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操作时差对检测乙型肝炎核心抗体的影响【摘要】探讨乙型肝炎病毒血清免疫学标志物检测中，操作时差对结果的影响程度。
乙型肝炎病毒（hbv）核心抗体是人体受hbv 感染后血清中最早出现的标志性抗体［1］，它持续的时间长，几乎所有的个体在感染hbv后都能产生核心抗体。
乙型肝炎病毒（hbv）核心抗体是乙肝流行病学调查的良好指标。
因此对乙型肝炎核心抗体检测的准确性要求日益提高，要避免因为操作时差对检测的影响。
【关键词】酶联免疫吸附试验；操作时差；乙型肝炎病毒核心抗体检测乙型肝炎病毒核心抗体（抗-hbc）目前最常用的方法是酶联免疫一步竞争法，它的操作简便，我们以此为例作为探讨的对象。
通过不同加样时间和不同加样顺序的比较来解释操作时差对检测的影响。
1 材料和方法1.1 试剂乙型肝炎病毒核心抗体试剂盒，由（上海科华公司）提供。
1.2 试验方法1 先加入酶结合物，放置37℃不同的时间（0、5、10、15、20、30min）以后，再加入1：30稀释标本，按照说明书进行操作。
检测90份乙肝核心抗体阳性样本。
1.3 试验方法2 按试剂盒说明书加入1：30稀释标本50微升，分别静置在水浴37℃和室温（25℃）下0、5、10、15、20、30min，随后加入酶结合物，37℃水浴，按照说明进行操作［2］。
随机检测30份乙肝核心抗体和乙肝表面抗原都是阴性的样本。
2 结果表1 加样后放置不同时间对血清核心抗体酶免疫竞争法测定结果的影响［样本平均吸光度a（阳性例数）］样本情况份数实验条件加样后静置时间（min）0 5 10 15 20 30核心抗体阳性 90 37度水浴 0.187（90） 0.299（84） 0.386（75） 0.434（71） 0.661（66） 0.762（62）核心抗体阴性 30 37度水浴 1.930（0） 1.525（4） 1.343（8）0.937（11） 0.835（13） 0.682（14）30 25度室温 1.988（0） 1.632（1） 1.485（5） 1.093（5） 0.963（8） 0.842（10）从上表可以看到：①按照试验方法1进行操作，随着酶结合物加样时间的延长，样本的平均吸光度a明显上升，其预期的阳性样本的阳性例数明显下降。
ELISA法检测HBV血清标志物影响因素分析【摘要】目的：探讨在日常检验工作时，人工操作过程中存在哪些因素会对酶联免疫吸附实验（ELISA）检测乙肝病毒（HBV）血清标志物有影响。
方法：选取我院门诊、住院或体检人员血液样本中HBSAg为阳性的患者45例作为研究对象，并随机分为三组，分别从洗板次数、反应温度、以及延时比色时间等三个方面来综合分析其对结果的影响。
结果：随着洗板次数的增加，样本的吸光度值反而降低（P<0.05），且其组间差异有统计学意义；当反应温度在25℃时其样本的吸光度值则低于37℃时样本的吸光度（P<0.05），差异有统计学意义；随着延时比色时间的延长，样本的吸光度值也会随之下降（P<0.05），差异有统计学意义。
结论：人工操作过程中存在多种因素会对酶联免疫吸附实验检测HBV 血清标志物造成影响，严重者可影响样本的阴阳性判断。
为减少操作过程中的人为误差，各实验室应建立起自己的标准化操作程序并予以严格执行。
尽一切努力为患者出具安全放心的检验报告单。
【关键词】人工操作ELISA HBV血清标志物乙肝病毒（HBV）血清标志物包括HBSAg、HBSAb、HBEAg、HBEAb以及HBCAb，即表面抗原、表面抗体、E抗原、E抗体以及核心抗体。
酶联免疫吸附实验，即ELISA法，因其特异性强、灵敏度高、操作方便等优点被广泛运用于临床实验中[1]。
然而，在临床工作中却经常会出现患者临床表现和实验室结果相矛盾的地方，或者不同医院在相近的时间点上对同一个患者的检测结果出现误差，这些都是因为各种影响因素的存在，使得ELISA法检测结果的可靠性得不到保证。
因此，怎样避免这些影响因素，确保实验结果的准确性显得至关重要。
本研究针对酶联免疫吸附实验操作过程中易于出现的三种影响因素进行分析，观察其对样本的最终检测结果的影响，为各实验室建立起自己的标准化操作程序确保实验结果的准确性提供参考依据[2]。
乙肝病毒核心抗体诊断操作规程
一、操作步骤：
1、将试剂盒从冰箱中取出至室温中平衡30分钟后使用。
2、将标本对应微孔按顺序编号。
3、每孔加入待测标本50微升（待测标本用生理
盐水1：30稀释，检测结果为临床意义，请用户自行选择），设阴、阳性对照各两孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各1滴，并设空白对照1孔。
4、每孔加入酶结合物1滴，（空白对照孔除外）
充分混匀，封板，置37度孵育30分钟。
5、手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，
静置5秒，甩干，重复5次后拍干。
洗板机洗板：选择洗涤5次程序后拍干。
6、每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，
封板，置37度孵育15分钟。
