外源基因在酵母体系中表达

酵母表达引言酵母是一类单细胞真核生物，被广泛应用于生物学研究中。

酵母表达系统是指利用酵母细胞表达外源基因的技术，被广泛应用于蛋白质的高效表达和产量大规模生产。

本文将介绍酵母表达系统的原理、优势和应用。

原理酵母表达系统的核心原理是将外源基因导入酵母细胞，并通过酵母细胞的转录、翻译和修饰机制，使外源基因在酵母细胞中得到表达和功能发挥。

通常情况下，酵母表达系统主要采用酵母菌属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主细胞。

1.酵母转录机制：酵母细胞的基因表达主要通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录，产生mRNA分子。

2.酵母翻译机制：酵母细胞通过核糖体进行翻译，将mRNA翻译成蛋白质。

3.酵母修饰机制：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。

优势相比其他常用的表达系统，酵母表达系统具有一系列的优势：1.高效表达能力：酵母表达系统能够实现高水平的外源基因表达，产量可达到克级。

2.翻译后修饰：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，使蛋白质得到正确的糖基化等修饰。

3.生长条件简单：酵母菌生长条件相对简单，可以在常规培养基中进行培养，对培养条件的要求相对较低。

4.可溶性蛋白质表达：酵母细胞具有较强的蛋白质折叠和修饰能力，能够高效地表达可溶性蛋白质。

应用酵母表达系统广泛应用于以下领域：1.蛋白质研究：酵母表达系统可用于大规模蛋白质表达和纯化，为蛋白质的结构、功能和相互作用研究提供了高效的工具。

2.药物筛选：酵母表达系统可用于药物靶点鉴定和药物分子筛选，加速药物研发过程。

3.疫苗研究：酵母表达系统可用于疫苗候选抗原的高效表达和产量大规模生产。

4.代谢工程：酵母表达系统可用于代谢工程领域，利用酵母细胞对外源代谢产物的高效合成能力，实现产生复杂化合物的目标。

5.生物制药：酵母表达系统已经被广泛应用于生物制药领域，用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。

酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。

了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析基因表达的规律有重要意义，也可为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。

如果外源基因密码子中存在过多的宿主低利用密码子，位于起始密码子附近的低利用密码子对基因的表达就会产生很大影响。

解决这一问题的方法有2种：一是通过点突变的方法用同义高利用率密码子替代低利用密码子而不改变氨基酸序列；另一方法是截取基因中影响其生物活性的部分。

目前，这些方法在甲醇酵母表达系统中都能提高表达水平。

外源蛋白的空间构象、糖基化位点、水溶特性、氨基酸组成以及其他的理化特点都会影响毕赤酵母对其分泌，所以应根据外源蛋白自身的理化特点来选择胞内表达或分泌型表达方式。

外源基因在酵母基因组中的整合数也可以影响外源基因的表达水平，应该选用高拷贝整合来提高外源基因的表达水平。

2、表达框的染色体整合位点和方式虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。

整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。

AOX1和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase，HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。

Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。

这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。

因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。

3、宿主的甲基营养表型：Mut+或Muts用末端与aox1基因5'和3'端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。

aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。

酵母整合型表达载体整合原理和整合原件一、概述酵母整合型表达载体是一种用于基因工程研究中的重要工具，它能够整合外源基因并稳定地在酵母细胞中表达。

这一载体在生物技术领域具有广泛的应用，能够帮助科研人员进行基因表达调控、蛋白质功能研究等方面的工作。

本文将针对酵母整合型表达载体的整合原理和整合原件进行深入探讨，并结合个人观点对其进行分析。

二、整合原理酵母整合型表达载体的整合原理是指外源基因在酵母细胞染色体中的整合方式和机制。

一般来说，酵母整合型表达载体通过与酵母染色体的同源配对，使外源基因在染色体特定位点发生整合。

整合的过程需要依赖一系列的整合原件来进行调控和介导。

其中，整合原件主要包括酵母选择标记基因和整合酶等。

1. 酵母选择标记基因酵母选择标记基因是酵母整合型表达载体中的重要组成部分，它能够在酵母细胞中产生特定的表型，并在培养基中通过筛选来实现对整合事件的筛选。

常见的酵母选择标记基因包括TRP1、LEU2、HIS3等，它们分别对应酵母细胞的色氨酸、亮氨酸和组氨酸代谢通路，能够使突变体在对应的缺陷培养基上无法生长。

通过选择适当的酵母选择标记基因，可以在整合过程中实现对突变体的筛选，从而保证整合事件的稳定性和准确性。

2. 整合酶整合酶是酵母整合型表达载体中的另一个重要组成部分，它能够介导整合事件的进行，并在酵母细胞中调控外源基因的整合。

常见的整合酶包括酵母整合酶(INC)和整合介导蛋白(INP)等，它们能够与酵母染色体上的同源序列进行特异性结合，并介导外源基因的整合过程。

通过对整合酶的调控和改变，能够实现对整合事件的精准和高效地控制，从而满足不同研究需求的整合要求。

三、个人观点酵母整合型表达载体的整合原理和整合原件在基因工程研究中发挥着重要的作用，它们为科研人员提供了强大的工具和评台，能够帮助他们实现对外源基因的整合和驱动。

在未来的研究中，我认为可以进一步优化和改进整合原件的设计和构建，以提高整合事件的稳定性和效率，从而更好地满足不同研究领域对整合事件的需求。

酵母表达系统基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。

其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。

1、酵母表达系统的特点酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。

酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。

某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。

应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。

解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。

另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。

因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。

2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统)（1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。

因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。

酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。

甲醇诱导酵母表达是一种基因工程技术，它的原理是利用受体与配体相结合的原理，通过添加甲醇到培养基中，从而诱导酵母表达特定的外源基因。

这里的“受体”是一种称为Mxr1的转录因子，它不含甲醇时处于非活性状态，加入甲醇后与其配体Met4结合形成活性形式。

而Met4是Mxr1的配体，等待激活Mxr1转录因子的信号来自于甲醇的代谢产物-甲醛。

当酵母中有外源基因需要表达时，可以将该基因与Mxr1和Met4组成的启动子串联起来，在培养基中添加甲醇后，促使Mxr1与Met4相结合，使得启动子被活化，从而使外源基因得以表达。

