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肝细胞的研究肝细胞是肝脏中最重要的细胞类型，它们承担着肝脏的大部分功能，包括新陈代谢、排泄、解毒和合成等。
因此，肝细胞的研究对于理解肝脏的生理机制以及疾病的发生与发展具有重要的意义。
本文将从肝细胞的结构、功能、疾病以及研究的方法等方面进行阐述。
肝细胞的结构肝细胞是一种多角形的细胞，其大小为20-30微米，形状类似于六边形。
肝细胞的细胞膜具有丰富的微绒毛，这使得其表面积增大，有利于物质的吸收与排泄。
肝细胞的细胞核位于细胞的中心，内含染色体、核仁以及其他的核质质量。
肝细胞的质膜主要由内质网、高尔基体、线粒体等细胞器组成。
而肝细胞的内质网由平滑内质网和粗面内质网组成。
平滑内质网主要参与合成脂质、碳水化合物、雌激素等生化过程。
而粗面内质网主要参与蛋白质的合成过程。
高尔基体参与质膜上的糖酸基团的加入等过程。
线粒体的功能则是催化氧化磷酸化反应，生成人体所需的ATP分子。
肝细胞的功能肝细胞在人体代谢过程中扮演非常重要的角色。
其主要功能包括以下几个方面：1、代谢功能：肝细胞能够利用各种酶催化化学反应，包括葡萄糖的合成、糖原贮存，脂肪酸和胆固醇的合成与转运、乙醛的转化和分解等。
2、解毒功能：肝细胞能够将吸入或进食中各种毒物转化成为生物化合物和无害化物质，从而改变毒素的性质和排出毒素。
3、合成功能：肝细胞能够合成人体所需的蛋白质、脂肪、碳水化合物和铁质等，具有重要的营养功能。
4、分泌功能：肝细胞能够分泌胆汁中，包括胆色素、胆固醇、胆盐等多种化合物，起到胆汁清洁、消化和吸收的作用。
5、免疫功能：肝细胞参与人体免疫机制，如识别和清除存在体内的细菌。
肝细胞的疾病肝细胞的疾病包括肝炎、肝癌、脂肪肝、肝纤维化等。
其中，病毒性肝炎是最常见的一种疾病类型，它包括乙型肝炎、丙型肝炎等多种类型。
病毒攻击肝细胞时，会破坏正常的肝细胞结构和功能，引发慢性肝病、肝硬化、肝癌等疾病的发生。
脂肪肝则是由于肝细胞脂肪沉积过多而引起的疾病类型。
此外，长期饮酒、吃药过量等也会影响肝细胞的功能，引起肝炎、肝癌等疾病。
肝脏细胞在体外培养技术的研究肝脏是人体最重要的器官之一，其主要功能是解毒、代谢、贮藏和合成。
然而，肝脏疾病在世界范围内仍然是一个重要的公共卫生问题。
在过去几十年中，肝脏细胞在体外培养技术的研究逐渐成为了一项重要的生物医学研究领域。
这项技术是指从人体肝脏中分离出来的肝细胞，通过外界提供的营养条件，使其在体外继续生长和分化。
这项技术不仅有助于深入了解肝脏生理学和疾病发生机制，还可以用于药物筛选、毒理学研究和肝移植等领域。
然而，肝脏细胞在体外培养的难度很大，一方面是因为肝脏细胞在体外容易失去其功能和特性，另一方面则是由于肝脏细胞的可塑性非常弱。
因此，如何在体外培养肝脏细胞，并保持其结构和功能的完整性成为了研究的重点。
从组织学角度来看，肝脏的结构非常复杂。
肝脏由肝小叶组成，每个肝小叶包含数百万个肝细胞、肝窦和肝管。
肝细胞没有直接连接，而是通过肝窦相连。
这样的结构能够使肝细胞与血液接触，从而能够达到解毒和代谢的作用。
因此，要在体外培养肝脏细胞就需要考虑如何模拟肝脏这种结构。
在研究中，肝细胞常用的培养基是DMEM/F12(1:1),其中DMEM包含了必需的氨基酸、糖类和维生素，而F12则富含微量元素。
为了模拟肝脏的组织结构，可以使用3D培养体系，如细胞聚集体、生物支架和生物芯片等。
这些3D培养体系可以更好地模拟肝小叶和肝窦之间的关系，从而提高肝细胞在体外培养中的生存率和功能表现。
其中，生物支架是一种被广泛使用的3D培养体系，它可以提供一种类似于肝窦的微环境，并通过支架对肝细胞进行定位和定向生长。
生物芯片则是一种新型的3D培养系统，基于微流体和微加工技术，能够在非压力、低剪力的微环境下培养肝细胞。
使用这种技术，可以更精确地调控细胞生长的微环境，从而获得更稳定的结果。
除了3D培养体系之外，肝细胞在体外培养中的质量管理也非常重要。
在这方面，正常的肝细胞生态系统、细胞密度、超生和梯度离心等操作都会对细胞的品质产生重要影响。
干细胞提取与保存的技巧与方法干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型的细胞，具有巨大的潜力在医学和生物学领域中应用。
干细胞的提取和保存是关键的步骤，本文将介绍干细胞提取和保存的技巧与方法。
一、干细胞提取的技巧与方法1. 骨髓提取法：这是一种常用的干细胞提取方法。
通过无痛穿刺骨髓髓腔，将骨髓液抽取出来。
在抽取骨髓液之前，患者通常接受麻醉以减轻不适感。
骨髓液中富含造血干细胞，是一种常见且具有较高干细胞含量的来源。
2. 脐带血提取法：脐带血也是一种常见的干细胞来源。
在新生儿出生后，由医生采集脐带血样本。
脐带血中的干细胞数量较多且易于提取，因此被广泛应用于临床治疗。
