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虾青素分析测定方法的研究【摘要】选择分光光度法及高效液相色谱法对测定虾青素的分析条件进行研究，从而得出最佳的测定条件。
用分光光度法和高效液相色谱法测定虾青素，标准曲线的回归方程的r2都超过了0.99。
用分光光度法测定虾青素，回收率范围为99.3-101%，相对标准偏差rsd值为0.78-1.3%；用液相色谱法测定虾青素，回收率范围为100-102% ，相对标准偏差rsd为0.62-1.4%。
这些值都在定量分析所要求的阈值范围内，可以用于定量分析。
【关键词】分光光度法；高效液相色谱法；虾青素abstract： choice two based on the spectrophotometry and high performance liquid chromatography (hplc) were developed for determination the astaxanthin. and the optimum conditions was investigated in detail. the total amount of astaxanthin was measured by spectrophotometry, the recoveries were in the range of 99.3-101%, and rsd were in the range of 0.78 %-1.3 %. also the astaxanthin was determined by hplc, and the recoveries were in the range of 100% -102%, rsd were in the range of 0.62%-1.4%. all these values were within the range of permissive threshold value on quantitative analysis, which showed that it’s feasible for measuring the content of astaxanthin by these two methods.key words: spectrophotometry；hplc；astaxanthin从动植物及菌类中提取虾青素目前还处于实验研究的基础阶段，要实现产业化生产虾青素，还必须对其提取工艺进行广泛深入的研究。
虾青素化学分析方法富士化学测试方法：虾青素含量的高效液相色谱分析包括两个重要步骤：海藻粉中的虾青素的提取及之后的脱脂过程。
这两个过程都会影响色谱分析结果，而分光光度计法则只要求虾青素的提取过程完全彻底即可。
因为微藻体内的虾青素在化学结构上有两个羟基（3和3’位置上），因此其往往与脂肪酸结合形成酯类，故虾青素存在形式主要有三种：二酯、单酯和自由体，不同藻系三种形式的含量不同，一般二酯成分最高70-80%左右，单酯10%左右，而自由体仅占5%左右。
相比较二酯和单酯形式自由体的极性更强。
采用分光光度法测定了类胡萝卜素在474nm波长处的吸光度，并计算了类胡萝卜素的含量量中包含其他一些类胡萝卜素成分，如β-类胡萝卜素、角黄素和叶黄素等，因此不甚准确；而在hplc分析中，很难对酯化虾青素成分进行精确定量，因此常常采用酶水解的方法将二酯和单酯结构的虾青素水解为自由体，然后进行色谱分析。
一般化学脱脂反应如皂化反应不能用于虾青素脱脂，因为皂化反应条件易造成虾青素的氧化和降解，使得测量结果偏低。
在hplc分析中，若酶水解不完全，在色谱图中11min左右的反式结构的虾青素色谱峰会相对较小，且在保留时间约20-30min处会看到大量酯化成分的色谱峰，可作为判断样品是否完全水解的依据。
试剂和设备：试剂：0.05 mtris HCl缓冲液（pH7.0）；胆固醇酯酶；反式-bata-apo-8'-胡萝卜素虾青素；1%（v/v）磷酸；丙酮；正己烷，石油醚，甲醇；甲基异丁基谜；十水硫酸钠；无水硫酸钠。
设备：10ml离心管；30ml、100ml、200ml、500ml容量瓶；0.45微米注射器过滤器；水浴锅；分析天平；离心机；超声波破碎仪；分光光度计；hplc；色谱柱。
（具体试剂及设备型号见文献）实验步骤：2.0水解酶的配置：准确称量一定量的胆固醇酯酶，并将其溶解在50mmtris HCl（pH7.0）中，使最终酯酶浓度为4单位/毫升。
DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.025283引用格式:孔凡华,徐佳佳,郭倩,等.高效液相色谱法测定虾青素油中虾青素的含量[J].食品与发酵工业,2021,47(6):214-220.KONG Fanhua,XU Jiajia,GUO Qian,et al.Determination of astaxanthin in astaxanthin oil by high performance liquid chromatography[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(6):214-220.高效液相色谱法测定虾青素油中虾青素的含量孔凡华2,徐佳佳2,郭倩2,白沙沙2,李东2,方从容1,邱楠楠1∗,崔亚娟2∗1(国家食品安全风险评估中心,国家卫生健康委员会食品安全风险评估重点实验室,北京,100021)2(北京市营养源研究所,北京,100069)摘㊀要㊀该研究建立了高效液相色谱法测定虾青素油中虾青素含量的分析方法㊂利用单因素实验,对虾青素油中虾青素的提取试剂㊁酶解时间进行选择,确定最佳前处理条件为37ħ恒温水浴振荡酶解60min ,石油醚提取㊂色谱条件:YMC TM C 30色谱柱(250mm ˑ4.6mm ,5μm ),柱温30ħ,流动相为甲醇-甲基叔丁基醚梯度洗脱,流速1mL /min ,检测波长472nm ㊂结果表明,全反式虾青素在0.10~4.00μg /mL 范围内与峰面积有良好线性关系,精密度的相对标准偏差(relative standard deviation ,RSD )为1.36%,表明精密度高,平均回收率为93.58%,回收率的RSD 