基于此原理，甲醇诱导酵母表达技术可以实现高效和可控的外源基因表达。

甲醇的使用量可以在一定范围内调节外源基因表达水平，使得表达能够满足研究或应用的需求。

该技术不仅应用于科学研究，如蛋白质的产生与纯化等，还在药物和生物燃料等领域有广泛应用。

基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。

如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。

7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。

酵母菌表面展示操作步骤之转入外源基因酵母菌表面展示是一种常用的蛋白质工程技术，通过将外源基因转入酵母菌表面展示系统，实现目标蛋白质在酵母菌表面的展示和筛选。

下面将介绍酵母菌表面展示操作步骤之转入外源基因的具体步骤。

1. 提取外源基因：首先，需要从源细胞中提取所需的外源基因。

外源基因可以通过PCR扩增、酶切或合成等方法得到。

确保提取到的基因具有正确的序列，并进行验证。

2. 构建表达载体：将提取到的外源基因与适当的表达载体连接。

表达载体通常包括启动子、终止子、选择标记和酵母菌表面展示相关的信号序列。

确保外源基因与表达载体正确连接，并进行验证。

3. 转化酵母菌：选取适合的酵母菌株，并将构建好的表达载体转化到酵母菌中。

转化方法可以根据实验需求选择化学法、电转法或基因枪等。

转化成功后，利用适当的培养基对转化后的酵母菌进行筛选和生长。

4. 筛选积极克隆：将转化后的酵母菌接种到含有选择标记的培养基中，进行筛选。

通过筛选，可以获得表达载体成功转入外源基因的积极克隆。

此步骤通常需要一定时间，取决于所选择的培养基和酵母菌株的特性。

5. 鉴定表达：对筛选出的积极克隆进行表达检测。

可以利用Western blotting等方法，检测目标蛋白是否在酵母菌表面成功展示。

确保所筛选出的克隆具有预期的表达效果。

6. 进一步应用：对表达成功的酵母菌克隆进行进一步的应用。

可以利用这些酵母菌克隆进行蛋白质相互作用研究、酶活性检测、抗原表位筛选等。

根据实际需求进行相应的实验设计和操作步骤。

以上是酵母菌表面展示操作步骤之转入外源基因的基本流程。

在实验过程中，需要注意优化实验条件，保证实验的重复性和可靠性。

同时，根据实验需求调整各个步骤的细节，以获得最佳的实验结果。

一、实验目的1. 掌握酵母转化实验的基本原理和操作步骤。

2. 熟悉酵母转化过程中所使用的试剂和仪器。

3. 通过实验，了解酵母转化实验在基因工程中的应用。

二、实验原理酵母转化是指将外源DNA分子导入酵母细胞内，使其在酵母细胞内表达的过程。

本实验采用化学转化法，利用氯化钙处理酵母细胞，使其成为感受态细胞，从而实现外源DNA的导入。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：- 酵母菌株：Saccharomyces cerevisiae- 载体质粒：pUC19- 酵母转化试剂盒：S.C. EasyComp Transformation Kit- YPD培养基：酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖- 氯化钙：CaCl2- 甘油：丙三醇- 碘化钾：KI- 磷酸氢二钠：Na2HPO4- 磷酸二氢钠：NaH2PO4- 水合氯醛：CHCl3- 无水乙醇：C2H5OH- 70%乙醇：C2H5OH2. 实验试剂：- 20%葡萄糖溶液：20g葡萄糖溶于80ml蒸馏水中- 10mg/mL质粒DNA溶液：取适量质粒DNA，加入适量无菌水，配制成10mg/mL 的溶液- Solution I：0.2mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），含1.0mol/L氯化钠- Solution II：0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0），含1.0mol/L氯化钠和1.0mol/L甘露醇四、实验步骤1. 酵母细胞培养- 将酵母菌株接种于YPD培养基中，于30℃培养过夜。

- 次日，挑取单菌落，接种于50mlYPD培养基中，于30℃、220rpm摇床培养过夜。

2. 酵母细胞感受态制备- 取适量菌液，于4500rpm、室温离心5min，弃上清。

- 加入10ml Solution I，重悬菌体。

- 4500rpm、室温离心5min，弃上清。

- 加入1ml Solution II，重悬菌体。

- 将菌液分装至1.5ml离心管中，每管50μl，于-80℃保存。

3. 酵母转化- 取适量质粒DNA溶液，加入适量无菌水，配制成10ng/μl的溶液。

服务简介酵母具有与其他真核生物类似的蛋白质分泌途径，外源基因的分泌表达, 不仅方便了表达产物的分离纯化, 同时也和表达产物的翻译后加工有关, 很有意义。

酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，酵母外源基因分泌表达系统（简称酵母外泌表达系统）采用的宿主是巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris），该表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。

服务原理甲醇酵母系统分泌表达载体巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）编码基因AOX1和AOX2，两种序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。

当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

服务优势1. 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。

2. 培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基成本合理，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。

3. 外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能得到高表达菌株。

4. 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

酵母外泌表达系统的优势1. 具备完备的毕赤酵母表达平台，可以根据蛋白特性或客户的需求设计不同的实验方案；2. 具有高通量的筛选平台，可以快速有效的得到最佳表达条件；3. 具有大规模发酵生产能力服务内容科研人员建立了成熟的酵母表达纯化服务平台，提供优质的重组蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化服务。

酵母外泌表达系统服务项目:1.重组酵母表达质粒构建；2.重组质粒电转化；3.重组表达子筛选；4.小规模蛋白表达和纯化（2L培养基培养产物）；南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。