6种不同加样量对酶联免疫吸附测定法检测乙型肝炎病毒核心抗体结果的影响柳洪艳【摘要】目的：分析及探索不同加样量对酶联免疫吸附测定法检测乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）结果的影响。
方法：收集2010年10月~2015年10月间我院接诊的经临床检查确诊的乙型肝炎患者的HBcAb阳性标本3000例作为研究对象，另选同期于我院进行健康体检的健康体检人群的HBcAb阴性标本（均经临床检查排除其它相关感染性疾病）3000例进行对照研究。
两组标本均分别采用A~G等5种不同的加样方式进行加样，其中A加样方式为遵循操作说明书按1：30的比例对待测血清进行稀释，B~G加样方式则分别给予10μL、20μL、30μL、40μL、50μL的血清加入，然后再通过酶联免疫吸附测定法对不同加样量标本进行HBcAb检测，并对检测结果进行观察和记录。
结果：本组收集的3000例HBcAb阳性标本中不同加样方式的检测结果均显示为阳性，均无假阴性。
而3000例HBcAb阴性标本中，A加样方式和B加样方式的阳性率对比（P＞0.05）。
而与A加样方式相比，C加样方式、D加样方式、E加样方式及F加样方式的检测阳性率均明显更高（P＜0.05）。
结论：临床采用酶联免疫吸附测定法对大量标本的HBcAb进行检测时，可选用10μL血清样本直接加入，从而有效提高检测效率。
【关键词】肝炎；乙型肝炎病毒核心抗体；加样量；酶联免疫吸附测定法；结果酶联免疫吸附测定法是现今临床上常用的乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）检测方法，但临床经验表明，其初检与复检的诊断符合率往往不够理想，据分析这不仅和使用的检测方法有关，加样量的区别也会对检测结果造成明显的影响[1~2]。
传统临床常用的加样量为按1：30的比例对待测血清进行稀释，这样不仅操作比较复杂，并且还易受到多方面人为因素的影响[3]，因此选取合理的加样量显得尤为重要。
为了分析不同加样量对酶联免疫吸附测定法检测结果的影响，本研究收集2010年10月~2015年10月间我院接诊的经临床检查确诊的乙型肝炎患者的HBcAb阳性标本3000例与健康体检人群的HBcAb阴性标本300例进行临床研究，分别给予不同的加样量进行检测，现总结报道如下：1 材料和方法1.1 材料收集2010年10月~2015年10月间我院接诊的经临床检查确诊的乙型肝炎患者的HBcAb阳性标本3000例作为研究对象，另选同期于我院进行健康体检的健康体检人群的HBcAb阴性标本（均经临床检查排除其它相关感染性疾病）3000例进行对照研究。
乙型肝炎病毒核心抗体IgM检测一、标本收集及处理：人血清或血桨类标本。
二、测定原理：用抗人ｕ链抗体包被酶标板，用以捕获待测血清中IgM类抗体，再加HBcAg 与特异性抗HBc-IgM结合，而后加HRP-抗HBc与HBcAg相结合，最后加底物显色。
三、试剂来源：上海荣盛生物药业有限公司四、试验器材：（一）、试验试剂：1．预包被反应条 1袋2．酶结合物 1瓶3．抗-HBcIgM阳性对照 1瓶4．抗-HBcIgM阴性对照 1瓶5．浓缩洗涤液 1瓶6．显色剂A（TMB） 1瓶7．显色剂B（TMB） 1瓶8．终止液 1瓶9． HBcAg 1瓶10．封口胶纸 2片11．说明书 1份12．自封袋 1只（二）、试验仪器：1．洗板仪：2．酶标仪：五、试剂制备：1、洗涤液使用前按要求用蒸馏水作1：20稀释。
2、其他试剂按说明可直接使用。
六、操作程序：1．加样：标本用生理盐水作1：1000稀释后，用移液器吸取100微升，加入反应板孔内，并设抗-HBcIgM阴性对照2孔，每孔100微升；抗-HBcIgM阳性对照2孔，每孔100微升；空白对照1孔；用封片封盖反应板。
置37℃孵育30分钟。
2．洗板：（1）手工法：弃去孔内液体，用洗涤液注满每孔，静置30秒，甩干，反复5次，扣干。
（2）洗板机洗板：选择洗涤5次的程序洗板，最后拍干。
3. 同时加HBcAg和酶结合物各50微升，空白对照孔不加，充分混匀后用封片封盖反应板，置37℃孵育30分钟。
4．重复2洗涤过程。
5．显色：每孔加显色剂A、B各50微升，混匀，置37℃孵育10分钟。
七、结果判断：1．终止反应：每孔加入终止液50微升，混匀。
2．测定：用酶标仪读数，可选择单波长450 nm（以空白孔校零）或双波长450/630 nm，读取各孔OD 值。
3．酶标仪读数法（波长450nm）：用空白孔校零点，然后读取各孔OD值。
样品OD值≥4.0 判断为阳性，否则为阴性。
阴性对照平均OD值备注：阴性对照OD值低于0.05，以0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。
不同的样本处理方法对乙型肝炎病毒DNA 检测的影响王惠民 谢晓谦 【摘要】 目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV )的聚合酶链反应(PCR )常规检测中血清样本的最佳处理方法。
方法 分别用不同缓冲液(PBS 与T E )对血清进行1:1或1:10稀释,不同浓度去污剂(Triton X -100与N P40)及巯基乙醇处理血清样本,以及用硫氰酸胍-酚-氯仿抽提、蛋白酶K 消化、碱裂解、辛酸钠裂解等方法处理血清样本,比较这些方法对PCR 法检测血清HBV DNA 敏感度的影响,并进行了辛酸钠最适浓度实验。
