下载文档原格式
流式细胞术中免疫荧光染色的质量控制摘要】流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等基础医学和临床医学的研究中，并提供了成熟的临床常规检测项目。
流式细胞术广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。
【关键词】流式细胞术；免疫荧光染色；质量控制【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）15-0026-02流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。
流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（IQc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。
现对免疫荧光染色的质量控制方法进行分析如下。
1.单克隆抗体和荧光素流式细胞术免疫荧光染色分析所用的荧光探针来源于两方面：一是荧光素标记的单克隆抗体或探针，二是单纯的荧光素。
1.1 单克隆抗体的选择用于流式细胞术测定的单克隆抗体可分为两类，即直标抗体和纯抗体，前者指单克隆抗体与荧光素已按比例连接，不需要二次染色即可直接用于流式细胞仪测定，这类抗体产生的非特异性结合较少，适于临床常规检测[1]。
纯抗体是指抗体本身不连接有荧光素，需要在标本制备过程中对抗体进行荧光素标记，又称间接染色，间接染色容易产生较多的非特异性荧光信号，可用于研究，但不建议临床常规使用，除非抗体是明确标志的体外诊断（IVD）试剂或分析特异性（ASR）试剂。
1.2 抗体组合的原则有些情况下，一种荧光抗体的单一免疫荧光染色(单染色法)不能满足临床检测的要求，往往需要两种或以上荧光抗体组合染色进行双色或多色分析。
如在进行T4或T8淋巴细胞亚群分析时，不能采用单一的荧光素标记的CD4或CD8抗体进行荧光染色，必须将二者与CD3抗体进行组合染色，才能准确通过CD3+CD4+CD8-和CD3+CD4-CD8+组合抗体检测到的细胞群来分析T4和T8细胞亚群。
医疗器械产品技术要求编号：流式细胞仪1.产品型号/规格及划分说明1.1产品型号/规格WC+502。
1.2结构组成主要包括光学模块、液流模块、信号处理和控制模块、机械和运动模块、客户端软件。
1.3适用范围用于人淋巴细胞亚群的鉴定和计数。
2.性能指标2.1正常工作条件2.1.1环境温度：15℃-32℃。
2.1.2相对湿度：15%-85%。
2.1.3电源电压：交流100V-240V~，50Hz/60Hz。
2.1.5海拔高度：≤3000米。
2.1.6防止阳光直射，避免热源。
2.2荧光检出限荧光检出限应符合下表3的要求。
表1荧光检出限的技术要求通道要求适用机型FITC≤80MESF EasyCell103L0、EasyCell104L0、EasyCell104L1、EasyCell204L1、EasyCell204L0、EasyCel206L1、EasyCell206L0PE≤40MESF EasyCell103L0、EasyCell104L0、EasyCell104L1、EasyCell204L1、EasyCell204L0、EasyCell206L1、EasyCell206L0APC≤40MESF EasyCell204L1、EasyCell204L0、EasyCell206L1、EasyCell206L0FITC：Fluoresceinisothiocyanate-异硫氰酸荧光素；PE：R-phycoerythrin-藻红蛋白；APC：allophycocyanin-别藻青蛋白。
2.3荧光线性荧光强度线性相关系数（r）应不低于0.98。
2.4前向角散射光检出限前向角散射光检出限应不大于0.5μm。
2.5侧向角散射光检出限侧向角散射光检出限应不大于0.2μm。
2.6最大检测粒径最大检测粒径应不小于50.0μm。
2.7仪器分辨率流式细胞仪前向角散射光和荧光信号的荧光通道全峰宽应符合下表（表4）要求。
表2仪器分辨率的技术要求通道要求（CV）适用机型FSC≤2.0%EasyCell103L0、EasyCell104L0、EasyCell104L1、EasyCell204L1、EasyCell204L0、EasyCell206L1、EasyCell206L0 FITC≤2.0%EasyCell103L0、EasyCell104L0、EasyCell104L1、EasyCell204L1、EasyCell204L0、EasyCell206L1、EasyCell206L0 PE≤2.0%EasyCell103L0、EasyCell104L0、EasyCell104L1、EasyCell204L1、EasyCell204L0、EasyCell206L1、EasyCell206L0 PerCP≤2.0%EasyCell103L0、EasyCell104L0、EasyCell104L1、EasyCell204L1、EasyCell204L0、EasyCell206L1、EasyCell206L0 APC≤3.0%EasyCell204L1、EasyCell204L0、EasyCell206L1、EasyCell206L0PE-Cy7≤4.0%EasyCell104L0、EasyCell104L1、EasyCell206L0、EasyCell206L1APC-Cy7≤4.0%EasyCell206L0、EasyCell206L1FITC：Fluoresceinisothiocyanate-异硫氰酸荧光素；PE：R-phycoerythrin-藻红蛋白；PerCP：PeridininchlorophyIiprotein-多甲藻叶绿素蛋白；APC：allophycocyanin-别藻青蛋白；PE-Cy7：PE与Cy7（一种花菁类染料）的偶联物；APC-Cy7：APC与Cy7的偶联物。