为2.84%,表明添加回收率高,相对标准偏差小,实验建立方法测得虾青素油中虾青素的含量为92.9%,是碱性皂化测得结果的2.11倍,所建立的方法可以准确定量虾青素油中虾青素的含量㊂关键词㊀高效液相色谱法;虾青素油;虾青素;全反式虾青素;9-顺-虾青素;13-顺-虾青素第一作者:硕士,工程师(邱楠楠副研究员和崔亚娟研究员为通讯作者,E-mail:qiunannan@;cuiyj66@)㊀㊀基金项目:十三五国家重点研发计划(2016YFD0400600)收稿日期:2020-08-05;改回日期:2020-10-05㊀㊀虾青素为萜烯类不饱和化合物,化学名称是3,3ᶄ-二羟基-4,4ᶄ-二酮基-β,βᶄ-胡萝卜素,是一种具有超级抗氧化活性的类胡萝卜素[1],其抗氧化性能是维生素E㊁维生素C㊁β-胡萝卜素㊁叶黄素和玉米黄质的几十倍甚至几百倍[2-4]㊂雨生红球藻㊁红法夫酵母㊁南极磷虾㊁一些浮游生物㊁藻类㊁螃蟹外壳㊁河螯虾外壳㊁牡蛎㊁三文鱼皮㊁鲑鱼等动物中含有虾青素㊂虾青素具有多种生物功能,它能终止生物系统中炎症的发生[5]㊁对抗自由基损伤以维持免疫系统防御[6]㊁降低心脏病发病的风险[7]㊁减轻神经退行性疾病带来的影响[8]㊁抑制肿瘤发生和生长[9]及对抗紫外线引起的光氧化损伤[10]等㊂虾青素具有较长的共轭双键链,结构复杂,化学性质不稳定,存在多种同分异构体,虾青素及其异构体的定性定量分析是结构解析和功能研究的基础㊂天然虾青素大多与脂肪酸结合,以酯化的形态存在,但由于缺乏虾青素酯标准品,且人工合成虾青素酯困难,限制了虾青素酯的定性定量研究㊂虾青素酯脱去脂肪酸链后可以形成游离的虾青素,包括全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素等,使虾青素的定量研究变得容易操作[11]㊂目前,虾青素脱脂的主要方法是碱性皂化和酶解方法,碱性皂化脱脂会产生副产物并引起虾青素降解[12],食品化学法典(FCC )(2012)[13]采用来自假单胞杆菌的胆固醇酯酶(EC3.1.1.13)进行虾青素酯的酶解,可以使虾青素酯水解完全㊂色谱技术的发展在虾青素的定性定量分析上起了非常重要的作用,随着紫外可见光谱㊁质谱㊁核磁共振波谱法㊁红外光谱㊁拉曼光谱和圆二色光谱的快速发展,虾青素的结构鉴定变得更为简单容易,考虑到设备的成本,样品制备的复杂程度和方法的局限性,虾青素的定量分析方法主要是分光光度法和高效液相色谱法㊂分光光度法具有快速简单㊁适用范围广㊁成本低等优点,但是只能对虾青素总量进行估算,无法对其中虾青素的存在形式进行准确的测定㊂高效液相色谱法分离效果好㊁灵敏度高㊁选择性好成为目前测定虾青素的常用方法㊂我国测定虾青素的标准方法有‘红球藻中虾青素的测定液相色谱法“(GB /T 31520 2015)[14]适用于雨生红球藻藻粉中虾青素含量的测定;‘水产品及其制品中虾青素含量的测定高效液相色谱法“(SC /T 3053 2019)[15]适用于鱼类㊁甲壳类及虾粉㊁磷虾油等制品中虾青索含量的测定;‘进出口动物源性食品中角黄素㊁虾青素的检测方法“(SN /T 2327 2009)[16]适用于黄鱼㊁鳗鱼㊁鸡肉㊁鸡蛋㊁鸭肝㊁猪肾和牛奶中角黄素㊁虾青素的测定与确证;‘植物提取物虾青素油“(T/CCCMHPIE 1.23 2016)[17]适用于以人工培养的红球藻属雨生红球藻为原料经提取精制后,得到的虾青素油中虾青素的测定㊂以上标准方法通过有机溶剂直接提取或者碱性皂化脱脂后提取虾青素,容易引起虾青素的降解[12],导致测量结果不准确或对测定结果造成干扰;标准方法多采用三相洗脱系统分离虾青素及其异构体,对液相系统要求高㊂本文参照虾青素检测的标准方法[14-17]和文献方法[13,18-23],设计单因素实验,对提取试剂㊁胆固醇酯酶酶解时间进行优化,以虾青素含量的高低作为评价指标,筛选最佳提取试剂和酶解条件;通过比较色谱柱㊁流动相等高效液相色谱条件,以全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素的分离度和峰形对称性作为评价指标,筛选最佳色谱条件,实现虾青素油中虾青素的有效提取和高效分离㊂以虾青素油为研究对象,进行方法学验证,考察方法的科学性㊁准确性和适用性,并比较实验建立的酶解方法与文献中的碱性皂化方法[18]对虾青素油中虾青素的提取效率,以期建立虾青素油中虾青素的精准分析检测技术㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料与试剂超临界二氧化碳萃取的雨生红球藻虾青素油,市购;全反式虾青素对照品(纯度96.9%),Dr.Ehren-storfer GmbH;9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素对照品(纯度ȡ95.0%),Sigma公司;胆固醇酯酶16.3U/mg,月旭科技股份有限公司㊂甲醇㊁乙腈㊁甲基叔丁基醚㊁二氯甲烷㊁乙酸乙酯(均为色谱纯),美国Fisher公司;无水乙醇㊁无水硫酸钠㊁氢氧化钠㊁浓盐酸(分析纯),北京化工厂;石油醚(分析纯),福晨(天津)化学试剂有限公司;丙酮(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)(分析纯),浙江联硕生物科技有限公司㊂1.2㊀仪器与设备BS224S分析天平,德国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;METTLER TOLEDO pH计,梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;QL-901斡旋振荡器,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;ZHWY-110X30往复式恒温水浴摇床,上海智诚分析仪器制造有限公司;KQ-500DE型数控超声波清洗器,昆山市超市仪器有限公司;HITACHI CF16RXII高速冷冻离心机,日本日立科技有限公司;安捷伦1260高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器和ChemStation for LC sys-tems色谱工作站,美国Agilent公司;YMC TM C30色谱柱,5μm,250mmˑ4.6mm(内径)㊂1.3㊀方法1.3.1㊀溶液的配制㊀㊀(1)0.021mol/L氢氧化钠-甲醇溶液:称取0.084g 氢氧化钠,加入80mL甲醇溶解并定容到100mL㊂㊀㊀(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7):准确称取3.0285g