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实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。
2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。
【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。
常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。
原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。
本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。
（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。
（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。
因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。
原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。
而在真核基因上则缺乏该序列。
因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。
原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。
因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。
原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。
如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。
外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。
包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。
但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。
（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。
根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。
大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用生命科学研究中，基因互作是一个重要的研究领域，对了解基因的功能，及其在生物学中的重要性具有关键性意义。
近年来，越来越多的研究者运用酵母双杂交系统来研究基因互作。
其中，大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用越来越广泛。
1. 大肠杆菌酵母双杂交系统简介酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）最早是由Fields与Song在1989年提出的，它是一种通过互补形成基因蛋白质互作物的方法。
大肠杆菌酵母双杂交系统（E. coli yeast two-hybrid system）是在酵母双杂交系统的基础上发展而来的。
它是通过将酵母双杂交系统中的酵母菌GAL4基因融合到大肠杆菌中的一种表达载体，并在其上构建相应的表达基因来实现的。
通过这种方法，大肠杆菌系能够鉴定出与目标蛋白质相互作用的蛋白质，并通过一些方法进行确认和鉴定。
2. 大肠杆菌酵母双杂交系统的优点（1）鉴定简单：大肠杆菌酵母双杂交系统只需要一些特定的基因表达载体，而不需要其他繁琐的操作，使其鉴定基因互作关系的过程变得更加简单。
（2）兼容成熟技术：大肠杆菌酵母双杂交系统是在酵母双杂交系统技术的基础上发展起来的，因此，其技术兼容性是酵母双杂交系统的一个很好的特点。
大肠杆菌酵母双杂交系统可以通过一定的改变来应对不同的研究需求。
（3）识别特异性高：大肠杆菌酵母双杂交系统的识别特异性非常高，能够鉴定出相互作用蛋白的特异性差异。
3. 大肠杆菌酵母双杂交系统的应用大肠杆菌酵母双杂交系统的主要应用是用于了解蛋白质之间的定向互作关系。
例如，研究一个特定的基因是如何参与一个生物功能的，就需要找到与之相关的其他基因，以了解它们之间是否发生了相互作用。
在研究基因调控的过程中也能使用它进行分析。
此外，大肠杆菌酵母双杂交系统还能运用于感染病毒的分析。
例如：通过大肠杆菌酵母双杂交系统的研究，有学者发现存在于整个病毒基因组中、并参与了其复制的两个产生蛋白质。
如何选择合适的基因载体在进行基因工程研究或生物学实验时，选择合适的基因载体是至关重要的。
基因载体是指将外源DNA片段插入到其中的DNA分子，常用于基因克隆、表达和转染等实验操作中。
在选择合适的基因载体时，需要考虑多个因素，包括：适合的宿主细胞、载体大小、DNA复制能力、表达能力和基因编辑能力。
本文将详细介绍如何选择合适的基因载体。
首先，选择适合的宿主细胞是非常重要的。
宿主细胞的选择应根据研究目的和所需结果而定。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌（E.coli）、酵母菌和哺乳动物细胞等。
大肠杆菌是最常用的宿主微生物，具有丰富的遗传工具和高效的表达系统；酵母菌常用于蛋白质大量表达和克隆研究；而哺乳动物细胞常应用于真核生物表达以及重组蛋白质的产生。
因此，在选择基因载体时，应综合考虑所需研究对象的特点和所需结果，选择适合的宿主细胞。
其次，基因载体的大小是选择的另一个重要考虑因素。
基因载体的大小直接关系到可克隆的DNA片段的大小限制。
一般而言，细菌宿主对于较小的载体更为适应，并且很多商业上常用的载体都是较小的质粒，例如pUC系列质粒。
大肠杆菌细胞在摇瓶或发酵罐中处理小型质粒时更为高效，因此选择适当大小的基因载体有助于增加转化效率和表达效果。
另外，载体过大容易导致构建和分离的困难，而过小的载体则可能限制了载体的功能。
此外，选择合适的基因载体还需考虑其复制能力。
一般情况下，选择能够在目标宿主细胞中高效复制的基因载体是非常重要的。
选择拥有高拷贝数的基因载体（如pUC18和pUC19）可以提高目标基因的拷贝数，从而增加目标基因的表达量。
此外，一些特定的载体可能具有选择性复制性，如2μm质粒在酵母中复制，选择这样的特定载体可以在遗传上稳定地保持插入DNA。
除了复制能力，基因载体的表达能力也是选择的重要因素之一。
一些载体在宿主细胞中具有强大的表达能力，可以帮助目标基因高效表达。
常见的表达载体常包含启动子、转录/翻译起始子、选择性标记和可视化标签等。
蛋白质的高效表达和纯化技术蛋白质是细胞中最为基本的分子，不仅构成细胞的基本结构，也参与到细胞的代谢、信号转导等生命活动中。
因此，蛋白质的高效表达和纯化技术是生命科学研究的重要基础。
