以Pilidiumconcavum为例探讨真菌培养条件的优化

大白栓菌的人工培养条件优化作者：谭梦华段朝红桂裕成向江涛叶建武张亚雄汪銎植【摘要】目的探讨大白栓菌的人工大规模培养条件。

方法采用正交实验设计筛选大白栓菌的固体及液体培养条件。

结果固体培养基的最佳配方为栗木屑含量70 g，玉米粉含量35 g，石膏含量2 g，白糖含量1 g;大白栓菌液体培养的最佳条件是玉米粉4. 2 g/100 ml,栗木汁5. 0 g/100 ml,溶氧条件为静置培养。

结论大白栓菌可以采用人工大规模培养，为进一步开发利用创造了条件。

【关键词】大白栓菌人工培养配方Abstract:ObjectiveTo investigate the artificial rearing condition of Trametes lactinea (Berk.)Pat. MethodThe orthogonal design was used to select the conditions of solid and liquid culture. ResultThe best formula of the solid culture medium was ascertained to be castanea spp particle contents 70 g，corn flour contents 35，gypse contents 2 g, white sugar contents 1 g; the best formula of the liquid culture medium have been ascertained to be corn flour 4.2 g/lOOml ，castanea spp juice 5 g/lOOml, dissolve for oxygen condition static culture, not being put into rocking bed. ConclusionThe artificial rearing condition is applicable to the large-scale culture of Trametes lactinea (Berk.)Pat，which would provide some conditions for further development.Key words: Trametes lactinea (Berk. )Pat. ； Artificialrearing； Formula大白栓菌Trametes lactinea (Berk.)Pat.为多孔菌科真菌，担子果一年生，无柄，木栓质。

裂蹄木层孔菌液体深层培养工艺优化以菌丝体生物量和总糖含量为指标，对影响裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）深层培养的3个工艺条件（摇瓶的装液量、接种量、转速）进行优化。

结果表明，最优培养条件为装液量150 mL/250 mL、接种量20%、转速160 r/min，此条件下菌丝体生物量为1.10 g/100 mL，总糖含量为77.6 mg/g。

裂蹄木层孔菌；深层发酵；菌丝体生物量; 总糖含量裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）是隶属多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)、木层孔菌属(Phellinus)的一种药用真菌。

其子实体的热水浸出物有抗癌效能，对小白鼠肉瘤S-180的抑制率为96.7%[1]。

裂蹄木层孔菌在自然环境中形成的子实体稀少,人工栽培尚处于起步阶段，SONG等于1997年人工培植获得子实体[2]，李国俊等报道，从韩国引种的裂蹄针层孔菌经固体培养可获得大量菌丝体[1]。

液体发酵获得菌丝体具有培养周期短、产品质量稳定、便于工业化生产等优点，且菌丝体同样具有显著的药理活性，所以菌丝体代替子实体入药成为新的趋势。

发酵液pH是反映菌丝生长的重要指标，pH值可以作为判断发酵终点的参考依据[3]。

为更好开发利用裂蹄木层孔菌这一重要的药用菌资源，本试验以菌丝体生物量和菌丝体中总糖含量为评价指标，对其摇瓶培养工艺条件进行优化。

1 材料与方法1.1供试菌种裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）1号由四川绵阳食用菌研究所提供。

1.2培养基母种培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL, pH自然。

液体培养基：马铃薯20%，蔗糖5%，KH 2PO 4 0.1%，MgSO 4 0.1%，pH自然[3]。

1.3液体菌种制备将5块0.5 cm2活化斜面菌种接于250 mL三角瓶(装液体培养基100 mL)中，26 ℃静置24 h，然后置于26 ℃、130 r/min摇床上培养10 d。

深色有隔内生真菌培养条件的优化及铅吸附特性的研究本研究以分离自铅锌矿区优势植物沙打旺(Astragalus adsurgens)根部的沙门外瓶柄霉(Exophiala salmonis)、甘瓶霉(Phialophora mustea)、菊异茎点霉(Paraphoma chrysanthemicola)和枝状枝孢菌(Cladosporium cladosporioides)4种具有较强耐铅性的深色有隔内生真菌(Dark septate endophytes,DSE)为试验材料,对4种真菌的纯培养条件进行优化,研究4种真菌黑色素的合成情况和真菌非活性菌丝对铅的吸附能力,从中筛选出铅吸附能力最强的菌株并研究其吸附特性。