Tris,加入450mL去离子水溶解后,用0.5mol/L的盐酸调节pH至7.0,然后用去离子水定容至500mL㊂㊀㊀(3)胆固醇酯酶溶液:称取6.2mg胆固醇酯酶于25mL容量瓶中,用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液定容至刻度,胆固醇酯酶溶液浓度约为4U/mL,现用现配㊂㊀㊀(4)全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素标准储备液:分别准确称取全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素标准品1mg,分别置于25mL棕色容量瓶中,加丙酮溶解并定容至刻度,摇匀,得到浓度为40μg/mL标准储备液,现用现配㊂㊀㊀(5)全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素混合标准工作溶液:准确移取全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素标准储备溶液,用丙酮稀释成各浓度均为0.80μg/mL的标准工作溶液,用于定性,现用现配㊂㊀㊀(6)全反式虾青素标准工作溶液:准确移取全反式虾青素标准储备溶液,用丙酮稀释成浓度分别为0.10㊁0.20㊁0.40㊁0.80㊁1.60㊁4.00μg/mL的标准工作溶液,现用现配㊂1.3.2㊀色谱条件的选择孙伟红等[19]研究表明,C30色谱柱对虾青素异构体的分离效果和响应值优于C18色谱柱,更有利于定量结果的分析,所以本实验选择YMC TM C30色谱柱㊂参考标准方法和文献方法,选择甲基叔丁基醚-乙腈(体积比95ʒ5)[20]㊁甲醇-甲基叔丁基醚-水(体积比83ʒ15ʒ2)[21]㊁水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(体积比4.5ʒ28ʒ22ʒ45.5)[22]㊁水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(5ʒ85ʒ5ʒ5)[23]和甲醇-甲基叔丁基醚[24]等流动相体系洗脱,以全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素的分离度作为评价指标,优化全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素分离的色谱条件㊂1.3.3㊀提取溶剂的选择虾青素油用丙酮稀释500倍作为实验用虾青素油样品㊂实验参照食品化学法典FCC th(2012)[23]的方法,并加以改进㊂称取10mg虾青素油样品于15mL离心管中,样品称取15份,分别加入2mL Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH=7)和1mL胆固醇酯酶(4U/mL)溶液振荡均匀后,在37ħ恒温水浴振荡器内振荡酶解60min,取出立即冷却至室温㊂向每份酶解液中分别加入2.0mL石油醚㊁二氯甲烷-甲醇(体积比1ʒ3)㊁丙酮㊁乙腈㊁甲醇-乙酸乙酯-石油醚(体积比1ʒ1ʒ1),每种提取溶剂做3个平行,每份样品均加入1g无水硫酸钠后在涡旋振荡器上涡旋提取2min,静置分层后,分别将上层溶液转移至10mL容量瓶中,重复提取2次,合并提取液于容量瓶中,氮气吹干后,用甲醇定容至刻度,溶液过0.45μm有机系滤膜后,待测定㊂1.3.4㊀酶解时间的选择称取10mg虾青素油样品于15mL离心管中,分别加入2mL Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH=7)和1.0mL胆固醇酯酶(4U/mL)溶液振荡均匀后,在37ħ恒温水浴振荡器内分别振荡酶解15㊁30㊁45㊁60㊁75㊁90㊁120min,取出立即冷却至室温,用石油醚提取,其他操作步骤同1.3.3㊂1.3.5㊀方法验证按照GB/T27404 2008‘实验室质量控制规范食品理化检测“[25]方法学要求,建立校准曲线及校准曲线的工作范围;逐步稀释样品上机测定,R(S/N) =3时的测定浓度作为检出限,R(S/N)=10时的测定浓度作为定量限;称取虾青素油样品,按照实验优化的方法,平行测定6次,计算虾青素的含量,并计算相对标准偏差,考察方法的重现性;根据虾青素油样品中虾青素的含量,按本底值的0.5倍㊁1倍㊁1.5倍3个浓度水平,进行3水平6平行加标回收实验,以回收率的高低评价方法的准确度㊂1.3.6㊀碱性皂化脱脂方法参见YUAN等[18]和苏芳[26]的方法,称取10mg 虾青素油样品于15mL离心管中,加入5mL0.021 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液,5ħ水浴中避光皂化60 min,加入2mL纯净水和2mL石油醚,在涡旋振荡器上振荡2min,静置分层后,将上层溶液转移至10mL容量瓶中,重复提取2次至石油醚层无色,合并提取液于容量瓶中,氮气吹干后,用甲醇定容至刻度,溶液过0.45μm有机系滤膜后,测定㊂1.4㊀虾青素含量的计算1.4.1㊀标准曲线的制作将各浓度全反式虾青素标准品工作溶液,9-顺式虾青素和13-顺式虾青素标准品工作溶液按实验优化的色谱条件进行液相色谱分析,根据虾青素异构体组分的保留时间定性㊂选定峰面积相近的全反式虾青素的标准工作液多点校准定量,试样测定结果以3种虾青素同分异构体的总和计,外标法定量,同时,标准工作液和样液的响应值均应在仪器检测的线性范围内㊂1.4.2㊀结果计算试样中虾青素的含量X以质量分数计,按式(1)计算㊂X=(1.3ˑA13-cis+A tras+1.1ˑA9-cis)ˑC sˑVˑfA sˑmˑ100(1)式中:X,试样中虾青素的含量,%;1.3,13顺-虾青素对全反式虾青素的校正因子;A13-cis,试样溶液中13-顺-虾青素的峰面积;A tras,试样溶液中全反式虾青素的峰面积;1.1,9-顺-虾青素对全反式虾青素的校正因子;A9-cis,试样溶液中9-顺-虾青素的峰面积;C s,标准工作液中全反式虾青素的含量,μg/mL;V,试样溶液体积,mL;A s,标准工作液中全反式虾青素的峰面积;m,试样质量,mg;f,稀释倍数㊂1.5㊀数据处理通过与仪器配套的ChemStation for LC