酵母表达手册
酵母表达系统是一种常用于生产重组蛋白质的方法，其利用酵母细胞作为宿主来表达外源基因。

以下是酵母表达系统的基本步骤：
1. 基因克隆和转化：将目的基因克隆到酵母表达载体中，常用的载体有质粒和整合型载体。

转化方法包括电转化和化学转化。

2. 重组蛋白表达：将转化后的酵母细胞接种到发酵罐中进行培养，在适宜的温度、pH和营养条件下，目的基因在酵母细胞中表达出重组蛋白。

3. 蛋白质纯化：通过一系列的纯化技术，如离心、过滤、沉淀、亲和层析等，将重组蛋白从酵母细胞中分离出来并进行纯化。

4. 蛋白质后处理：根据需要，对纯化的重组蛋白进行进一步的后处理，如去盐、脱色、除菌等。

5. 蛋白质检测：通过SDS-PAGE、Western blot等方法检测重组蛋白的表达水平和纯度。

6. 蛋白质功能研究：对纯化的重组蛋白进行生物活性检测和功能研究，如酶活测定、免疫分析等。

在实际应用中，需要根据不同的需求选择不同的酵母表达系统，如酿酒酵母表达系统、毕赤酵母表达系统等。

同时，还需要对重组蛋白进行质量分析和稳定性研究，以确保其用于后续的实验或生产中具有可靠性和有效性。

酵母菌真核表达
酵母菌真核表达是指将外源基因导入酵母菌（如酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae）中并进行真核表达。

真核表达一般
是指在真核生物细胞中进行基因转录和翻译，由核糖体进行蛋白质合成。

酿酒酵母菌作为一种常用的真核表达系统，在基因工程、生物医药研究等领域得到广泛应用。

酵母菌真核表达具有多种优点。

首先，酿酒酵母菌具有丰富的代谢途径和分泌系统，能够有效地转化和分泌表达的蛋白质。

其次，酵母菌具有较好的基因可操作性和生长特性，能够在较短的时间内大规模培养。

此外，酿酒酵母菌在生物安全性和伦理道德方面也具备优势，在科学研究和工业应用中被广泛使用。

酿酒酵母菌真核表达的方法主要包括质粒介导表达和基因组整合表达。

质粒介导表达通常通过构建针对酵母细胞具有选择性的表达载体，将外源基因导入酵母细胞，并在适当的启动子和终止子的调控下进行蛋白质的表达。

基因组整合表达将外源基因直接整合到酵母菌基因组中，利用其自身的转录和翻译机制来实现表达。

酵母菌真核表达在生物学研究中可以用于研究基因功能、蛋白质结构与功能以及信号转导等问题。

在生物医药领域，酵母菌真核表达可以用于生产重组蛋白、抗体、疫苗等生物药物。

此外，酵母菌真核表达还广泛应用于酵母遗传学、疾病模型构建、基因治疗等研究领域。

将目的基因导入酵母菌的方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：将目的基因导入酵母菌是一种常见的实验技术，可以用于基因工程、生物学研究和生物技术应用等领域。