研究结果如下:4种真菌在固体培养时沙门外瓶柄霉、甘瓶霉和菊异茎点霉的最佳碳源均是葡萄糖,枝状枝孢菌的是乳糖;沙门外瓶柄霉、甘瓶霉和枝状枝孢菌的最佳氮源均是硝酸钠,菊异茎点霉的是胰蛋白胨;沙门外瓶柄霉最适宜生长的碳氮源组合是葡萄糖和硝酸钠或尿素,枝状枝孢菌的是葡萄糖和胰蛋白胨,甘瓶霉和菊异茎点霉的均是葡萄糖和蛋白胨。

4种真菌在液体培养时甘瓶霉、菊异茎点霉和枝状枝孢菌的最佳碳源均是可溶性淀粉,沙门外瓶柄霉的是葡萄糖;沙门外瓶柄霉、甘瓶霉、菊异茎点霉和枝状枝孢菌的最佳氮源分别是磷酸氢二铵、草酸铵、蛋白胨和硝酸铵;枝状枝孢菌和甘瓶霉最适生长的碳氮源组合均是可溶性淀粉和硝酸铵,沙门外瓶柄霉的是葡萄糖和硝酸钠,菊异茎点霉的是可溶性淀粉和胰蛋白胨。

固体和液体培养时,4种真菌的最适生长温度均为25℃,属于中温菌;沙门外瓶柄霉和菊异茎点霉的最适生长pH分别为5.0和7.0,甘瓶霉和枝状枝孢菌的均为6.0。

液体培养时,除甘瓶霉的最适培养转速为100 rpm外,剩余3种真菌的均为120 rpm。

液体培养时,添加三环唑能使沙门外瓶柄霉和枝状枝孢菌的培养液颜色变为红棕色,而对甘瓶霉和菊异茎点霉的培养液颜色几乎无影响;添加2-巯基苯并咪唑对4种真菌的培养液颜色几乎均无影响。