systems工作站软件完成数据的采集与处理㊂数据的差异性分析在SPSS软件上进行,P<0.05时,说明差异水平显著㊂2㊀结果与分析2.1㊀色谱条件的选择不同流动相体系对全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素分离效果见表1㊂目前,多采用三相洗脱系统[14-15,17,19,27]或者正相洗脱系统[26]分离虾青素及其异构体,对液相系统要求较高,且普适性较差㊂本实验通过优化液相色谱条件,采用甲醇-甲基叔丁基醚两相梯度洗脱,可以实现3种虾青素异构体的有效分离,结果如图1所示,优化得到分离虾青素的色谱条件为:色谱柱:YMC TM C30色谱柱,5μm,250mmˑ4.6mm (内径)或相当者;柱温:30ħ;流动相:见表1;流速: 1.0mL/min;检测波长:472nm;进样量:20μL㊂表1㊀色谱条件的优化Table1㊀Optimization of chromatographic conditions流动相洗脱程序流速/(mL㊃min-1)柱温/ħ分离度1甲基叔丁基醚-乙腈(体积比95ʒ5)等度洗脱 1.030 1.12 2甲醇-甲基叔丁基醚-水(体积比83ʒ15ʒ2)等度洗脱 1.030 1.33 3水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(体积比4.5ʒ28ʒ25ʒ45.5)等度洗脱 1.030 1.21 4水-甲醇-二氯甲烷-乙腈(体积比5ʒ85ʒ5ʒ5)等度洗脱 1.030<00-12.0min,A相85%-70%;12.0-20.0min,A相70%-20%;5A-甲醇;B-甲基叔丁基醚20.0-22.0min,A相20%; 1.030ʎC 2.1922.0-22.1min,A相20%-85%;22.1-25.0min,A相85%;㊀㊀注:所有进样体积均为20μL,色谱柱为YMC TM C30,5μm,4.6mmˑ250mm色谱柱;检测波长是472nm(ref=off);分离度是指13-顺式虾青素和全反式虾青素的分离度(全反式虾青素和9-顺式虾青素的分离度均大于2.0)㊂图1㊀全反式虾青素㊁9-顺式虾青素㊁13-顺式虾青素标准溶液液相色谱图Fig.1㊀Chromatograms of all trans astaxanthin,9-cis-astaxanthin,13-cis-astaxanthin2.2㊀提取溶剂的选择室温条件下,虾青素在丙酮㊁二氯甲烷㊁二甲亚砜㊁乙醇及其他非极性溶剂中的溶解性较好[28]㊂本试验根据前人研究基础,选取5种不同提取溶剂,比较不同提取溶剂对虾青素油中虾青素的提取得率,结果显示,石油醚对虾青素的提取效果最佳,显著高于其他提取溶剂(P<0.05),结果见表2,虾青素油中虾青素异构体的HPLC色谱图见图2㊂表2㊀不同提取溶剂的提取结果(n=3)Table2㊀Results of different extraction solvents(n=3)提取溶剂虾青素含量/%石油醚92.9ʃ3.38二氯甲烷-甲醇(体积比1ʒ3)80.3ʃ2.53丙酮85.2ʃ1.58乙腈70.5ʃ1.99甲醇-乙酸乙酯-石油醚(体积比1ʒ1ʒ1)72.1ʃ3.012.3㊀酶解时间的选择胆固醇酯酶的酶解时间影响虾青素酯的酶解效果,酶解时间不足,会导致酶解不完全,酶解时间过长,会造成虾青素的降解,不同酶解时间提取结果见表3㊂图2㊀虾青素油脂中全反式虾青素㊁9-顺式虾青素㊁13-顺式虾青素液相色谱图Fig.2㊀Chromatograms of all trans astaxanthin,9-cis-astaxanthin, 13-cis-astaxanthin in astaxanthin oil表3㊀不同酶解时间的提取结果(n=3) Table1㊀Results of different enzymolysis time(n=3)酶解时间/min虾青素含量/%1581.9ʃ5.303086.7ʃ6.334584.4ʃ4.226092.9ʃ3.387590.6ʃ1.979091.0ʃ7.2112084.4ʃ1.54由表3知,在37ħ条件下,随着酶解时间的延长,虾青素的含量增加,60min时酶解完全,虾青素含量为92.9%,继续酶解到75min和90min,虾青素含量分别为90.6%和91.0%,与60min时没有显著性差异(P> 0.05),酶解120min,虾青素含量明显降低(P<0.05),其原因可能是温度对虾青素的降解破坏作用导致,因此酶解时间需要严格控制,以避免虾青素的损失,以4U/mL胆固醇酯酶37ħ条件下酶解60min最佳㊂2.4㊀方法验证2.4.1㊀线性关系、检出限及定量限按照1.3.3操作,在2.1色谱条件下进行HPLC分析,得到全反式虾青素为0.10~4.00μg/mL,浓度与峰面积有良好的线性关系,虾青素的检出限为0.1 mg/g,定量限为0.3mg/g㊂2.4.2㊀方法精密度实验按实验优化的前处理方法和色谱条件,平行测定6次,虾青素油中虾青素含量的相对标准偏差(rela-tive standard deviation,RSD)为1.36%,表明精密度高,适合虾青素的定量分析,结果见表4㊂表4㊀方法精密度结果(n=6)Table4㊀Results of precision(n=6)测定组分测定结果/%123456均值SD RSD/%虾青素92.893.991.690.391.491.792.0 1.25 1.36 2.4.3㊀方法准确度实验准确度为分析方法测定的平均值与真值相符的程度㊂稳定样品中加入不同水平已知量的标准物质(将标准物质的量作为真值)称加标样品;同时测定虾青素油和虾青素油加标样品;加标样品扣除样品值后与标准物质的误差即为该方法的准确度,按公式(2)计算㊂P/%=X1-X0mˑ100(2)式中:P,加入的标准物质的回收率;m,加入的标准物质的质量,μg;X1,加标试样的测定值,μg;X0,未加标试样的测定值,μg㊂采用样品加标试验进行本方法准确度验证,结果见表5㊂表5㊀加标回收率实验结果(n=6)Table5㊀Results of recovery rate of ginger(n=6)加标量/μg编号虾青素本底值/μg虾青素测定值/μg回收率/%平均回收率/%RSD/ %jb1-114.81022.30093.59jb1-214.73022.13092.458jb1-314.50021.77090.89jb1-414.44021.70090.79jb1-514.42021.65090.39jb1-614.39021.66090.91jb2-113.47027.96090.61jb2-213.15027.86091.9316jb2-312.95027.94093.6893.58 2.84 