这种方法对于新生儿和脐带血样本的采集具有一定要求，需要专业的医生或护士进行操作。
3. 脂肪组织提取法：越来越多的研究表明，脂肪组织中也存在干细胞。
通过脂肪吸取手术，可以从脂肪组织中提取干细胞。
脂肪组织中的干细胞具有较高的分化潜能和自我更新能力，因此被广泛研究和应用于再生医学。
4. 神经组织提取法：对于神经组织相关的疾病研究，干细胞的提取通常需要从神经组织中进行。
这种方法通常需要进行手术操作，因此对于患者和医生来说都具有一定的风险与挑战。
但是，神经组织中的干细胞对于神经系统疾病的治疗具有重要意义。
二、干细胞保存的技巧与方法1. 冷冻保存：这是最常用的干细胞保存方法之一。
在提取干细胞后，将其以低温冷冻储存。
一般情况下，干细胞在-196℃的液氮中冷冻保存，以确保其长期保存和保持其功能。
在冷冻保存过程中，需要特殊的冷冻冻存液和冷冻设备，操作时需小心谨慎，避免细胞损伤。
2. 固体冻干法：这是一种相对较新的干细胞保存方法。
干细胞在低温下冷冻后，通过冻干设备将水分从细胞中去除，然后将细胞以固体形式保存。
这种方法可以避免细胞在冷冻和解冻过程中的冰晶损伤，并能够长期保存细胞的活性。
3. 混合保存法：有些干细胞存储公司提供混合保存的方法，即将干细胞保存在液氮中冷冻，并同时保存一小部分细胞的活体状态。
一、实验目的1. 了解肝脏离体实验的基本原理和操作步骤。
2. 掌握肝脏细胞在离体条件下的生理、生化变化。
3. 学习肝脏细胞培养技术的应用。
二、实验原理肝脏是人体重要的代谢和解毒器官，具有多种生理功能。
离体实验是指将动物肝脏从体内取出，在无菌条件下进行体外培养，以研究肝脏细胞在不同条件下的生理、生化变化。
本实验通过肝脏离体培养，观察肝脏细胞在体外环境下的生长、代谢及形态变化。
三、实验材料1. 实验动物：成年雄性大鼠，体重200-250g。
2. 实验仪器：手术显微镜、解剖剪、镊子、手术刀、剪刀、剪刀、无菌培养皿、培养瓶、离心机、显微镜等。
3. 实验试剂：生理盐水、双抗（青霉素、链霉素）、肝素、Hanks平衡盐溶液、DMEM培养基、胎牛血清等。
四、实验步骤1. 动物处死与肝脏取出：将大鼠用颈椎脱位法处死，迅速取出肝脏，放入含有双抗的生理盐水中清洗，去除血污。
2. 肝脏组织块制备：用手术剪将肝脏组织剪成1mm×1mm×1mm的小块，放入含有双抗的Hanks平衡盐溶液中。
3. 肝脏细胞培养：将肝组织块放入培养瓶中，加入DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%双抗、1%肝素），放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。
4. 细胞传代：待细胞生长至瓶底约80%时，用胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液，按照1:2的比例传代培养。
5. 细胞形态观察：在显微镜下观察细胞生长情况，包括细胞形态、密度、生长速度等。
6. 细胞生化指标检测：通过检测细胞内乳酸脱氢酶（LDH）活性、谷丙转氨酶（ALT）活性等指标，了解细胞代谢状况。
五、实验结果1. 细胞形态：肝脏细胞在体外培养过程中，逐渐生长、分裂，形成单层或多层细胞层。
细胞呈圆形、多角形或不规则形，细胞质丰富，细胞核清晰可见。
2. 细胞生长速度：肝脏细胞在体外培养过程中，生长速度较快，约每24小时分裂一次。
3. 细胞代谢：通过检测细胞内LDH和ALT活性，结果显示，肝脏细胞在体外培养过程中，代谢旺盛，LDH和ALT活性较高。
细胞生物学中的细胞分离和培养技术细胞分离和培养技术在细胞生物学领域中起着至关重要的作用。
通过这些技术，科学家们能够分离出人体或其他生物体中的不同类型的细胞，并将其培养在适当的培养基中，使其继续生长和繁殖。
这些技术为我们研究细胞的功能和特性提供了重要的工具。
本文将详细介绍细胞分离和培养技术的原理、方法和应用。
一、细胞分离技术细胞分离是指将复杂的组织和器官中的细胞分离出来，以获得纯净的细胞群。
常用的细胞分离技术包括机械法、酶消化法和负选择法等。
1. 机械法机械法是最简单也是最常用的细胞分离方法之一。
它利用机械力对组织进行研磨或切割，使组织细胞变成悬浮状态。
通过滤网或离心等方法，能够分离出不同大小、形态和密度的细胞。
2. 酶消化法酶消化法是利用特定的酶对组织进行消化，以破坏组织细胞之间的黏着力，并分离出单个的细胞。
常用的消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶和牛血清蛋白酶等。
3. 负选择法负选择法是通过标记已知种类的细胞，并将其排斥在分离细胞群之外，从而获得目标细胞。
这种方法可以用于从复杂的细胞混合物中分离出特定的细胞类型。
二、细胞培养技术细胞培养技术是将分离出的细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的温度、湿度和营养条件，使细胞能够在体外继续生长、增殖和分化。