光谱流式质控
光谱流式质控是一种用于评估流式细胞术实验数据质量的方法。
光谱流式细胞术是一种基于激光技术的高速、高分辨率地分析细胞数量和表型的技术。
在光谱流式细胞术实验中，质控至关重要，因为它可以帮助研究人员确保实验数据的准确性和可重复性。
光谱流式质控的主要目的是：
1.检测仪器性能：检查仪器在实验过程中的稳定性、精度和分辨率。
这有助于确保实验结果的可靠性和准确性。
2.优化实验条件：通过监测实验过程中各项参数的变化，及时调整仪器设置和实验条件，以获得更好的实验效果。
3.评估样本质量：通过对样本进行质控分析，评估样本的可靠性和适用性，从而确保实验结果的准确性。
4.检测实验操作误差：检查实验操作过程中可能出现的误差，以确保实验的重复性和可靠性。
光谱流式质控的具体步骤如下：
1.准备质控样本：选择具有已知特征的质控细胞，如荧光标记的细胞系或特定抗原表达的细胞。
2.进行实验：按照常规的光谱流式细胞术实验流程，对质控样本进行检测。
3.数据采集：在实验过程中，实时采集光谱流式细胞术的数据。
4.数据分析：对采集到的数据进行预处理和分析，评估实验结果的质量。
5.设定质控标准：根据实验结果，设定合适的质控标准，以判断实验数据的可靠性。
6. 评估实验结果：将实验数据与质控标准进行比较，评估实验结果的质量和可靠性。
7.优化实验条件：根据质控结果，及时调整实验条件，以提高实验数据的质量。
通过实施光谱流式质控，研究人员可以确保实验数据的准确性和可重复性，从而为后续的生物分析和临床应用提供可靠的依据。
在实际应用中，光谱流式质控方法可以根据实验需求和仪器特性进行调整和优化。
临床流式细胞学检验技术临床流式细胞学检验技术是一种高精度、高灵敏度的检验技术，广泛应用于临床诊断、治疗和研究领域。
它通过对细胞表面标志物的检测，可以快速、准确地识别和分类不同类型的细胞，从而为临床医生提供重要的诊断和治疗指导。
临床流式细胞学检验技术的原理是利用流式细胞仪对细胞进行检测和分析。
流式细胞仪是一种高科技仪器，它可以将单个细胞通过微小的管道引入仪器中，并对细胞进行多参数的检测和分析。
流式细胞仪可以同时检测多种细胞表面标志物，如CD4、CD8、CD19等，从而可以快速、准确地识别和分类不同类型的细胞。
临床流式细胞学检验技术在临床诊断和治疗中有着广泛的应用。
例如，在肿瘤诊断中，临床流式细胞学检验技术可以帮助医生确定肿瘤的类型和分级，从而为患者提供更加精准的治疗方案。
在免疫系统疾病的诊断中，临床流式细胞学检验技术可以帮助医生确定免疫系统的异常情况，从而为患者提供更加有效的治疗方案。
此外，临床流式细胞学检验技术还可以用于器官移植后的免疫监测、感染病原体的检测等方面。
临床流式细胞学检验技术的优点在于其高精度、高灵敏度和高通量。
它可以同时检测多种细胞表面标志物，从而可以快速、准确地识别和分类不同类型的细胞。
此外，临床流式细胞学检验技术还可以进行多参数分析，从而可以更加全面地了解细胞的状态和功能。
这些优点使得临床流式细胞学检验技术在临床诊断、治疗和研究领域得到了广泛的应用。
总之，临床流式细胞学检验技术是一种高精度、高灵敏度的检验技术，广泛应用于临床诊断、治疗和研究领域。
它可以快速、准确地识别和分类不同类型的细胞，为临床医生提供重要的诊断和治疗指导。
随着技术的不断发展和完善，相信临床流式细胞学检验技术将会在未来发挥更加重要的作用。
流式细胞术pdf 流式细胞术pdf
一、什么是流式细胞术pdf 流式细胞术（Flow Cytometry）是一种新型的细胞分析技术，结合了光学、生物和计算机科学的多学科交叉。而PDF（Portable Document Format）则是一种便于文档传输和共享的电子文件格式。结合这两者，流式细胞术PDF成为了一种方便快捷的细胞分析结果呈现方式。
二、流式细胞术的原理 流式细胞术通过将单个细胞或颗粒悬浮在流式细胞仪中，利用流动的液体形成的流流经单个细胞流（单细胞流式细胞术）或颗粒（粒子流式细胞术），以此进行快速准确的细胞分析。流式细胞仪通过触发荧光信号的激发和发射来识别不同类型的细胞，并将分析结果输出为数据文件。
三、流式细胞术中的PDF应用 在流式细胞术的实验过程中，通过激发荧光标记的抗体来标记目标细胞，流式细胞仪会记录下每个细胞的不同荧光信号。而这些信号可以转化为数据文件，并以PDF的形式导出。这样一来，研究者可以通过浏览器、手机或平板电脑，随时随地查看细胞分析结果。 四、流式细胞术PDF的优势 1. 方便共享和传输：流式细胞术PDF文件可以方便地通过电子邮件、云端存储等方式进行共享和传输，节省了纸质文档的打印和传递成本。
2. 数据保密性：使用PDF格式可以对细胞分析结果进行密码保护，确保数据的安全性和隐私性。
3. 格式一致性：流式细胞术PDF文件在不同平台和设备上的显示效果基本一致，保证了信息的准确传递和呈现。
4. 检索与管理：通过对流式细胞术PDF文件进行关键词标注和文档管理，可以方便地检索和查询特定的细胞分析结果。
