高效液相色谱法测定油脂类保健食品中虾青素
刘泰然;赵海燕;罗仁才
【摘要】提出了高效液相色谱法测定油脂类保健食品中虾青素含量的方法.样品经乙腈提取,提取液浓缩后,用Dikma C18色谱柱(4.6 mm×250mm,5μm)分离,用不
同配比的乙腈和水的混合溶液为流动相梯度洗脱,用紫外检测器于波长479 nm处
检测.虾青素的质量浓度在30.0～300mg·L-1范围内与其峰面积呈线性关系,检出
限(3S/N)为0.07 mg·L-1.在空白样品中进行加标回收试验,方法的回收率在
90.0％～96.7％之间；方法的相对标准偏差(n=6)为2.8％.
【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2013(049)005
【总页数】3页(P553-555)
【关键词】高效液相色谱法;虾青素;油脂类保健食品
【作者】刘泰然;赵海燕;罗仁才
【作者单位】北京市疾病预防控制中心,北京100013;北京市疾病预防控制中心,北
京100013;北京市疾病预防控制中心,北京100013
【正文语种】中文
【中图分类】O657.63
虾青素（3，3′－二羟基－4，4′－二酮基－β，β′－胡萝卜素）又名虾黄素，广泛
存在于虾、蟹、某些藻类及真菌中的一种类胡萝卜素。
纯的虾青素为褐红棕色粉末，
熔点224 ℃，不溶于水，具脂溶性，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂［1］。
近年来大量的研究表明虾青素具有许多重要的生物学功能，如增强免疫、抗癌等作用，并且在消除时差方面的效果要优于褪黑激素［2］。
虾青素还是一种强大的抗氧化剂，抗氧化效果是普通维生素E 的550倍［3］，动物试验表明，虾青素可以清除二氧化氮、硫化物、二硫化物，有效地抑制自由基引发的脂质过氧化，故而在食品添加剂、水产养殖、化妆品、保健品和医药工业方面有广阔的应用前景，因此建立快速、简便、准确的测定虾青素的方法十分必要。
目前报道的虾青素测定方法有紫外分光光度法［4－5］、高效液相色谱法［1，6］，但这些方法都适用于藻类样品，未见有关于测定油脂类保健食品的文献报道。
本工作采用乙腈提取，高效液相色谱分离，用紫外检测方法测定油脂类保健食品中虾青素含量，适用于油脂类保健食品中虾青素的测定。
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
Waters 2695高效液相色谱仪，配Waters－2996二极管阵列检测器；BS 323分析天平。
提取剂：0.5g·L－1，取2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚（BHT，分析纯）0.25g
溶解于500mL乙腈中。
虾青素标准溶液：400mg·L－1，称取虾青素标准品（纯度98%）0.010 0g于棕
色容量瓶，用乙腈溶解后定容至25mL，置于－18 ℃避光保存（可使用3d）。
使用时用乙腈稀释配成所需质量浓度（现用现配）。
正己烷、三氯甲烷、乙醇和乙腈为色谱纯；无水硫酸钠为分析纯，650 ℃灼烧4h，贮于干燥器内冷却后备用。
1.2 色谱条件
Dikma C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱温35 ℃；流动相A 为乙腈，
B 为水，梯度洗脱程序：0min，A 为95%；10min，A 为100%；12min，A为95%。
进样量10μL，检测波长479nm。
1.3 试验方法
样品量视虾青素含量而定，其含量不大于500μg时，称取试样约2g于50mL离
心管中，加入提取剂0.5g·L－1 BHT 乙腈溶液30mL和无水硫酸钠10g，涡旋混
合1 min，在35 ℃以下水浴超声提取10min，以3 000r·min－1转速离心5min，上清液移入预置有20mL正己烷的125mL分液漏斗中，振摇3min，静置分层，
收集下层乙腈相，正己烷相留在分液漏斗中待试样后续脱脂使用。
按上述步骤对离心管中的残留物用提取剂0.5g·L－1 BHT乙腈溶液20mL重复提取两次，所得提
取液用上述正己烷相依次脱脂，合并三次脱脂后所收集的乙腈相，于40 ℃以下旋转蒸发浓缩至近干，用乙腈溶解并定容至5mL，经0.22μm 滤膜过滤后，在色谱
条件下进行测定（操作过程应避强光且连续进行）。
2 结果与讨论
2.1 提取溶剂的选取
溶剂的选择对于提取虾青素是非常重要的。
虾青素具有疏水亲脂性，所以提取虾青素时不仅要考虑它在提取溶剂中的溶解度，还要考虑到提取溶剂的极性。
虾青素属于萜类化合物，易溶于氯仿、丙酮和乙腈等有机溶剂。
虽然虾青素易溶于极性弱的有机溶剂，但由于氯仿、丙酮亲水性很差，因此提取率不高。
尽管甲醇、乙腈的极性较高，虾青素在二者中的溶解度较差，但由于二者是亲水性溶剂易于渗透进入，因此提取率反而比弱极性溶剂高。