细胞培养技术广泛应用于医学研究、药物筛选和生物工程等领域。
1. 组织培养组织培养是将整个组织或组织片段放置在培养皿中，并提供适当的培养基，使组织细胞能够在体外长时间存活。
通过组织培养，可以研究组织的生长、分化和再生能力。
2. 原代细胞培养原代细胞培养是将从动物体内直接分离得到的细胞进行培养。
这些细胞最接近原始状态，具有更大的培养和繁殖能力。
原代细胞培养广泛应用于研究和生产中。
3. 细胞系细胞系是指从原代细胞培养中得到的无限增殖能力的细胞。
细胞系广泛应用于药物筛选、疫苗生产、毒性测试等领域。
常见的细胞系有HeLa细胞、293细胞和NIH/3T3细胞等。
三、细胞培养技术的应用细胞培养技术在许多领域都有重要的应用。
原代肝细胞分离方法体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法.1.1 采用非灌流的方法早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞.1.1.1 机械分离法:机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张顶et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞.1.1.2 胰酶消化法:胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培养中. 刘友平et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液.1.1.3 胶原酶消化法:胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王琳et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液.1.2 采用灌流的方法虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高.1.2.1 离体胶原酶灌流法:离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液.1.2.2 Seglen两步灌流法（原位胶原酶灌注法）:自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率. 1.2.3 半原位胶原酶灌流法:半原位胶原酶灌流法是我国学者彭齐容 et al[13]以Seglen法为基础建立的肝细胞分离技术. 俞红et al[14]在采用该方法分离乳猪肝细胞时, 首先用无钙无镁的D-Hank's液于门静脉进行原位灌注. 接着, 除保留门静脉以外, 离断肝脏血管并将肝脏移入无菌平皿中, 继续用胶原酶进行灌注使肝细胞与间质细胞分离. 最后钝性撕裂组织, 过滤洗涤后得到制备好的细胞悬液.1.2.4 下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法:下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法是在肝下腔静脉插管, 并结合逆向胶原酶灌注来分离肝细胞的方法[9]. 在采用该方法分离肝细胞时, 首先将灌注针逆向插入下腔静脉后固定, 门静脉开放做流出道. 接着用含EGTA或EDTA的灌注液进行灌注, 一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充分灌注. 灌流结束后, 将细胞过滤、清洗后得到制备好的肝细胞悬液.1.2.5 Gerlach五步胶原酶灌流法:在使用两步灌流法分离大的肝组织块时, 仍存在消化不完全的问题. 而Gerlach et al[15]在两步灌流法的基础上, 创立了联合门静脉和肝动脉的五步胶原酶灌流技术, 建立了一种高效的细胞分离方法。
原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。
本文将探讨原代肝细胞培养的方法。
原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。
它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。
原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。
首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。
一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。