黑皮鸡枞液体菌种发酵罐培养条件的优化
黑皮鸡枞（Coprinus atramentarius）是一种珍贵的食草真菌，具有较高的药用和保
健价值。

液体菌种发酵罐培养是大规模生产黑皮鸡枞的一种重要方法。

本文将对黑皮鸡枞
液体菌种发酵罐培养条件进行优化。

培养基的选择是影响黑皮鸡枞液体菌种发酵的重要因素之一。

在液体培养基方面，常
用的有PDA、MYP培养基等。

根据黑皮鸡枞的生长状况和代谢特性，我们可以选择适合的培养基进行培养。

还可以根据需要添加适量的糖类、氮源、矿物质等营养物质，以促进黑皮
鸡枞的生长和代谢。

温度是影响黑皮鸡枞液体菌种发酵的另一个重要因素。

一般情况下，黑皮鸡枞的适宜
生长温度为25-30℃。

在液体菌种发酵罐中，可以控制罐内温度，保持在适宜的生长温度
范围内，以促进黑皮鸡枞的生长和代谢。

氧气供应也是黑皮鸡枞液体菌种发酵的关键因素之一。

黑皮鸡枞是一种厌氧菌，对氧
气较为敏感。

在液体菌种发酵罐中，需要进行适当的通气控制，以维持适宜的氧气供应量。

通常可以通过调节罐内的气体流量和通气速度来控制氧气供应。

黑皮鸡枞液体菌种发酵罐培养条件的优化包括选择适宜的培养基、控制温度和pH值、调节氧气供应以及控制培养时间等。

通过优化这些条件，可以提高黑皮鸡枞液体菌种发酵
的效率和产量，从而实现大规模生产。

黄壤溶磷青霉菌的筛选及培养条件优化乔志伟【摘要】为深入挖掘溶磷真菌在提高黄壤磷素有效性方面的作用,通过溶磷真菌筛选培养基(PVK)平板分离法从贵州安顺黄壤农田作物根际土壤中分离筛选出8株溶磷真菌.经过多次的分离纯化后,得到1株溶磷能力较强的真菌菌株G8,结合该菌株菌落形态特征和18 S rRNA基因序列分析,确定其为青霉菌(Penicillium sp.),进一步研究了G8的溶磷特性及最佳培养条件.结果表明:G8以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的条件下,在磷酸三钙培养液中有效磷含量最高,为534.24 mg/L.G8在磷酸铝培养液中有效磷含量在第6天达到最大,为589.74 mg/L;G8在磷酸铁培养液中有效磷含量在第5天达到最大,为201.38 mg/L.G8在磷酸铁和磷酸铝培养液中,有效磷含量与pH值呈显著的负相关(P<0.05).通过正交试验得到G8最佳培养条件为葡萄糖含量15 g/L、接种量1％(体积比)、培养液最初pH值6、硫酸铵含量0.067 g/L.培养条件优化后G8的溶磷能力明显增强.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2019(048)005【总页数】6页(P56-61)【关键词】黄壤;溶磷青霉菌;溶磷特性;正交试验【作者】乔志伟【作者单位】安顺学院资源环境与工程学院,贵州安顺561000【正文语种】中文【中图分类】S154.39磷是作物生长的重要元素之一[1]，由于土壤具有较强的吸磷和固磷特性，土壤中有效磷含量和磷的有效性都较低。

可溶性磷肥施入土壤后大部分被结合成难溶态磷酸盐，从而导致磷肥利用率不高，作物缺磷状况明显。

将土壤中难溶态磷酸盐转化成可被植物吸收的有效态磷是当前研究的热点。

溶磷微生物对土壤磷素有效化有积极的作用，溶磷微生物可以将土壤中的难溶态磷酸盐转化为有效磷，并分泌促生物质促进作物生长。

通过溶磷微生物的作用，可提高化学磷肥的利用率，增加土壤中有效磷含量，减少磷素累积，增加作物产量等[2-4]。

球孢白僵菌产孢培养条件优化研究
球孢白僵菌（Metarhizium anisopliae）是一种广泛应用于生物
防治的真菌。

其产孢量是影响其防治效果的关键因素之一。

因此，本文旨在探讨球孢白僵菌产孢培养条件的优化方法。

首先，我们选择了不同的培养基进行试验，包括马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、玉米粉琼脂培养基（CMA）、纤维素
琼脂培养基（CMC）和菜花粉琼脂培养基（CPA）。