结果 在所比较的18种方法中发现硫氰酸胍-酚-氯抽提法、碱裂解法及辛酸钠法有较高的检测敏感度,而辛酸钠法有更好的重复性,方法最为简便。
结论 终浓度30～50mmol /L 辛酸钠最适用于PCR 法常规检测HBV DNA 的血清处理。
【主题词】 乙型肝炎病毒 聚合酶链反应 DNA ,病毒Ef fect of varied sample treatm ent procedures on detection of hepatitis B virus DNA Wang Huimin ,Xie X i -aoqian .Af filiated Ho spital of N antong Medical College ,Nantong City ,J iangsu Province 226001Abstract T he detective sensitivity vary obviously in the as say of HBV DNA by means of polymerase chain reaction w ith 18different s ampl e treatment procedures .Higher sensitivity was found in three methods ,namel y ,guanidine thiocyanate /phe -nol /chloroform ,NaoH denaturation and sodium octanoate .The procedure of phenol /chloroform w as too l abor -intensive to be accepted in routine clinical testing ,sodium octanoate w hich may suppress the inhibitory effect of denatured albumin on the polymerase chain reaction and thus the sensitivity was higherthan the method of NaOH denatu ration .Treatment of sampl es w ith 30～50mmol /L of sodium octanoate in final concentration for the detection of HBV DNA has show n to be very s ens i -tive ,simple and reproducible .Key words : Hepatitis B virus Polymerase chain reaction DNA ,viral作者单位:226001 江苏省南通医学院附属医院(王惠民);江苏省南通市第一人民医院(谢晓谦)1997年9月26日收稿 1998年4月22日修回 聚合酶链反应(PCR )检测血清中乙型肝炎病毒(HBV )DNA 时,由于使用不同的样本处理方法,检测敏感度可出现较大差异。
ELISA测定的常用模式--竞争法测抗体ELISA测定的常用模式--竞争法测抗体抗体的测定一般不使用竞争法。
当抗原中杂质难以去除或抗原的结合特异性不稳定时，可采用这种模式测定抗体。
如乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e 抗体(HBe·Ab)的测定，由于e抗原较核心抗原仅多29个氨基酸，e抗原很容易转变为核心抗原，因此，HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法。
但其测定具体模式有区别。
抗原的固相化既可以直接进行，亦可以通过相应特异抗体而间接固相化。
下面就HB cAb和HBeAb ELISA测定具体操作步骤分述如下。
1．HBcAb的竞争法测定(1)先将HBcAg在碳酸盐缓冲液中4~C过夜包被，形成固相抗原，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。
(2)同时加入待测样本和酶标的特异抗体，温育一定时间后洗板；此步中，待测样本的抗体将与酶标抗体竞争与固相上特异抗原结合。
(3)加入酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比(图2-8)2.HBeAb的竞争法测定(1)先将HBeAb在碳酸盐缓冲液中4℃过夜包被，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质；(2)同时加入待测样本和中和抗原HBeAg，温育一定时间后洗板；此步中，待测样本的抗体将与固相抗体竞争结合与中和抗原HBeAg，待测样本中HBeAb浓度越高，则与固相HBe—Ab结合的HBeAg越少，反之亦然；(3)加入酶标的特异抗体，温育一定时间后洗板；此步中，酶标抗体将与结合于固相抗体上的特异抗原结合；(4)加入酶底物，温育显色测定，显色的强弱与待测样本中的相应抗体的含量成反比(图2-9)HBeAb之所以要采用此种模式测定，主要是HBeAg的不稳定所致，如在固相直接包被HBeAg，则会因为HBeAg向HBcAg的易转变性，而导致测定误差。