然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。
常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。
这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。
接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。
一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。
在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。
此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。
然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。
首先，选择合适的培养基是非常重要的。
常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。
这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。
其次，细胞密度的控制也非常重要。
通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。
此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。
温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。
成人脂肪肝整肝肝细胞分离及大量冻存的实验研究李涛;佟辉;申川;祝哲诚【期刊名称】《肝脏》【年(卷),期】2017(022)005【摘要】目的建立成人脂肪肝整肝肝细胞的分离以及人肝细胞大量冻存技术,为生物人工肝提供稳定的人肝细胞来源.方法采用胶原酶经肝静脉逆行灌注的方法分离成人重度脂肪肝的整肝肝细胞,并比较常规冻存和程序冻存后肝细胞在细胞活性、贴壁率、LDH漏出量及白蛋白合成能力的差异.结果采用添加N-乙酰半胱氨酸(NAC)的胶原酶灌注液分离肝细胞的产量为(7.4±0.5)×106 cells/g肝组织,活性为(81.4±3.4)%,而未添加NAC组的肝细胞产量为(5.6±0.8)×106 cells/g肝组织和活性为(67.3±5.0)%,差异均有统计学意义(P<0.05).分离的人肝细胞采用程序冻存后在细胞活性、贴壁率及白蛋白合成能力方面均相应高于常规冻存组(P<0.05),LDH漏出量低于常规冻存组(P<0.05). 结论应用添加NAC的胶原酶灌注液经肝静脉逆行灌注可提高脂肪肝整肝肝细胞分离的活性及产量,采用程序冻存的方法可以提高冻存人肝细胞的活性,满足生物人工肝对肝细胞的需要.【总页数】4页(P410-413)【作者】李涛;佟辉;申川;祝哲诚【作者单位】200025 上海交通大学附属瑞金医院肝移植中心;200025 上海交通大学附属瑞金医院肝移植中心;200025 上海交通大学附属瑞金医院肝移植中心;200025 上海交通大学附属瑞金医院肝移植中心【正文语种】中文【相关文献】1.用于生物人工肝的大量猪肝细胞低温冻存技术 [J], 李涛;祝哲诚;谢俊杰;程东峰;申川;沈柏用;彭承宏2.生物人工肝乳猪肝细胞的聚集培养、冻存及形态、功能观察 [J], 秦爱兰;周霞秋;俞红;谢青;张(韦华);郭清3.异种冻存肝细胞移植治疗急性肝衰的可行性研究 [J], 林丛;侯宽永4.复方中药抑制非酒精性脂肪肝肝细胞色素P450ⅡE1表达的实验研究 [J], 戴宁;曾民德;李继强;范竹萍;茅益民;彭延申;陆伦根;邱德凯5.成人原代肝细胞的分离、培养及冻存 [J], 杭化莲;张磊;施晓雷;卞建民;丁义涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
metastases:acomparisonofinterstitiallaserphotocoagulation(ILP )and percutaneousalcoholin jection (PAI ).ClinRadiol,1993;48(3):166-171.(收稿日期:2004-09-18)・综述・人肝细胞的分离、培养和冻存李 涛 彭志海 摘要 人肝细胞是生物人工肝的最理想细胞来源,决定其治疗效果。
本文就人肝细胞分离、培养及冻存进行综述。
关键词 生物人工肝 人肝细胞 分离 培养 冻存作者单位:200080上海,上海市第一人民医院普外科 进展期肝功能衰竭(advancedacuteliverfailure )唯一证明有效的治疗措施是急诊肝移植(livertrans 2plantation,LT )[1]。