以下是关于将目的基因导入酵母菌的方法的详细介绍。

一、介绍酵母菌是一种常见的真菌，广泛应用于食品发酵、生物燃料生产和药物生产等领域。

将外源基因导入酵母菌可以改变其代谢特性、增强其生产能力，从而扩大其应用范围。

下面将介绍将目的基因导入酵母菌的方法。

二、选择适当的表达载体在将目的基因导入酵母菌之前，首先需要选择一个适当的表达载体。

常用的表达载体有质粒、病毒、质粒体等。

质粒是最常用的表达载体，因为它具有较强的载体稳定性和易于操作的特点。

还需要考虑选择适当的启动子、选择子和标记基因等。

三、构建目的基因载体构建目的基因载体是将目的基因插入到选择的载体中，以便将其导入酵母菌。

首先需要将目的基因进行PCR扩增，获得目的基因的DNA序列。

然后，将目的基因与载体进行连接，可以通过酶切和连接、PCR扩增等方法进行。

最终构建出目的基因载体。

四、转化酵母菌转化是将构建好的目的基因载体导入酵母菌的过程。

目前常用的转化方法有质粒转化、电穿孔法、化学转化、凝血作用等。

质粒转化是最为常用的方法。

质粒转化的步骤主要包括酵母菌细胞的预处理、质粒的导入和细胞的再生。

五、筛选阳性转化子在转化酵母菌后，需要进行阳性转化子的筛选。

阳性转化子是指成功导入了目的基因的酵母菌细胞。

常用的筛选方法有抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选、基因荧光标记筛选等。

通过有效的筛选方法，可以获得目的基因成功导入的阳性转化子。

六、验证目的基因的表达最后一步是验证目的基因在酵母菌中的表达情况。

可以通过RT-PCR、Western blot等方法来检测目的基因的表达水平。

验证表达成功后，即可进行后续的实验和应用。

在将目的基因导入酵母菌的过程中，需要注意以下几个方面的问题：1. 酵母菌细胞的处理条件，包括培养基的配制、细胞密度的控制等。

酵母菌表面展示操作步骤之转形酵母菌转形酵母菌是一种常用于表达外源蛋白的生物工具。

通过将外源基因导入酵母菌细胞，可以使酵母菌表面展示目标蛋白，从而实现其研究、应用和生产利用。

下面是转形酵母菌的操作步骤：步骤一：准备实验材料和试剂在进行酵母菌的表面展示前，需要准备一些常用的实验材料和试剂，包括：酵母菌菌种、培养基（如YPAD）、选择性培养基（含相应抗生素）、含转形试剂的培养基（如SOB培养基）、PCR产物或启动子-报告基因载体、聚乙烯醇（PEG）/锂醋酸转化体系。

步骤二：培养酵母菌菌种首先，从酵母菌菌种库中取出所需菌株，接种到含有适当营养物的固体培养基（如YPAD平板）中，培养过夜在30°C下。

然后，从过夜培养的单菌落中挑取菌落，接种到含有适当营养物的液体培养基中，进行前驱培养。

步骤三：制备DNA或载体根据需要表达的目标蛋白的编码基因序列，利用PCR方法扩增出相应的DNA 片段。

在反应中加入引物和模板DNA，通过酶切、连接、转化等步骤，将目标蛋白的编码基因插入酵母菌表达载体中。

步骤四：转化酵母菌细胞将制备好的DNA或载体与酵母菌细胞共转化，使外源基因导入酵母菌细胞。

将DNA或载体和酵母菌细胞按照适当的比例混合，然后在冰上静置20-30分钟，使DNA与酵母菌细胞发生结合。

接下来，在热激冷激转化条件下，使用PEG/锂醋酸转化体系或其他合适的方法进行转化。

步骤五：筛选转化子将转化后的混合物均匀涂布在含有选择性抗生素的固体培养基上，培养足够时间以让幸存的转化子形成菌落。

通过筛选，可以获得具有外源基因的转化子。

步骤六：诱导表达目标蛋白选取含有外源基因的转化子，将其转接到启动子-报告基因载体中。

将构建好的重组酵母菌细胞接种到诱导培养基中，促使目标蛋白的表达。

在适当的时间和条件下，培养酵母菌细胞，使其表达目标蛋白。

步骤七：表征和检测目标蛋白通过Western blot、荧光显微镜等方法，对表达的目标蛋白进行检测和表征。

毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是:醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢.为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。

而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。

细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。

甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株,可占可溶性蛋白的 30％以上。

AOX2 基因与 AOX1 基因有 97％的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多,通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。

毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。

利用含有α因子序列的分泌型载体即可。

翻译后修饰:酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N—连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度(平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的(50—150 个甘露糖残基）短得多。

菌株:GS115 （ Mut+, Muts)和 KM71（Muts）分泌型载体:pPICZα A,B,and C(5’AOX1启动子,紧密型调节,甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达,Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签）胞内表达型载体：pPICZ A，B，and C，一：分子克隆1。

设计引物分泌型载体图谱：见酵母表达说明书（p13—pPICZ A，p14-pPICZ B，p15—pPICZ C)2.PCR扩增基因PCR反应体系（50μl）模板DNA 1μlForward Primer（10μM）1μlReverse Primer（10μM）1μldNTP Mixture（各2mM）：4μl5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μlPrimerSTAR DNA Polymerase 0。