jb2-413.02028.03093.81jb2-513.08027.69091.32jb2-613.04028.08094.00jb3-114.38537.62396.83jb3-213.94437.57898.4824jb3-314.64337.48595.17jb3-414.44037.17594.73jb3-513.96237.12296.50jb3-613.72337.32698.35由表5可知,虾青素油中虾青素的回收率为90.39%~98.48%,平均回收率为93.58%,RSD为2.84%,表明方法添加回收率高,相对标准偏差小,适合虾青素含量的测定㊂2.5㊀不同脱脂方法测得虾青素的含量比较实验建立的胆固醇酯酶酶解方法㊁碱性皂化方法对虾青素油中虾青素的提取效率,结果见表6㊂表6㊀不同脱脂方法测定结果(n=3)Table6㊀Results of different degreasing methods(n=3)脱脂方法虾青素含量/%胆固醇酯酶酶解92.9ʃ3.38碱性皂化方法㊀44.1ʃ1.06由表6可知,胆固醇酯酶酶解所得虾青素含量是92.9%,显著高于苗凤萍[29]报道的72.04%和ZHAO 等[12]报道的63.2%,与苏芳[26]报道的92.95%结果相近㊂酶解所得虾青素含量是碱性皂化得率的2.11倍,这可能是因为碱不仅对脂肪酸有破坏作用,对虾青素也有很大的降解作用,而胆固醇酯酶对脂肪酸有特异性,可以减少对虾青素的降解㊂张丽瑶等[30]研究表明虾青素溶液经超声处理后,全反式异构体的浓度大幅度降低,9-顺式和13-顺式异构体浓度均有所增加,超声处理使虾青素降解为其他成分㊂对比虾青素的得率,可见,酶解法对虾青素的含量影响较小,先酶解再进行高效液相色谱分析是对含虾青素酯样品的含量及几何异构体测定的可靠方法,可以准确定量样品中虾青素的含量㊂3㊀结论本实验在前人研究的基础上,设计单因素实验,对提取试剂㊁胆固醇酯酶酶解时间进行优化,以虾青素得率高低作为评价指标,得到虾青素油中虾青素的最佳提取条件为37ħ恒温水浴振荡酶解60min,石油醚提取,该方法对虾青素油中虾青素的提取得率为92.9%,是碱性皂化得率的2.11倍㊂通过比较色谱柱㊁流动相等高效液相色谱条件,以全反式虾青素㊁9-顺-虾青素㊁13-顺-虾青素的分离度和峰形对称性作为评价指标,筛选最佳色谱条件为YMC TM C30色谱柱,甲醇-甲基叔丁基醚两相梯度洗脱,可以实现3种虾青素异构体的有效分离,相比于目前常用的三相洗脱程序和正相洗脱系统,要求的液相系统简单㊂选择虾青素油进行方法学验证,结果表明,全反式虾青素在0.10~4.00μg/mL的浓度范围内与峰面积有良好的线性关系;虾青素的检出限为0.1mg/g,定量限为0.3mg/g;按实验优化的最佳酶解方式和色谱条件,平行测定6次,虾青素油中虾青素含量的RSD为1.36%,表明精密度高;按虾青素油样品中虾青素含量的0.5倍㊁1倍㊁1.5倍3个浓度水平,进行3水平6平行加标回收实验,得到虾青素油中虾青素的回收率为90.39%~98.48%,平均回收率为93.58%, RSD为2.84%,表明添加回收率高,相对标准偏差小,实验建立的方法适合虾青素油样品中虾青素含量的测定㊂参考文献[1]㊀AL-AMIN M M,AKHTER S,HASAN A T,et al.The antioxidanteffect of astaxanthin is higher in young mice than aged:A region specif-ic study on 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虾青素试验方法警告----本产品对光敏感，在操作过程中应避光操作。
三氯化锑-三氯甲烷溶液有强腐蚀性，在操作过程中应注意避免与皮肤接触，如不慎接触到皮肤，应立即用清水冲洗。
本标准所用的试剂和水，除非另有说明，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。
4.1 试剂和溶液4.1.1 三氯甲烷。
4.1.2 无水乙醇。
4.1.3 BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）。
4.1.4 三氯化锑-三氯甲烷溶液：称取1g三氯化锑用4ml三氯甲烷溶解即得（现配现用）。
4.2 仪器和设备4.2.1 紫外-可见分光光度计。
4.2.2 分析天平。
4.2.3 超声波清洗器。
4.2.4 恒温水浴装置。
4.2.5 离心机（离心试管体积大于20ml）。
4.2.6 氮气吹干装置。
4.2.7 孔径为0.84mm的分析筛。
4.2.8 孔径为0.425mm的分析筛。
4.3 鉴别4.3.1 取试样约10mg于试管中，加50℃-60℃热水1ml，于50℃-60℃热水浴中超声5min。
冷至室温后，加入三氯甲烷（4.1.1）10ml并振摇30s，静置分层后，取三氯甲烷层溶液3ml与三氯化锑-三氯甲烷溶液（4.1.4）1ml反应，溶液应立即显蓝紫色。
4.3.2 取含量测定项（4.4.1）下的待测液，以三氯甲烷为空白，使用1cm的比色皿，于分光光度计上扫描波长200nm-600nm之间的吸收光谱，其最大吸收波长应在波长 484nm-490nm之间，光谱图参见附录A。
4.4 含量4.4.1 测定待测液：称取试样0.15g（精确至0.0002g），置于250ml棕色容量瓶中，加入BHT（4.1.3）约10mg，加入蒸馏水10ml，在50℃-60℃热水浴中超声5min，流水冷却至室温，加入无水乙醇（4.1.2）100ml和三氯甲烷100ml，于室温水浴中超声5min，用三氯甲烷稀释至刻度摇匀。
取该溶液适量，置于具塞离心管中离心5min（转速为3000r/min），精密称取上层清液2ml于50ml棕色容量瓶中，将容量瓶置于约45℃的水浴中，用氮气流吹干，用三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即为待测液，应立即测定（于20min内完成测定）。
虾青素检测方法虾青素分析方法1.仪器：Agilent 1100 旋转蒸发器超声波2.试剂：无水乙醇三氯甲烷正己烷（HPLC）丙酮（HPLC）3.检测方法：色谱柱：ZORBAX RX-SIL 4.6×250mm,5um流动相：正己烷：丙酮=86：14柱温：25℃检测波长：470nm（VWD）流速：1.2ml/min进样体积：20ul4.溶液配制供试品溶液：精密称取虾青素（微粒）样品100mg，置于250ml容量瓶中，加5ml水，50℃水温超声10min，使样品完全溶解。
冷却到室温，加100ml无水乙醇，用三氯甲烷定容。