然而,许多患者却由于供肝的严重缺乏而在等待中死去。
这促使了研究者对肝功能支持研究的兴趣。
理想的肝功能支持可以使患者成功的桥接(bridge )肝移植或者使患肝得以再生恢复[2]。
作为一种替代疗法,一个桥接设备可以像肾透析一样为衰竭的肝脏提供长期的支持[3]。
在生物人工肝中(bioartificialliver,BAL ),患者的血浆循环通过体外的生物反应器,该反应器装载有具有生物合成、解毒和生物转化功能的肝细胞,从而发挥肝功能支持作用。
人原代肝细胞可以提供大部分肝功能,因此是生物人工肝中最理想的肝细胞来源。
本文主要对人肝细胞的分离技术、培养方法及冻存研究进展作一综述。
1.人肝细胞的分离人肝细胞主要来源于外科切除标本及由于严重脂肪变性或者肝硬化而遗弃的供肝[4～8,22,24]。
与脂肪肝相比,肝硬化肝分离的肝细胞产量及活性均低,但肝细胞的安定代谢功能却没有差别[8]。
目前广泛应用的人肝细胞分离技术是Seglen [9]创立的胶原酶两步法灌注分离技术。
简述如下:对于整肝灌注,通过门静脉插管并固定;而对于肝段,则通过切面主要血管开口插管,其他血管结扎以防漏液。
首先用含离子鳌合剂如EDTA [7,8,24]或者EGTA [23,25]的无Ca 2+缓冲液(保持37℃)灌注,目的是去除Ca 2+离子,打破细胞间桥粒紧密连接。
接着用含Ca 2+离子的胶原酶缓冲液灌注消化组织。
收集消化后的肝细胞并悬浮于冰冷的培养基中。
然后,通过不锈钢筛网过滤及低速离心纯化肝细胞。
分离纯化后的肝细胞通常立即采用台盼兰抗拒染色法评估细胞活性[7,8,23～25]。
许多研究小组通过对该技术略加改良分离获得肝细胞[4～7,24]。
最近,一个意大利研究小组设计了一种改良四步法来分离人肝细胞,目的是减小缺血再灌注损伤及提高细胞分离后能量状态,从而提高分离后肝细胞的活性[6]。
与传统两步法相比,其在EDTA 灌注前及胶原酶灌注后采用含甘氨酸、丙氨酸及果糖等基质的灌注液灌注,以促进肝细胞分离后的能量恢复[6]。
分离肝细胞的数量及活性主要取决于组织质量、供肝冷缺血时间、灌注液成分、胶原酶类型和浓度。
大多数研究中所用的酶为胶原酶Ⅳ或胶原酶P [7,8,24,25]。
Liberase 是一种用来分离胰岛细胞的酶,它具有更低细菌污染的优点,最近有报道用来分离肝细胞。
Donini 等[10]曾比较LiberaseHI 与胶原酶P 分离猪肝细胞的效果,结果发现LiberaseHI 可有效的分离获得更高活性的猪肝细胞。
因此,许多小组应根据自己实验室条件建立自己的分离技术,这主要考虑下述因素:理想的灌注装置、胶原酶类型及浓度、灌注液离子浓度、灌注时间及温度、灌注液流速等。
2.人肝细胞原代培养成熟肝细胞通常不能存活超过2周,并且在标准体外培养条件下不能增值。
长期培养肝细胞,首・29・国外医学外科学分册2005年第32卷第2期SurgeryForei gnMedicalSciences, 2005,vol.32.No.2先需要良好的细胞贴壁。
这就需要培养器皿必须被覆某种基质如胶原酶Ⅰ或明胶[5,11,12]以提供细胞生长所需要的相似的体内细胞外环境。
另外,培养基中须添加人类血清[4]、生长因子如HGF和/或EGF[5,13]、胰岛素[11,14]、糖皮质激素如地塞米松[15]等。
最近,Katsura等[4]发展了一种培养体系,能够长期培养人肝细胞并能保持肝细胞的分化功能。
他们发现人肝细胞在添加了10%人血清、10mmol/L烟酰胺、10n g/mLEGF、0.5μg/mL胰岛素、10-7 mol/L地塞米松及抗生素的角蛋白刺激因子培养基(keratinoc yte2stimulatin gfactormedium)中可以存活超过56天。
尽管许多研究者建立了各自的人肝细胞长期培养方法,但这些研究多为所需肝细胞数量较少的药理学方面的研究,其培养的细胞量并不能满足生物人工肝的需要。
对于生物人工肝而言,通常需要超过1010个细胞以维持患者肝功能[2]。
因此,生物人工肝需要特殊的肝细胞培养体系,其不仅能提供足够的表面积以供大规模肝细胞贴壁,而且能提供细胞生存所需的足够的营养及氧气。
3.人肝细胞的冻存人肝细胞的获得是不确定的,而且一旦获得,将会分离出大量的肝细胞(超过109个肝细胞),通常超过了研究所需。
这样,许多肝细胞将被浪费掉。
虽然肝细胞可以短期保存在UW液中[23],但是仍需要发展长期保存肝细胞的冻存方法,以期获得在研究及临床中最大限度的应用。
在过去的20年中,许多关于猪肝细胞[15,16]和人肝细胞[14,19]的冻存方法已经被提出。
但目前尚没有一个标准的冻存方法。
任何冻存方法的最终目的是最小化可以损伤细胞亚结构的细胞内冰晶形成,从而保持解冻后细胞活性、粘附能力及代谢活性。
一个成功的冻存方法主要取决于冻存速度、冻存肝细胞的浓度、冻存保护剂的类型及终浓度等[17]。
许多研究应用计算机程序冷冻仪来控制温度,使其以更精确的方式下降,从而避免悬液中细胞内冰晶的形成。