蛋白质的表达技术主要包括原核和真核表达系统。
原核表达系统包括大肠杆菌和酵母表达系统，这两种表达系统都具有高效的蛋白质表达能力，并且易于操作和大规模生产。
在酵母表达系统中，通常会将目的蛋白质基因插入到酵母表达载体中，然后通过转化酵母细胞实现表达。
大肠杆菌表达系统则是将目的蛋白质基因插入到大肠杆菌表达载体中，然后通过转化大肠杆菌细胞进行表达。
相比于酵母表达系统，大肠杆菌表达系统具有更高的表达速率，但表达的蛋白质常常是未折叠的形态，需要进一步的纯化和折叠过程。
真核表达系统则利用真核细胞本身的细胞器完成蛋白质的表达和折叠，这类表达系统可以用于表达大多数复杂的蛋白质。
例如，哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞和HEK293细胞）是利用哺乳动物细胞自身的蛋白合成机制进行表达的，这种表达系统通常会得到高质量的蛋白质，但生产成本相对较高。
对于高效的蛋白质表达来说，关键是基因的优化和载体的选择。
在基因的优化方面，通常会进行基因的序列优化、信号肽的选取、启动子的选择等操作，以提高蛋白质的表达量和纯度。
而载体的选择则需要根据具体的表达需求进行选择，例如对于大肠杆菌表达系统来说，常用的载体有pET系列载体和pBAD系列载体；对于酵母表达系统来说，常用的载体有pYES2和pGAPZ系列载体；对于哺乳动物细胞表达系统来说，常用的载体有pCDNA3.1和pEF系列载体。
在蛋白质的纯化方面，常用的方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤等。
离子交换层析是利用离子交换树脂对带有带电的蛋白质进行分离，在这个过程中，可以通过改变洗脱缓冲液的pH或离子浓度来调节分离效果。
亲和层析则是通过利用蛋白质与其特异性配体之间的亲和性实现分离，例如亲和层析树脂中的金属离子会与带有多个组氨酸残基的蛋白质结合形成配位键，从而实现分离。
微生物酶和基因的高效筛选和表达在当今社会中，人们对于生物科技的需求越来越高，其中微生物酶和基因的研究就是其中一个重要的方向。
而微生物酶和基因的高效筛选和表达则是该领域研究的核心内容之一。
如何高效筛选和表达微生物酶和基因？本文将从两个方面，即微生物酶和基因的筛选和表达，来展开讨论。
一、微生物酶的筛选和表达微生物酶作为一种非常重要的酶类，广泛应用于制药、化工、轻工以及食品等行业，其高效筛选和表达显得尤为重要。
微生物酶的筛选一般是通过挑选并筛选出细菌和真菌等微生物中具有产酶能力的菌株，并对其进行酶学测定以确定所产的酶质量和酶性质。
而微生物酶的表达则是指将所筛选出来的酶基因在特定的表达载体中进行表达转化，使其能够在大规模生产过程中得到高效稳定的表达。
目前常用的表达载体有大肠杆菌表达系统和酿酒酵母表达系统。
其中大肠杆菌表达系统表达效果非常好，而且表达产物一般不存在部分异质性的问题，是目前最为常用的表达系统之一。
二、基因的筛选和表达基因的筛选和表达也是微生物酶和基因领域中的重要研究方向。
基因筛选的主要方法是基于PCR、RNA、DNA克隆等技术，通过大量的基因片段的构建和筛选，来扩展已经知道的基因库，从而挖掘出更丰富的基因类型和功能。
而基因的表达则是指将所筛选出的基因在合适的载体中进行表达，以期望能够在生产过程中得到高效、易于分离和纯化的表达产物。
基因的表达一般可以使用重组DNA技术，将所选取的基因片段插入到特定的载体中表达，具有较高的表达效果和纯度等特点。
在微生物酶和基因的高效筛选和表达过程中，技术和方法的不断创新和进步，为该领域的研究提供了强大的支持。
同时，该领域的研究也对于实现工业生产中高效、安全、环保、节能等方面提供了新的思路和方法。
未来随着微生物酶和基因的研究越来越深入，其应用领域也将越来越广泛，为推动我国相关产业的发展和完善起到积极作用。
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。
基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
第一节基因的表达系统与表达策略一、最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。
二、宿主细胞的选择（一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。
（二）宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。
②有各类菌株和载体系列。
③目前以实现多种基因的高效表达。
表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。
④易培养，成本低。
缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。
②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
③蛋白质不能糖基化。
产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。
④其内毒素很难除去。
酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。
其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。
能外分泌，产物可糖基化。
已有不少真核基因成功表达。
三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1.生物化学和分子生物学研究2.表达蛋白质用作抗原3.结构研究真核基因表达的特点●一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；●基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；●mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；●基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。
原核体系中表达真核基因的困难1.细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；2.真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上；3.真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；4.表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。
四、构建表达载体的策略⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。
⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。
⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。