结果表明，CPA培养基是球孢白僵菌最适宜的产孢培养基，其产孢
量最高。

其次，我们研究了不同的温度和pH值对球孢白僵菌产孢的影响。

结果表明，温度在25℃至28℃之间，pH值在6.0至7.0
之间时，球孢白僵菌的产孢量最高。

最后，我们研究了不同的培养时间对球孢白僵菌产孢的影响。

结果表明，球孢白僵菌的产孢量在培养时间为7天时达到峰值。

综上所述，球孢白僵菌的最佳产孢条件为使用菜花粉琼脂培养基，在温度为25℃至28℃、pH值为6.0至7.0、培养时间为7天时进行培养。

这对于球孢白僵菌的大规模生产和应用具有重要意义。

第42卷第3期2023年5月大连工业大学学报J o u r n a l o fD a l i a nP o l y t e c h n i cU n i v e r s i t yV o l .42N o .3M a y 2023收稿日期:2021-12-10.基金项目:辽宁省自然科学基金项目(20160247).作者简介:赵金(1996-),女,硕士研究生;通信作者:丛丽娜(1962-),女,教授.D O I :10.19670/j .c n k i .d l g yd x x b .2023.0304贝莱斯芽孢杆菌B A -300的鉴定、发酵条件优化及应用赵 金, 高子晴, 丛丽娜(大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034)摘要:为了获得在农业生物防治具有广谱抗菌作用的芽孢杆菌类益生菌,经多轮分离筛选,确定了一株对多种致病菌均具有较好抑菌效果的B A -300菌株㊂经16S r D N A 测序比对㊁形态特征观察和生理生化分析,鉴定菌株B A -300为贝莱斯芽孢杆菌(B a c i l l u s v e l e z e n s i s )㊂为提高抑菌活性,对菌株B A -300发酵条件进行优化㊂从6种常见的细菌培养基中筛选出最佳培养基,对时间㊁温度和p H 三种发酵条件进行优化㊂将稀释5倍和10倍的菌株B A -300发酵液分别喷洒到樱桃树上,结果表明,稀释5倍的发酵液实验组对樱桃树叶片细菌性穿孔病的防治效果可以达到78.4%,稀释10倍的实验组也能达到70.0%㊂与对照组相比,樱桃产量有明显提高,说明贝莱斯芽孢杆菌B A -300有较高的生物防治作用㊂关键词:贝莱斯芽孢杆菌;发酵条件优化;细菌性穿孔病;生物防治中图分类号:Q 936文献标志码:A文章编号:1674-1404(2023)03-0176-05I d e n t i f i c a t i o n ,o p t i m a l f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s a n da p pl i c a t i o n o f B a c i l l u s v e l e z e n s i s B A -300Z H A O J i n , G A O Z i q i n g, C O N G L i n a (S c h o o l o f B i o l o g i c a l E n g i n e e r i n g ,D a l i a nP o l y t e c h n i cU n i v e r s i t y,D a l i a n 116034,C h i n a )A b s t r a c t :T o o b t a i n p r o b i o t i c s w i t h b r o a d -s p e c t r u m a n t i b a c t e r i a le f f e c t si n a g r i c u l t u r a lb i o l o gi c a l c o n t r o l ,a B A -300s t r a i n w i t h g o o d a n t i b a c t e r i a le f f e c t sa g a i n s tv a r i o u s p a t h o ge n i c b a c t e r i a w a s i d e n t if i e d .A f t e r16Sr D N A s e q u e n c i ng c o m p a r i s o n ,m o r ph o l o gi c a lo b s e r v a t i o n ,p h y s i o l o gi c a la n d b i o c h e m i c a l a n a l y s i s ,t h e s t r a i nB A -300w a s i d e n t i f i e d a s B a c i l l u s v e l e z e n s i s .T o i m p r o v e a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y ,t h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f s t r a i nB A -300w e r eo p t i m i z e d .T h eo pt i m a l c u l t u r em e d i u m w a s s e l e c t e d f r o m6c o m m o nb a c t e r i a l c u l t u r e s a n d t h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f t i m e ,t e m pe r a t u r e a n d p H w e r e o pt i m i z e d .T h e f e r m e n t a t i o n b r o t h o f s t r a i nB A -300w a s d i l u t e d 5t i m e s a n d 10t i m e s a n d s p r a y e do n c h e r r y t r e e s ,r e s p e c t i v e l y .