Guillouzo等[18]回顾了1999年研究文献,结论是没有可信的证据表明复杂的程序降温比普通的-20℃然后-80℃两步降温法更有利。
最近,Alexandre等[19]比较了计算机控制型冷冻仪实现的阶梯式降温法(stepwise freezin g,SF)及异丙醇冷冻仪实现的逐步降温法(progressive freezin g,PF),发现总复苏率PF (38%±3%)高于SF(12%±2%)。
二甲基亚砜(dimeth ylsulfoxide,DMSO)在多数研究中用来作为冻存保护剂[14,19]。
聚维酮(polyvinylpyrrolidone)是另外一种冻存剂,它可以保护细胞的亚结构[19]。
至于肝细胞在液氮中冻存时间问题,目前认为冻存时间对解冻后肝细胞功能影响很小[20]。
总之,理想的肝细胞冻存方法还没有出现,仍需进一步研究。
最近,一个意大利研究小组报道了第一例应用冻存肝细胞的生物人工肝成功桥接一名暴发性肝功能衰竭患者到肝移植[21]。
虽然目前尚无标准冻存方法,而且肝细胞在解冻后有60%～65%的丢失[19],但无疑冻存肝细胞在生物人工肝未来的应用中有着广阔的前景。
参 考 文 献1.BernalW,WendonJ.Livertrans plantationinadultswithacuteliv2erfailure.JHe patol,2004;40:192-197.2.StrainAJ,Neuber gerJM.Abioartificialliver2stateoftheart.Scinece,2002;295:1005-1009.3.AllenJW,HassaneinT,BhatiaSN.Advancesinbioartificialliverdevices.He patology,2001;34:447-455.4.KatsuraN,IkaiI,MitakaT,etal.Lon g2termcultureof primar yhumanhe patocyteswith preservationof proliferativeca pacityand differentiatedfunctions.JSur gRes,2002;106:115-123.5.FerriniJB,PichardL,Domer gueJ,etal.Lon g2term primar ycul2turesofaldulthumanhe patocytes.ChemBiolInteract,1997;107:31-45.6.BaccaraniU,SannaA,CarianiA,etal.Isolationofhumanhe pato2cytesfromliversre jectedforlivertrans plantationonanationalba2 sis:resultsofa22yearex perience.LiverTrans pl,2003;9:506-512.7.HewittWR,CornoV,E guchiS,etal.Isolationofhumanhe pato2cytesfromliversre jectedforwholeor gantrans plantation.Trans2 plantProc,1997;29:1945-1947.8.BaccaranlU,DoniniA,RisalitiA,etal.Steatoticversuscirrhoticliversasasourceforhumanhe patocyteisolation.Trans plantProc.2001;33:664-665.9.Se glenPO.Pre parationofisolatedratlivercells.MethodsCellBi2ol,1976;13:29-83.10.DoniniA,BaccaraniU,LavaroniS,etal.LiberaseHIenz ymever2suscolla genaset ypePfor porcinehe patocyteisolation.Trans plant Proc,2001;33:1972-1973.11.Hon gJT,GlauertHP.Effectofextracellularmatrixontheex pres2sionof peroxisome proliferationassociated genesinculturedrathe p2 atocytes.ToxicolInVitro,2000;14:177-184.12.ChenHL,WuHL,FonCC,etal.Lon g2termcultureofhe pato2cytesfromhumanadults.JBiomedSci,1998;5:435-440.13.Michalo