在实际工作中考虑到乙腈的毒副作用小且可以回收利用，又考虑到后续分离的连续性，故试验选用乙腈为提取溶剂。
2.2 流动相的选择
分别以甲醇、甲醇－水、乙腈、乙腈－水作为流动相进行对比试验。
结果表明：甲醇及甲醇－水混合体系作流动相时洗脱待测物能力较差，且整体分析时间较长，待
测物色谱峰拖尾严重、峰宽较宽；选用乙腈－水作为流动相，同时逐步增加乙腈的比例以逐渐增加流动相的洗脱强度，结果显示：随着乙腈在二元体系中体积分数的增加，虾青素的保留时间逐渐缩短，峰展宽及不对称现象均得到改善。
当乙腈比例增至100%时，虾青素在11 min 内达到基线分离，峰形尖锐，对称性好，基线波动不明显，被测组分的分离度高且相对保留时间适中（出峰时间约为9min）。
因此，试验采用乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，标准品图谱及样品图谱见图1。
图1 色谱图Fig.1 Chromatograms
2.3 检测波长
对虾青素标准溶液进行紫外吸收光谱扫描，扫描光谱见图2。
由图2可知：最大吸收峰位于波长479nm 处，故试验选择479nm 为测定波长。
图2 吸收光谱图Fig.2 Absorption spectrum
2.4 提取时间的选择
考察了不同提取时间对测定结果的影响，结果表明：超声10min时，虾青素测定
结果最高；继续增加提取时间，其测定结果会下降。
推断原因是提取时间增长，部分虾青素被氧化破坏；此外在试验过程中提取液长时间暴露也会造成虾青素含量降低。
2.5 标准溶液、样品溶液的稳定性
虾青素是由四个异戊二烯单位以共轭双键形式连接的六元环结构，在其两端还有二个异戊二烯单位。
由于结构中含有长共轭不饱和双键链，因此虾青素在酸性、氧化物存在、高温及紫外光条件下均不稳定，易氧化降解。
对虾青素标准溶液、样品提取液的稳定性进行了研究。
取虾青素标准溶液、样品溶液各两份，一份暴露于自然条件下，另一份充氮密封并避光保存在－18 ℃冰箱中，暴露于自然条件下的标准溶液及样品溶液每隔1h测一次，放置在－18 ℃保存的
标准溶液、样品溶液每天测一次。
试验结果表明：暴露在自然条件下的虾青素标准
溶液及样品溶液2h后虾青素含量开始明显减少；在－18 ℃条件下保存的虾青素
标准溶液及样品溶液中虾青素含量在第四天开始降低；因此标准溶液及样品溶液的最长保存时间为3d，并需低温、避光保存，同时还必须加入抗氧化剂2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚防止氧化。
2.6 标准曲线和检出限
按试验方法对虾青素标准溶液系列进行测定，以质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，虾青素的质量浓度在30.0～300 mg·L－1范围内与其峰
面积呈线性关系，线性回归方程为y＝9 600 x－16 400，相关系数为0.999 9。
方法的检出限（3S／N）为0.07 mg·L－1，测定下限（10S／N）为0.21mg·L－1。
2.7 回收试验
称取同类型不含虾青素的空白样品2g，按试验方法进行处理，加入3个浓度水平的标准溶液进行加标回收试验，平行测定6次，结果见表1。
表1 回收试验结果n＝6Tab.1 Results of test for recovery?
2.8 精密度试验
按试验方法对磷虾油平行测定6次，测定结果分别为0.28，0.27，0.27，0.26，0.26，0.27 mg·g－1，测定值的相对标准偏差为2.8%。
2.9 样品分析
由于虾青素具有超强的易氧化性，在实际的保健食品生产中为避免出现氧化只能以软胶囊形式出现。
在该剂型中，必须使用食用油作为填充剂。
因此样品提取后使用正己烷除去油脂干扰。
在实际工作中测定了3种不同样品，结果分别为0.28，
1.12，0.79mg·g－1。
本工作建立了油脂类保健食品中虾青素的高效液相色谱检测的方法。
方法操作简便、选择性高、准确度、精密度等符合要求，适用于油脂类保健食品中虾青素的测定。
参考文献：
［1］肖冬光，李贤宇，郝玥.高效液相色谱法检测红发夫酵母胞内虾青素［J］.天津科技大学学报，2005，20（1）：9－12.
［2］耿华田.虾青素简介［J］.化学教育，2007（3）：5－7.
［3］柴建新，万茵，付桂明，等.雨生红球藻中总虾青素提取工艺优化［J］.中国食品添加剂，2011（3）：107－111.
［4］欧阳琴，陈兴才，黄亚治.雨生红球藻虾青素提取工艺条件研究［J］.福建轻纺，2003（12）：9－13.
［5］陈晓飞，严小军.红球藻虾青素含量测定方法的探讨［J］.宁波大学学报：理工版，2007，20（4）：441－445.
［6］张玉珍，刘喆.高效液相测定虾青素的含量［J］.中国食品添加剂，2007（4）：151－152.。