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e f e r m e n t a t i o nb r o t hh a dac o n t r o l e f f e c t o f 78.4%i n t h e g r o u p d i l u t e db y 5t i m e s o nb a c t e r i a l p e r f o r a t i o nd i s e a s e i n c h e r r yl e a v e s ,w h i l e t h e g r o u p d i l u t e db y 10t i m e s c o u l da c h i e v e70.0%.C o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l g r o u p,t h e y i e l do f c h e r r y i n t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d ,i n d i c a t i n gt h a t B a c i l l u s s u b t i l i s B A -300h a s a h i ghb i o c o n t r o l e f f e c t .K e y wo r d s :B a c i l l u s v e l e z e n s i s ;o p t i m i z a t i o n o f f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ;b a c t e r i a l p e r f o r a t i o n d i s e a s e ;b i o l o gi c a l c o n t r o l0引言近年来,随着人们对生物防治中有益微生物的拮抗作用抑制病害发生的深入研究,益生菌在农业病害防治以及食品和饲料生物防腐方面得到进一步发展和推广应用[1-3]㊂目前研究较多的是芽孢杆菌类益生菌㊂芽孢杆菌代谢能产生多种抑菌素,可以抑制多种致病菌的生长,加之其有营养要求低㊁抗逆性强和在植物表面易定殖等特点,成为微生物保鲜剂的首选菌㊂目前常见的有枯草芽孢杆菌㊁解淀粉芽孢杆菌㊁苏云金芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌等[4]㊂贝莱斯芽孢杆菌(B a c i l l u s v e l e z e n s i s)是一种新型生防细菌,它是2005年由西班牙学者R u i z-G a r cía等[5]在西班牙南部马赫拉加发现并命名的芽孢杆菌新种,2008年被确定为解淀粉芽孢杆菌的后期异型体[6-7]㊂贝莱斯芽孢杆菌代谢可以产生抗菌肽,能抑制多种致病菌的生长,具有无毒㊁自然环境污染小以及不易产生抗药性等优点[8-10]㊂贝莱斯芽孢杆菌还可用于防治葡萄灰霉病㊁番茄灰霉病㊁草莓白粉病和辣椒根腐病等多种植物病害[11-12]㊂但目前还没有关于防治樱桃树细菌性穿孔病的报道㊂张小利等[13]将贝莱斯芽孢杆菌应用到草莓白粉病的防治上,对草莓叶部白粉病防治效果达到86.64%,对草莓果实白粉病防治效果达到71.08%㊂李永丽等[14]将贝莱斯芽孢杆菌应用到苹果轮纹病的防治上,结果表明其可抑制苹果轮纹病菌的菌丝生长和孢子萌发,对6种供试植物病原菌的抑制率在55%~91%㊂本研究是从土壤中筛选㊁鉴定得到一株贝莱斯芽孢杆菌,本实验以培养基种类㊁温度㊁p H和时间因素为基础,对其发酵培养基及条件进行优化㊂将该菌株的发酵液应用到樱桃树细菌性穿孔病的防治上,以期发掘出具有较高抑菌效果的生防菌株㊂1材料与方法1.1材料1.1.1菌株实验菌株:贝莱斯芽孢杆菌B A-300㊂指示菌株:副溶血性弧菌(V i b r i o p a r a h a e-m o l y t i c u s)㊁大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o l i)㊁金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)㊁单增李斯特菌(L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s)㊁铜绿假单胞菌(P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a),中国普通微生物菌种保藏管理中心㊂1.1.2培养基种子培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母浸粉5,N