取一定量的溶液离心，转速2500/min，5min。
移取上清液5ml于蒸馏烧瓶中，50℃旋转蒸发，残渣用4ml三氯甲烷溶解，移入50ml容量瓶中，并用正己烷定容。
此溶液为供试品溶液。
标准品溶液：精密称取虾青素对照品10.0mg，置于100ml容量瓶中，加10ml 三氯甲烷，冷水超声溶解，加正己烷稀释至刻度，摇匀。
移取此溶液5ml于50ml容量瓶中，加4ml三氯甲烷，用正己烷稀释至刻度，摇匀，此溶液为标准品溶液。
5.计算虾青素含量＝样品峰面积×标准品质量×250×10×标准品含量×100％÷标准品峰面积÷样品质量÷100÷1010%虾青素干粉的紫外检测方法1.样品液配制取待测样品100毫克干粉至250毫升棕色容量瓶中，加5毫升去离子水，在50摄氏度条件下超声溶解5min，冷却后，加100毫升无水乙醇摇匀，再用氯仿定容，过滤。
取5毫升上述溶液至50毫升容量瓶中，再用氯仿定容至刻度。
2.虾青素空白溶液用氯仿做空白。
在474nm处测最大吸收值。
3.结果计算C=A*2500/（1830*W）A为吸光系数W为样品重量虾青素晶体、油悬检测方法1.样品液配制取待测样品20毫克晶体（或油悬液60毫克）至100毫升棕色容量瓶中，加入10毫升氯仿溶解，加正己烷定容，摇匀，取1毫升上述溶液至100毫升容量瓶中，再用正己烷定容至刻度。
虾青素标准
虾青素是一种重要的天然色素和抗氧化剂，被广泛应用于食品、保健品、医药等领域。
为了保障消费者的健康和产品质量，制定虾青素的标准是非常必要的。
虾青素标准主要包括以下几个方面：
1.质量标准：包括虾青素的含量、纯度、溶解度等指标。
虾青素的含量应符合国家标准，纯度应达到99%以上，溶解度应符合产品使用要求。
2.安全标准：虾青素应符合国家食品安全标准，不得含有重金属、农药、兽药等有害物质，不得使用违禁成分。
3.包装标准：虾青素应采用符合卫生安全要求的包装材料，标签应清晰明了，包装应具有防潮、防紫外线等功能。
4.使用标准：虾青素应按照产品使用要求使用，不得超过规定剂量，不得替代药物治疗。
虾青素标准的制定有助于规范产品市场，保障消费者的健康和权益。
同时，也有助于推动虾青素产业的健康发展，提高企业的产品竞争力。
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虾青素含量多少是标准虾青素是一种天然的抗氧化剂，被广泛应用于食品、保健品和化妆品等领域。
而虾青素含量的标准对于产品的质量和功效具有重要影响。
那么，虾青素含量多少才是标准呢？接下来，我们将从不同角度进行分析。
首先，虾青素含量的标准应当根据产品的具体用途来确定。
在食品行业，虾青素通常被用作天然色素，用于增加产品的色泽，因此虾青素含量的标准应当符合国家相关法规的规定，确保产品的安全性和稳定性。
在保健品领域，虾青素被认为具有抗氧化、抗衰老的功效，因此虾青素含量的标准应当能够满足产品所宣称的功能，确保产品的有效性和可靠性。
在化妆品行业，虾青素常被添加到护肤品中，具有美白、抗皱等功效，因此虾青素含量的标准应当能够满足产品所宣称的美容效果，确保产品的品质和效果。
其次，虾青素含量的标准还应当考虑产品的配方和使用方法。
不同的产品配方可能对虾青素含量有不同的要求，有些产品可能需要较高浓度的虾青素来达到预期的效果，而有些产品可能只需要较低浓度的虾青素即可。
此外，产品的使用方法也会影响虾青素含量的标准，例如口服保健品和外用化妆品对虾青素含量的要求就有所不同。
最后，虾青素含量的标准还应当考虑生产成本和市场需求。
高含量的虾青素可能会增加产品的生产成本，而低含量的虾青素可能无法满足市场需求，因此虾青素含量的标准应当在生产成本和市场需求之间找到平衡点，既能保证产品的质量和功效，又能满足市场的需求，提高产品的竞争力。
综上所述，虾青素含量多少才是标准，应当根据产品的具体用途、配方和使用方法来确定，同时考虑生产成本和市场需求，找到一个合理的平衡点。
只有这样，才能确保产品的质量和功效，满足消费者的需求，提升企业的竞争力。
希望本文对您有所帮助，谢谢阅读！。
超高效液相色谱法测定虾青素陈伟珠;张怡评;晋文慧;方华;洪专【摘要】A ultra performance liquid chromatography(UPLC) method for determination of astaxanthin was developed. The determination of astaxanthin was performed on a UPLC BEH C8 column (50 mm×2.1mm,1.7μm). The influence of mobile phase,flow rate and column temperature on the separation of astaxanthin was comprehensively studied. The optimal separation condition was as follows:the mobile phase was methanol–water (volume ratio was 75∶25) with a isocratic elution profile and flow rate of 0.5 mL/min,the detection wavelength was 475 nm,the column temperature was 40℃. The mass concertration of astaxanthin has good linear ralationship with the chromatographic peak area in the range of 0.2–10.0 µg/mL,the correlation coefficient r was 0.998 8. The detection limit was 0.1 µg/mL (S/N=3). The quantitation detection limit was 0.2 µg/mL(S/N=10). The relative standard deviation of determination results was 0.41%(n=6), and the recovery was 105.8%–110.3%. The method is rapid,simple,reliable,and sensitive with a good reproducibility, it can be used for the determination of astaxanthin.%建立超高效液相色谱法快速检测虾青素的方法。
