检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。

⑦检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。

需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。

⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。

⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。

弱阳性如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。

②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。

③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。

一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。

免疫组化非特异性染色太深怎么办？本人从事免疫组化实验做了好多年了，刚开始做这方面实验，出现了不少问题，最让人头疼的就是非特异性背景染色问题。

经过多年的摸索和亲身实验，摸索出问题的症结所在，针对免疫组化中存在最常见的非特异性背景染色问题，给予一些本人的见解和经验总结，希望对做科研的工作者们一些帮助和指导，也希望各位专业人士能给予批评指正。

当然这些经验总结和问题的，离不开丁香园、小木虫、中华病理网以及舜百公司专业病理人员的指导和帮助，是这些网站以及专业公司的帮助下，让我受益颇多。

免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的组织化学技术。

组织的非特异性染色的机理很复杂,所以控制非特异性背景染色也不容易,现简单介绍一下：一、非特异性染色的识别：常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。

表现为弥漫性，均匀性的背景染色。

也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。

二、非特异性染色的原因及避免方法：1. 静电吸附抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清封闭组织上的带电荷基团，从而除去与第一抗体的非特异性结合。

此法为最有效的方法。

如果还不可以的话可能蛋白质封闭不够或所用血清溶血。

2.内源性过氧化物酶红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。

石蜡切片3%双氧水-甲醇溶液处理切片；3. 洗涤不彻底保证各步骤的PBS或TBS冲洗的时间和量，方法要得当，最好可以把切片放在装满洗液的染色盒内浸泡一段时间以确保充分清洗。

有一些人鉴于实验经费紧张，那吸管滴加标本上冲洗，这样很难保证冲洗的干净与否。

这实际是千里之堤，溃于蚁穴。

4. DAB显色反应时间过长最好是在显微镜下时时观察一避免显色回见过长而引起的非特异性染色背景5.一抗稀释液，可以在一抗稀释液内适当添加1%BSA或合适浓度的二抗来源的血清。

免疫荧光非特异性染色的消除方法一、非特异性染色的主要因素组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。

（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。

（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。

（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。

（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。

（6）荧光素不纯，标本固定不当等。

二、消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：（一）动物脏器粉末吸收法常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。

每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。

吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。

染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。

肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。

如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。

用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。

一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。

在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。

因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。

另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。

离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。

标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。

虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。

因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。

二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。

如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。

由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。

因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。

三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。

如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。

免疫组化实验操作中减少DAB污染心得王萍;宋亮【期刊名称】《实用医技杂志》【年(卷),期】2007(014)017【摘要】免疫组化主要有三种:免疫荧光细胞化学技术,用荧光素标记抗体,在荧光显微镜下观察;免疫酶细胞化学技术,酶标记抗体加显色底物显色,在光学显微镜下观察;免疫金银及铁标记技术,用胶体金标记抗体,在光镜和电镜下观察。

由于免疫荧光细胞化学技术存在非特异性染色,结果判定的客观性不足,免疫金法操作中注意事项繁琐,所以基础研究以及临床试验一般选择免疫酶细胞化学技术。

显色是免疫酶组化技术中的关键步骤之一,显色剂一般选择DAB(3,3-二氨基联苯胺),因为DAB呈色反应产物为棕色,敏感度高,定位清晰,且可以经过梯度酒精脱水二甲苯透明,中性树胶封片,适于长期保存[1]。

但是DAB有致癌潜在可能,所以在实验室操作中应尽量减少DAB的污染。

本文简单介绍实验过程中常用的浓缩型DAB显色剂减少污染的方法。

1专用操作台以及实验用具免疫组化显色操作有固定的操作台并且尽量减少操作面积,操作前在工作台上铺好一次性台布,最好是白色塑料台布,这样不容易污染工作台并且易于观察染色过程中颜色的变化,利于及时中止反应。

用一次性EP管配备和混匀DAB,有固定的放置EP管的试管架以及放置移液器的架子。

用显微镜观察DAB显色结果时,滴加DAB较多或调节镜头时DAB...【总页数】1页(P2332)【作者】王萍;宋亮【作者单位】陕西中医学院,陕西,咸阳,712046;陕西中医学院,陕西,咸阳,712046【正文语种】中文【中图分类】R446.61【相关文献】1.节约化学药品、减少实验污染的做法 [J], 肖龙岗2.如何减少化学实验中的环境污染 [J], 胡立军3.改进化学实验减少化学污染 [J], 苏国光4.免疫组化操作中减少DAB污染的方法与体会 [J], 荣玮5.浅谈如何在有机化学实验教学中减少环境污染 [J], 韩亭亭;赵仑;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

免疫荧光非特异性染色的消除方法免疫荧光染色是一种常用的方法，用于检测和定量分析细胞或组织中的特定蛋白质或其他分子。

然而，在进行免疫荧光染色时，可能会出现非特异性染色的问题，即染色结果显示的信号不仅出现在目标结构上，还出现在其他非目标结构上。

这种非特异性染色不仅会影响结果的准确性和可靠性，还会增加解释数据的困难程度。

因此，消除非特异性染色是进行免疫荧光染色时非常重要的问题之一在免疫荧光染色中，非特异性染色通常是由于两个主要因素导致的：非特异性结合和背景信号。

首先，非特异性结合是指抗体在非目标结构上出现的结合。

这可能是由于抗体的高亲和力或低选择性所致。

为了减少非特异性结合，可以采取以下几种方法：1.直接比较不同供应商的抗体根据个人实验室的具体需求，尝试不同供应商的抗体，并选择亲和力高、选择性好的抗体进行实验。

2.优化抗体的工作浓度和孵育时间降低抗体的浓度，孵育时间，或者使用浓度较低的抗体，可以减少非特异性结合。

3.使用相应的阴性对照组在每一次实验中，保留一个只有二级抗体的阴性对照组，以用于排除非特异结合引起的信号。

其次，背景信号主要由于试剂和样品中存在的非特异性荧光引起。

以下是几个可以采取的方法来降低背景信号：1.优化荧光标记物的浓度和孵育时间使用合适的荧光标记物，并对其浓度和孵育时间进行优化。

一般来说，信号的增强可以通过增加荧光标记物的浓度和/或延长孵育时间来实现，但合理的优化要使背景信号降到最低。

2.使用荧光抑制剂荧光染料抑制剂可以用于减少背景信号。

选择合适的抑制剂，并按照厂家提供的建议浓度进行使用。

3.避免非特异性荧光基质尽量避免使用荧光基质，如组织石蜡切片。

选择非荧光或低自动荧光的材料。

此外，以下是一些通用的建议1.确保良好的样品固定和处理使用适当的固定方法和缓冲液对样品进行固定和处理，以确保目标结构能够保持其形态和结构。

2.优化孵育条件通过优化温度、湿度和孵育时间等孵育条件，可以帮助提高染色的特异性和信号/背景比。

细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。

4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。

2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。

3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。

蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。

4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。

5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。

PBS洗三次，每次5分钟。

6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。

PBS洗三次，每次5分钟。

7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。

PBS洗三次，每次5分钟。

8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。

9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。

10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。

12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。

稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。

淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。

苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。

盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。

我没用淡氨水溶液。

若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。