poulosGK,BowenW,NusslerAK, parative・39・国外医学外科学分册2005年1月第32卷第2期SurgeryForei gnMedicalSciences, 2005,vol.32.No.2 analysisofmito genicandmor phogeniceffectsofHGFandEGFon rat andhumanhe patocytesmaintainedincolla gen gels.JCellPh ysi 2ol,1993;156:443-452.14.OstrowskaA,BodeDC,PrussJ,etal.Investigationoffunctionalandmor phologicalinte grityoffreshl yisolatedandcr yopreservedhu 2manhe patocytes.CellTissueBank,2000;1:55-68.15.WuL,SunJ,WangL,etal.Cryopreservationof primar y porcinehepatocytesforuseinbioartificialliversu pports ystems.Trans plant Proc,2000;32:2271-2272.16.DarrTB,HubelA.Postthawviabilityof preculturedhe patocytes.Cryobiolo gy,2001;42:11-20.17.Llo ydTD,OrrS,SkettP,etal.Cryopreservationofhe patocytes:areviewofcurrentmethodsforbankin g.CellTissueBank,2003;4:3-15.18.GuillouzoA,RiallandL,FautrelA,etal.Survivalandfunctionofisolatedhe patocytesaftercr yopreservation.ChemBiolInteract,1999;121:7-16.19.AlexandreE,Viollon2AbadieC,DavidP,etal.Cr yopreservationofadulthumanhepatocytesobtainedfromresectedliverbiopsies.Cryobiolo gy,2002;44:103-113.20.RiallandL,GuyomardC,ScotteM,etal.Viabilityanddrugmetabolismca pacityofal ginate 2entrappedhe patocytesaftercr yop 2reservation.CellBiolToxicol,2000;16:105-116.21.BaccaraniU,DoniniA,SannaA,etal.Firstreportofcr yopreser 2vaedhumanhe patocytesbasedbioartificialliversuccessfullyusedasabrid getolivertrans plantation.AmJTrans plant,2004;4:285-289.22.SerraltaA,DonatoMT,OrbisF,etal.Functionalityofculturedhumanhe patocytesfromelectivesam plecadaveric graftsandhe pate 2ctomies.Toxicolo gyInVitro,2003;17:769-774.23.LiGC,LiuYF,LiangJ.IsolationandprotectiveeffectinUWso2lutionofhumanhe patocytesdurin gcoldstora ge.IntCon grSer,2003;1255:217-218.24.DininiA,BaccaraniU,PiccoloG,etal.Hepatocyteisolationusin ghumanliversdiscardedfromtrans plantation:anal ysisofcellyield andfunction.TransplantProc,2001;33:654-655.25.Schulze 2BergkamenH,UntergasserA,DaxA,etal.Primar yhu 2manhe patocytes-avaluabletoolforinvesti gationofa poptosisandhepatitisBvirusinfection.JHepatol,2003;38:736-744.(收稿日期:2004-11-08)・综述・NO 在肝移植病人体内发挥的病理生理效应葛彦虎 王卓强 摘要 一氧化氮(NO )分子由酶P450家族的NO 合酶(NOS )产生。