五、流式细胞术PDF在科研中的应用 1. 学术交流：科研人员可以将细胞分析结果转化为PDF文件，以便于与其他领域的专家进行学术交流和合作。
2. 数据备份与共享：PDF文件可以作为细胞分析结果的备份文件，方便进行数据共享、复现和对比分析。
3. 发表论文：流式细胞术PDF文件可作为科研论文的附加资料，提供扩展性的数据支持。 4. 教育与培训：学生和研究人员可以通过阅读流式细胞术PDF文件，了解细胞分析的原理和结果呈现方式，提高实验操作的准确性。
流式细胞仪检测技术与质量控制
流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。
该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。
本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。
当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法
1.1 标本收集
收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。
2 检测方法
2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。
由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。
2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。
3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。
本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。
目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面（如传染病指标等）的检测和研究。
4 讨论
流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（1Qc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。
标本采集和制备，用于流式细胞分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液及组织等，每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。
原则上标本应在采集后立刻进行处理和荧光染色，尤其对检测细胞活性的标本，需要在采集后1小时内染色测定。
在某些特殊情况下不能及时进行标本制备和检测而需要保存时，EDTA抗凝的标本在室温下可保存12～24小时，肝素抗凝通常在室温下可保存至48～72小时，枸橼酸抗凝在室温下可保存至72小时，对于只作胞内染色的样本，根据待分析细胞的抗原特性和染色方式，可采用70%冷乙醇或1%多聚甲醛等固定细胞后保存数周。
流式细胞仪的校准通常包括液路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性等[2]。
仪器校准品主要成分为聚苯乙烯，它被制成各种大小或同时拥有定量免疫球蛋白结合位点的荧光微球，这种制成固定荧光强度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成为流式细胞仪质控中的一种常用的标准品。
精密度及其校准微球精密度是通过对标准荧光微球检测其散射光和荧光的分布范围来描述的，通常以变异系数CV%来说明，CV%小于5可以满足大多数实验的要求。
但细胞周期和倍体分析对仪器的精密度要求很高的，均质性细胞间的变异必须小于2%。
灵敏度及其校准微球流式细胞仪的灵敏度可有多种表达方式，目前使用最为广泛的方式是可溶性荧光染料等价分子数（MESF）法。
该方法所用试剂盒由一系列标记有MESF值的微球组成（包括未标记荧光的空白微球），表明该微球所标记荧光物质的荧光强度等同于溶液中荧光染料的分子数，根据微球检测结果的平均荧光强度进行线性回归分析，可得到流式细胞仪灵敏度的回归曲线，回归曲线与Y轴的交点即为该机的灵敏度，或叫做最低检测限度[3]。
准确度及其校准流式细胞仪的准确度同精密度和灵敏度相比不很重要，但随着定量流式细胞技术的发展和荧光定量分析在实际工作中的需求越来越大，流式细胞仪准确度的评价和质控品也开始受到重视，在样品中加入内标或某些生物活细胞，如鸡或鱼的红细胞，可对仪器准确度进行有效监测。
当使用两种或以上的荧光素进行分析时，激光激发下的相邻或相近荧光素发出的荧光会产生交叉重叠，从而干扰检测结果，通过调整荧光补偿，可以保证每个检测器检测到恰当的单一荧光信号，即保证了结果的可靠性。
荧光补偿是流式细胞术多色分析前必须进行的仪器校准，通常采用每种荧光素或相应的标记抗体对抗原表达量适中的细胞进行单染色，来进行仪器补偿调整，也可以通过商品化荧光补偿试剂进行。
当使用各种标准微球对仪器进行校正时，需要将微球测定结果绘制成质控图，Levey-Jennings质控图是目前在临床检验质量控制中使用较多的方法，根据Levey-Jennings质控图的评价要点来观察质控结果是否超过控制限以决定失控与否。
室间质量评价主要是控制实验室工作的不准确度，自2000年以来，我国由卫生部临床检验中心开始组织开展临床流式细胞术室间质评工作，现已开展的项目包括T细胞亚群分析和CD34绝对计数。
【。