第二节基因在大肠杆菌中的高效表达一、大肠杆菌表达载体的成份⑴启动子要求是：①强启动子②是诱导性的，如热诱导和化学诱导。
⑵转录终止子使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。
尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。
⑶核糖体结合位点在转录起始位点下游的一段DNA序列（SD，5’AGGAGG3’）(4)筛选标记基因(5)密码子的选择二、常见的大肠杆菌表达系统①T7表达系统T7噬菌RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。
②Lac表达系统是β-半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG 诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。
③Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。
④λPL表达系统是负责λDNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。
三、影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录起始序列、密码子的选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。
1.启动子的结构对表达效率的影响大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即-10区(位于转录其始位点上游5-10bp，故称为-10区，序列为5’--TATAAT)和-35区(位于转录起始位点上游25bp处，一般有10bp组成，5’-- TTGACA故称为-35区，)。
当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。
另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于17bp，启动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUG和其上游的SD序列。
所谓SD序列就是由Shine-Dalgarno 首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。
一般SD序列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S 核糖体RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。
3.启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这一因素的影响。
另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。
四、蛋白质的融合表达融合表达一般是将基因引入某表达载体编码的高表达蛋白（担体蛋白）序列的3’末端。
表达出来的融合蛋白的N末端含有由担体序列编码的片段。
融合蛋白可以直接用作抗体，但通常是将N端的担体蛋白部分从C端的目的蛋白中裂解出来，有利于对目的蛋白进行生化研究及功能分析。
方法主要有：化学裂解法和酶解法。
五、蛋白质的分泌型表达将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现分泌表达。
●实现蛋白质分泌表达有许多有利之处：1.在穿膜过程中信号肽被信号肽酶切除。
生产的蛋白质和天然蛋白质是一致的。
2.周质中蛋白酶活性低，分泌的蛋白稳定。
3.周质中细菌的蛋白很少，使得重组蛋白易纯化。
4.周质中提供了一个氧化环境，更有利于二硫键的正确形成。
因此，对于许多难以纯化的蛋白质可以通过分泌表达来实现生产。
六、蛋白质的包含体形式表达●重组蛋白在大肠杆菌中高表达时，绝大多数是以包含体形式存在的。
●包含体就是表达的蛋白质在细胞内聚集成没有生物活性的固体颗粒。
●不可溶、无生物活性的包含体必需经过变性、复性才能获得天然结构及生物活性。
●重组蛋白在大肠杆菌中高表达时，绝大多数是以包含体形式存在的。
●包含体就是表达的蛋白质在细胞内聚集成没有生物活性的固体颗粒。
●不可溶、无生物活性的包含体必需经过变性、复性才能获得天然结构及生物活性。
减少包含体形成的策略：1.降低重组菌的生长温度。
2.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。
如高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖。
3.供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH值等。
不过，包含体的形成有时也是有利的，不仅可以获得高表达、高纯度的蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白的破坏。
有效、理想的复性方法应具备一下几个特点：1.活性蛋白质的回收率高。
2.正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离。
3.折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。
4.折叠复性方法利用放大。
5.复性过程耗时较少。
第三节基因在酵母中的表达一、大肠杆菌表达系统的缺陷1.缺失真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等。
2.表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复杂的复性才能恢复构象和生物活性。
因此，可以使用真核生物酵母作为表达菌。
如酿酒酵母、甲醇酵母等。
二、甲醇酵母表达系统●甲醇酵母能利用甲醇为其唯一碳源。
●甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下氧化成甲醛，乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱，因此甲醇酵母代偿性的大量产生这种酶。
●调控乙醇氧化酶的启动子是强启动子，可用来调控异源蛋白的表达。
（一）甲醇酵母表达系统的优点1.具有强启动子，可严格调控目的蛋白的表达。
2.可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性。
3.营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产。
4.可高密度发酵培养。
（二）影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素1.目的基因的特性2.表达框的染色体整合位点与基因拷贝数3.宿主的甲醇利用表型4.分泌信号5.产物稳定性6.翻译后修饰。