a C l10,p H7.0~7.2㊂6种常见的细菌培养基(g/L):N B培养基:蛋白胨10,牛肉膏3,葡萄糖10,酵母浸粉1,p H7.0;L B培养基:酵母浸粉5,胰蛋白胨10,N a C l10,p H7.0;B P培养基:牛肉膏5,蛋白胨10,N a C l5,p H7.0;S O B培养基:蛋白胨20,酵母浸粉5,N a C l0.5,K C l0.18,M g C l2㊃H2O0.95,p H7.0;B P Y培养基:牛肉膏5,蛋白胨10,酵母浸粉5,葡萄糖5,p H7.0;Y T培养基:蛋白胨10,酵母浸粉5,葡萄糖1,N a C l5,p H 7.0㊂均于121ħ灭菌20m i n㊂1.2方法1.2.1菌株的分离筛选取果园土样和海参养殖圈底泥,加适量生理盐水,80ħ恒温水浴10m i n㊂液体培养48h,稀释涂布于L B固体培养基平板㊂长出单菌落进行平板划线分离纯化,得到的多个单菌落利用副溶血性弧菌进行抑菌实验的初筛㊂利用大肠杆菌㊁单增李斯特菌和铜绿假单胞菌等食品及水产致病菌对初筛得到的菌株进行抑菌实验的复筛㊂1.2.2菌株B A-300的形态、生理生化特征鉴定对筛选获得的抑菌效果最好的菌株B A-300进行染色形态学特征鉴定㊂利用糖类发酵㊁淀粉水解㊁甲基红㊁运动性和过氧化氢酶等实验进行生理生化特征鉴定,测定结果参照‘常见细菌系统鉴定手册“[15]㊂1.2.3菌株B A-300的分子鉴定提取菌株B A-300的基因组D N A,利用16S r D N A细菌通用引物进行P C R扩增[16-17],上游引物27F:5'-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3';下游引物1492R:5'-T A C G G C T A C C T T G T T A C G A C T T-3'㊂将扩增产物进行测序㊂对测序得到的核酸序列与数据库中的序列进行B L A S T同源性比较分析,再从G e n B a n k数据库中调出同源性高的相关菌株的基因序列,利用M E G A-X软件进行序列多重比对后,采用N e i g h b o r-J o i n i n g法构建系统进化树,确定菌株B A-300的分类地位㊂1.2.4发酵培养基的筛选将保藏在-80ħ的贝莱斯芽孢杆菌B A-300按2%的接种量接入种子培养基,30ħ㊁180r/m i n 培养18h㊂再按5%的接种量分别接种于6种发酵培养基,30ħ㊁180r/m i n培养48h,每个处理设3组重复㊂发酵液10000r/m i n离心10m i n,771第3期赵金等:贝莱斯芽孢杆菌B A-300的鉴定㊁发酵条件优化及应用以副溶血性弧菌为指示菌,牛津杯法进行抑菌实验,比较抑菌圈直径大小,确定最佳发酵培养基㊂1.2.5发酵条件的优化将菌株B A-300种子液按5%接种量接种到优化后的发酵培养基,发酵24~56h,每4h取样并离心;以副溶血性弧菌为指示菌,发酵上清液利用牛津杯法进行抑菌实验,做3个平行,比较抑菌圈直径大小,确定最优的发酵时间㊂为确定发酵的最佳温度,将温度分别设置为28㊁30和32ħ,以同样方法比较抑菌效果,每个处理设3次重复实验㊂为确定发酵的最佳p H,用H C l或N a O H溶液调节培养基初始p H分别为5.0㊁6.0㊁7.0㊁8.0和9.0,以同样方法比较抑菌效果,确定p H的大致范围㊂在适宜的p H范围以0.2为梯度,对p H 进行精细调节,每个处理设3次重复实验㊂1.2.6发酵液对樱桃树的细菌性穿孔病的防治从辽宁省大连市普兰店区樱桃园中选择树形㊁大小㊁往年的结果量和阳光照射时间差不多的9棵树,分为3组,每组3棵树;利用电动喷雾器分别喷洒稀释5倍㊁10倍的菌株B A-300发酵液和清水,菌剂的喷洒要均匀一致,使樱桃树各部分都能喷到,每10d喷洒一次,共喷3次㊂实验完毕后,将樱桃树按上㊁中㊁下随机各调查100片树叶,每次喷菌剂前记录叶片的发病数和等级,计算病情指数和防治效果㊂在樱桃树果实成熟后,计算各实验组和对照组的产量㊂叶片病情分级标准见表1㊂表1叶片病情分级标准病情指数=ð(各级病叶片数ˑ相对级数)调查总叶片数ˑ最高病级数防治效果=1-对照区施药前病情指数ˑ处理区施药后病情指数对照区施药后病情指数ˑ处理区施药前病情指数2结果与讨论2.1菌株的分离筛选为了获得在农业生物防治㊁食品和饲料生物防腐方面具有广谱抗菌作用的芽孢杆菌类益生菌,将采集到的样品与生理盐水充分混匀后,首先置于80ħ恒温水浴10m i n,再进行培养㊂结果观察到固体平板上长出多个单菌落㊂对其利用牛津杯法进行抑菌实验的初筛和复筛,最终获得一株对5种致病菌均有较好抑菌效果的菌株,命名为B A-300㊂2.2菌株B A-300的形态、生理生化和分子鉴定菌株B A-300培养初期菌落表面光滑,后期表面有褶皱㊂该菌在电子显微镜下呈杆状㊁有芽孢产生㊂生理生化实验结果见表2,根据形态特征和生理生化特性,可以初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属㊂表2菌株B A-300的生理生化特征T a b.2 P h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i ca l c h a r a c t e r i s t i c s注:提取菌株B A-300的基因组D N A,经P C R扩增,测序得到16S r D N A序列,该菌株基因序列片段长度为1473b p㊂将序列进行B L A S