反相高效液相色谱法检测虾青素*陈晋明1,2 王世平1 陈 敏1(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083; 2.山西农业大学食品科学与工程学院,太谷 030801) 摘要 建立了一种快速检测虾青素的高效液相色谱法。
色谱柱为D ik m a D i amonsil T M-C18(250mm×4.6mm .i d.,5μm),柱温为25℃,甲醇为流动相,检测波长为478n m。
虾青素的质量浓度在1～10μg/mL内与色谱峰面积线性关系良好,相关系数为0.9997,该方法测定结果的相对标准偏差为0.38%(n=6),回收率为99.7%。
关键词 虾青素 高效液相色谱 雨生红球藻 侧金盏花 虾青素(A staxan t h i n,3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素),又名虾黄质、龙虾壳色素,是海洋生物体内主要的类胡萝卜素之一[1～2]。
近年来大量的研究表明,虾青素具有许多重要的生物学功能,可作为维生素A原,其抗氧化性强于β-胡萝卜素和维生素E,虾青素能清除体内由紫外线照射产生的自由基、抑制多不饱和脂肪酸的氧化、调节免疫功能、改善视力、加速色素形成以及抗肿瘤等[3]。
同时,虾青素具有特殊的鲜艳粉红色,可用于食品、化妆品的着色以及作为水产养殖的饲料添加剂。
目前,虾青素的生产已形成一定规模,其销售额达数亿美元,市场前景十分广阔[4]。
因此对虾青素的分析检测引起了人们的重视,国内外已有文献报道虾青素的分析检测方法[5～7],但这些方法多数分析时间较长或分析过程较复杂。
笔者采用反相高效液相色谱法对雨生红球藻粉及侧金盏花粉中的虾青素进行了快速的定性、定量分析,分析灵敏度高,结果可靠,为虾青素的综合利用提供了科学依据。
1 实验部分1.1 主要仪器与试剂 高效液相色谱仪:LC-10ATVP型,日本岛津公司; 紫外-可见分光光度检测器:SPD-10AVP型,日本岛津公司; 双光束紫外可见光光度计:TU-1901型,北京普析通用仪器有限公司; 水浴恒温振荡器:PHZ-82型,常州国华电器公司; 高速冷冻离心机:TGL-16G-A,上海安亭科学仪器厂; 虾青素标准品:美国Sig m a公司; 甲醇:色谱纯; 甲醇、二氯甲烷:分析纯; 雨生红球藻粉样品:市售; 侧金盏花:某农科院; 虾青素标准储备液:0.1m g/m L。
虾青素逆转衰老效果明显虾青素存在于海洋里的红藻里。
三文鱼、虾、螃蟹等海洋生物食用后，体内含有虾青素成分，煮熟后变成红色的色素是由虾青素氧化后的虾红素。
虾红素对人类无价值，只有未煮熟前的虾青素才有意想不到的价值。
逆转衰老，眼见为实：一、大米实验1、取几粒白色剔透的大米，滴入数滴强氧化剂碘伏。
大米迅速被氧化变黑。
用清水将大米淘一淘，大米依然是黑色的。
2、将高纯度的虾青素放入盛大米的杯子，在搅拌的过程中，观察大米瞬间被洗白。
被氧化的大米被还原，重新变白，恢复如初。
3、此时再加入碘伏，大米没有变黑，一直保持好大米的原色原质。
实验结论：1、被氧化大米相当于已受损的人体器官。
虾青素强力逆转氧化，大米变白了，人体器官恢复正常。
2、再次氧化时，虾青素已经形成保护膜，人体器官有了免疫，再不会旧病复发。
二、苹果实验1. 把一个苹果用刀切成两边，分别放入两个玻璃容器里，分别放入同等份量的水，刚好覆盖住苹果。
2. 取一粒虾青素，用刀切开，滴入其中的一个盛有一边苹果的水中，搅拌均匀。
3. 等待一至两小时，然后观看两边的苹果：有虾青素的苹果，跟刚切开时的颜色一样，没有任何变化；没有虾青素的苹果，变成棕色，变坏了。
如果你等更久一些时间，这两边的苹果的差异更大，氧化破坏和抗氧化的保护就在你眼前正在发生着。
没有受保护一边的苹果，受到氧化得非常快；有虾青素受保护一边的苹果受氧化得非常慢，或没有受到氧化，因为抗氧化剂虾青素的存在。
延长生命，科学为证：三、线虫实验，太令人震撼约翰斯坦波教授在加州罗克实验室，那里是世界抗衰老研究的权威中心。
2011年他们完成了著名的线虫实验。
这种线虫为单细胞生物体，它的寿命只有20天。
因此常用它作为衡量科研成果延缓衰老、延长寿命的“试验品”。
约翰斯坦波教授及其弟子连续喂食虾青素，最后线虫竟然活到了36—42天！这太不可思议了，这相当于生命平均延长了100%！这个结果对于人类的意义太令人震撼了。
穏定性虾青素对人类的意想不到的益处是由于它的强大的抗氧化能力，这个内在的因素使制造业者和消费者造成一个问题。
虾青素该怎么进行检测？教你选择虾青素检测专业机构！今天，我们给大家讲讲关于虾青素检测的相关问题，并且来帮助大家如何选择专业的虾青素检测机构。
大家都知道，虾青素是一种锻炼抗氧化剂。
它对于人体有很好的抗氧化能力、能够有效地清除体内的二氧化氮、硫化物、二硫化物等有害物质，也可降低脂质过氧化作用，有效的抑制自由基引起的脂质过氧化作用。
其产品也能给企业带来不菲的利润。
因此，很多企业也涉足其中。
但是，想要上线相关产品却并不容易。
首先要进行的就是虾青素检测的环节啦，下面，我们就来给大家讲讲虾青素检测的项目以及相关检测机构的选择。
虾青素检测内容介绍：针对虾青素检测项目，我们提供更全面的检测服务。
根据虾青素检测的种类，检测的项目有：虾青素产品检测、来源食物检测等服务。
根据虾青素检测的项目，我们提供包括：常见虾青素检测项目、来源食物中的青素含量检测等全面的虾青素检测服务。
虾青素检测种类：虾青素虾青素产品检测：天然虾青素、人工合成虾青素、食用虾青素、药用虾青素、食品添加剂用虾青素、保健品用虾青素、化妆品用虾青素、水产养殖饲料用虾青素、禽畜饲料用虾青素、虾青素胶囊、虾青素片、虾青素粉等。
虾青素来源食物检测：虾类、藻类、贝类、鱼类、蟹类等食物中的虾青素含量测定。
虾青素检测项目：常见虾青素检测项目1、有效成分含量定性定量分析2、抗氧化性能检测分析3、疏水性能检测分析4、旋光性能检测分析5、抗感染活性检测分析来源食物中的青素含量检测1、虾类：克氏鳌虾（小龙虾）、青虾、河虾、草虾、龙虾（中国龙虾）、海虾（红虾、大红虾）、对虾（明虾）、基围虾、琵琶虾、基围虾、半咸水虾、白虾、鳌虾等食物中的虾青素检测；2、藻类：礁膜、石莼、海带、裙带菜、紫菜、石花菜、雨生红球藻、地木耳、发菜等食物中的虾青素检测；3、蟹类：三疣梭子蟹（海蟹）、远海梭子蟹、青蟹（又称黄甲蟹、蝤蛑）毛蟹、螃蟹、河蟹、清水大闸蟹（如梁子湖、阳澄湖大闸蟹等）等食物中的虾青素检测；4、贝类：淡菜、蚶、海蚌、田螺、鲍鱼、牡蛎、环文蛤（青蛤）、河蚬、蛤仔、扇贝、青口等食物中的虾青素检测；5、鱼类：三文鱼、鲑鱼、鳟鱼、鱼籽、大马哈鱼、金枪鱼、鲤鱼、梭鱼、鳕鱼、沙丁鱼等食物中的虾青素检测。