不同稀释液对血清中HBsAg定量测定的影响胡伟;毕永春;宋景秋;戴蕾【期刊名称】《东南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2010(029)004【摘要】目的:探讨不同稀释液对血清中高浓度HBsAg测定结果的影响.方法:将11例HBsAg高值的乙肝患者血清分别用HBsAg专用稀释液、生理盐水、混合低值血清及蒸馏水稀释,然后用ARCHITECT i2000SR化学发光分析仪测定其HBsAg 值.结果:用生理盐水和蒸馏水稀释的血清标本测得的HBsAg值与用专用稀释液稀释后测得的HBsAg值比较存在统计学差异,而混合低值血清与专用稀释液所测值相比较差异无统计学意义.结论:除专用稀释液外,混合低值血清可以用于ARCHITECT i2000SR化学发光分析仪测定高浓度HBsAg的替代稀释液,而生理盐水和蒸馏水不能用作稀释液测定高值HBsAg.【总页数】3页(P464-466)【作者】胡伟;毕永春;宋景秋;戴蕾【作者单位】南京大学医学院附属南京鼓楼医院,检验科,江苏,南京,210028;南京大学医学院附属南京鼓楼医院,检验科,江苏,南京,210028;南京大学医学院附属南京鼓楼医院,检验科,江苏,南京,210028;南京大学医学院附属南京鼓楼医院,检验科,江苏,南京,210028【正文语种】中文【中图分类】R446.11【相关文献】1.不同稀释液对化学发光免疫法测定血清雌二醇浓度的影响 [J], 王洪珍;陈小芳2.HBsAg阳性血清HBV DNA与HBV标志物定量测定的相关性特征 [J], 成军;孙长贵;王国政;周乐光;孙关忠3.用液相芯片技术定量测定人血清CEA、AFP和HBsAg [J], 陈玮;李明;吴英松;李妙艳;何蕴韶4.稀释液中——添加不同浓度血清对精子活力的影响 [J], 沙开友;吴玉梅5.不同标本稀释液对直接化学发光法检测人血清FT4结果的影响 [J], 李娜; 黎锋; 薛声能; 唐菊英; 张小云; 吴宏适; 严励因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
不同稀释液对血清中HBsAg定量测定的影响作者：胡伟，毕永春，宋景秋，戴蕾【摘要】目的：探讨不同稀释液对血清中高浓度HBsAg测定结果的影响。
方法：将11例HBsAg高值的乙肝患者血清分别用HBsAg专用稀释液、生理盐水、混合低值血清及蒸馏水稀释，然后用ARCHITECT i2000SR化学发光分析仪测定其HBsAg值。
结果：用生理盐水和蒸馏水稀释的血清标本测得的HBsAg值与用专用稀释液稀释后测得的HBsAg值比较存在统计学差异，而混合低值血清与专用稀释液所测值相比较差异无统计学意义。
结论：除专用稀释液外，混合低值血清可以用于ARCHITECT i2000SR化学发光分析仪测定高浓度HBsAg的替代稀释液，而生理盐水和蒸馏水不能用作稀释液测定高值HBsAg。
【关键词】乙型肝炎表面抗原; 稀释液; 化学发光免疫法[Abstract] Objective： To explore the influence of the different diluents to hepatitis B surface antigen(HBsAg) in human serum. Methods: 11 hepatitis B patients serum with high concentration of HBsAg were selected, then diluted with specialized diluents, low serum, normal saline and distilled water respectively, the content of HBsAg were detected by Architect i2000SR immunoassay analyzer. Results: Serum specimen of HBsAg diluted with normal saline or distilled water had difference compared to specialized diluents group(P<0.05), while there was no significance in determination of HBsAgdiluted with low serum comparing with specialized diluents group(P>0.05). Conclusion: The low serum can be a substitute for specialized diluents to Architect i2000SR immunoassay analyzer while the normal saline and distilled water can not.[Key words] hepatitis B surface antigen; diluents; chemiluminescence immunoassay我国是乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus， HBV)感染的高发区，HBV感染的诊断主要依赖于患者血清中病毒标志物和病毒核酸(HBV DNA)的检出。