T分析,结果显示,菌株B A-300与贝莱斯芽孢杆菌的相似性为99.93%㊂根据序列比对结果构建系统发育树,如图1所示㊂从图1可以看出,B A-300的序列与B.v e l e z e n s i s序列位于系统发育树同一分支,同源性比对数据和系统发育树位置表明菌株B A-300为贝莱斯芽孢杆菌㊂2.3发酵培养基的筛选发酵培养基筛选结果见表3㊂菌株B A-300在6种不同培养基中发酵培养,上清液的抑菌效果明显不同;其中在N B培养基中,抑菌效果可以达到14.1m m,优于其他培养基㊂因此,确定N B 培养基为最优的发酵培养基㊂2.4发酵条件的优化发酵条件的优化结果见表4㊂随发酵时间的延长,菌株B A-300的抑菌效果增大;在48h时抑菌圈直径达到最大,为14.2m m,之后开始下降㊂因此,确定发酵时间为48h㊂发酵温度在28~32ħ时,菌株B A-300的抑871大连工业大学学报第42卷图1 菌株B A -300系统发育树F i g .1 P h y l o ge n e t i c t r e e of s t r a i nB A -300表3 不同发酵培养基对菌株B A -300抑菌效果的影响T a b .3 E f f e c t s o f d i f f e r e n t f e r m e n t a t i o nm e d i a o n t h e表4 发酵条件对菌株B A -300抑菌效果的影响T a b .4 E f f e c t s o f f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s o n t h eb ac t e r i o s t a s i s o fB A -300s t r a i n反应条件d /m m t /h2411.5ʃ0.42811.6ʃ0.33212.3ʃ0.23612.9ʃ0.24013.2ʃ0.54413.7ʃ0.14814.2ʃ0.35213.4ʃ0.15612.6ʃ0.2θ/ħpH 2813.6ʃ0.33014.1ʃ0.23212.7ʃ0.26.613.7ʃ0.26.814.5ʃ0.17.014.1ʃ0.27.213.0ʃ0.27.412.8ʃ0.17.612.7ʃ0.3菌效果先增大后减小,在30ħ达到最大,抑菌圈直径为14.1m m ㊂因此,确定发酵温度为30ħ㊂发酵p H 在6.6~7.6时,菌株B A -300的抑菌效果先增大后减小,在p H6.8时达到最大,抑菌圈直径为14.5m m ㊂因此,确定发酵p H 为6.8㊂2.5 发酵液对樱桃树的细菌性穿孔病的防治由表5可知,第一次喷洒处理后,贝莱斯芽孢杆菌B A -300发酵液稀释5倍和10倍实验组的病情指数较对照组有明显下降,防治效果在70.0%左右㊂在3次处理后,发酵液稀释5倍实验组的防治效果最好,可以达到78.4%,稀释10倍实验组的防治效果也可以达到70.0%㊂樱桃成熟后,对所有实验的9棵樱桃树产量进行计算㊂结果发现,稀释5倍发酵液实验组的每棵树平均产量为34.0k g ,稀释10倍发酵液实验组的每棵树平均产量为31.2k g ,清水对照组的平均产量为28.5k g㊂综上所述,喷洒贝莱斯芽孢杆菌B A -300稀释5倍发酵液的生防效果最好,较对照组而言,明显提高了樱桃的产量,而且口感优于对照组㊂这说明贝莱斯芽孢杆菌具有较好的生防作用,可以促进植物生长,提高产量,改善果实口感,且不会造成环境污染,有望代替化学农药进行植物的病虫害防治工作㊂3 结 论经分离筛选获得一株抑菌效果最优的菌株B A -300㊂对该菌株进行形态特征㊁生理生化试验和分子鉴定,确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌B a c i l l u s v e l e z e n s i s ㊂对其进行发酵培养基和发酵条件优化,确定N B 培养基为最佳培养基,最佳发酵条件为发酵时间48h ㊁发酵p H6.8㊁发酵温971第3期赵金等:贝莱斯芽孢杆菌B A -300的鉴定㊁发酵条件优化及应用表5菌株B A-300对樱桃树叶片细菌性穿孔病的防治效果T a b.5 C o n t r o l e f f e c t o fB A-300o nb a c t e r i a l p e r f o r a t i o no f c h e r r y l e a v e s%处理组对照稀释5倍发酵液稀释10倍发酵液病情指数防治效果病情指数防治效果处理前25.233.730.3第1次处理7d后68.523.374.626.668.2第2次处理7d后73.322.277.424.272.5第3次处理7d后74.821.678.424.073.3度28ħ㊂将贝莱斯芽孢杆菌应用到樱桃树的细菌性穿孔病的防治上,发酵液稀释5倍实验组的防治效果最好,可以达到78.4%㊂参考文献:[1]凌丽晨.贝莱斯芽孢杆菌S3-1对樱桃番茄采后果腐病的防治及果实保鲜的研究[D].上海:上海师范大学,2021.[2]张艳,李秋芬,王印庚,等.益生菌的研究现状及其在海水养殖中的应用[J].海洋水产研究,2005,26(6): 83-87.[3]杜淑涛,李术娜,朱宝成.白菜黑斑病拮抗细菌B a c i l-l u sv e l e z e n s i s D L-59的筛选鉴定及田间防效实验[J].河北农业大学学报,2010,33(6):51-56. 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