虾青素检测
虾青素（Astaxanthin），又称为虾黄素、虾黄质，是一种存在于河螯虾外壳、牡蛎和鲑鱼中的红色类胡萝卜素。
在体内可与蛋白质结合而呈青、蓝色，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病等作用。
虾青素及其分子结构式
迪信泰检测平台采用高效液相色谱(HPLC)技术，使用Agilent或Waters高效液相色谱仪对样品进行分离，蒸发光散射检测器(ELSD)或DAD检测器对样品进行鉴定，可检测各类样品中虾青素含量变化。
此外，我们还提供其他多种色素检测服务，以满足您的不同需求。
送样要求及检测周期
HPLC测定虾青素样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目报告
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关质谱参数（中英文）
3. 质谱图片
4. 原始数据
5. 虾青素含量信息
相关服务
色素检测。
高效液相色谱-光电二极管阵列法测定虾青素的含量陈伟珠;张怡评;晋文慧;洪专;易瑞灶【摘要】A method using high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with photodiode array detector (PDA) was established for determination of astaxanthin. The separation was performed on Purospher STAR RP 18 column (4.6 mm×250 mm,5μm) with the mobile phase of methanol-water (Volume ratio was 95∶5). The detector was photodiode array detector and the variable wavelength detector (VWD) was set at 482 nm. The column temperature was 30℃and the injection volume was 20μL. The calibration curve was linear in the range of 0.2-16μg/mL,and the correlation coefficient was 0.999 9. The relative standard deviation of determination results was 0.42%(n=6). The average recovery was 100.4%, and the detection limit was 0.01μg/mL. This method is characteristic of rapidity,accuracy,high sensitivity and good reproducibility.%建立虾青素含量测定的高效液相色谱-光电二极管阵列法。
虾青素实验方法1.3实验方法1.3.1生物量的测定主要采用干重法，首先可以将空管置于烘箱中烘干至恒重，记得做标记(必须使用马克笔)，并且记录下空管的重量m，然后取5mL的发酵液于离心管中，0 3500r/min，离心5min，沉淀水洗两次，完后置于烘箱中烘干至恒重，并且称重m。
计算方法如下:生物量(g/L)= (m-m)×1000/v 01式中，m—空管重量(g);m —管与菌体总重量(g);v—发酵液体积0 1 (mL)。
1.3.2虾青素总含量的测定取适量发酵液(一般高产1mL低产5mL)于做好标记的空管中，3500r/min，离心5min，沉淀水洗一次，去上清后将沉淀在50?水浴中预热5分钟左右，将预热至75度的DMSO(二甲基亚砜)取2mL于离心管中，剧烈震荡至菌体完全消失，于离心管中加入5mL左右的乙醇，3500r/min，离心5min，上清液定容至10mL，在可见分光光度计下(必须提前预热20min)，于474nm测量其吸光值(空白采用二甲基亚砜:乙醇=1:4)1.3.3发酵液残糖的测定葡萄糖标准曲线的制作:配制2g/L的葡萄糖标准液，精确称取1*198.17/180=1.1009g的葡萄糖定容至500mL。
不同葡萄糖浓度的标准溶液的制作:做大约11个点，分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2g/L0g/L标准液的配制:取1mL蒸馏水0.2g/L标准液的配制:0.1mL 2g/L的葡萄糖夜+0.9mL的蒸馏水 0.4g/L标准液的配制:0.2mL 2g/L的葡萄糖夜+0.8mL的蒸馏水 0.6g/L标准液的配制:0.3mL2g/L的葡萄糖夜+0.7mL的蒸馏水 0.8g/L标准液的配制:0.4mL 2g/L的葡萄糖夜+0.6mL的蒸馏水 1.0g/L标准液的配制:0.5mL 2g/L的葡萄糖夜+0.5mL的蒸馏水1.2g/L标准液的配制:0.6mL 2g/L的葡萄糖夜+0.4mL的蒸馏水 1.4g/L标准液的配制:0.7mL 2g/L的葡萄糖夜+0.3mL的蒸馏水 1.6g/L标准液的配制:0.8mL 2g/L的葡萄糖夜+0.2mL的蒸馏水1.8g/L标准液的配制:0.9mL 2g/L的葡萄糖夜+0.1mL的蒸馏水2.0g/L标准液的配制:1.0mL 2g/L的葡萄糖夜取各标准液和样品液1mL(经过适当的倍数稀释，使样品液浓度在标准曲线上)加入3mL的DNS，100度水浴加热15min，时间到后取出来立即用自来水冷却，之后定容至25mL，于520nm下测定吸光值。
虾青素的测定主要有分光光度法和高效液相色谱法两种方法。
分光光度法：这种方法主要是利用虾青素的最高吸收峰为478，因此在波长为478下进行比色即可测定虾青素的含量。
由于该种方法比较简单，可能存在的误差也较大，所以高效液相色谱法是检测虾青素的主流方法。
高效液相色谱法：这是一种分离效果好、灵敏度高、检测速度快的方法，是最为常见的虾青素检测方式。
例如，GB/T 31520-2015就规定了用液相色谱法检测红球藻中虾青素。
请注意，虾青素的测定方法具有一定的复杂性，需要专业的技术人员进行操作。
