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蛋白质在食品加工中的变化【摘要】：因而，对食品蛋白质在加工和储藏中的变化作全面详细的了解，有助于我们选择适宜的处理手段和条件，来避免蛋白质发生不利的变化，从而促使蛋白质发生有利的变化。
大多数食品蛋白质在60～90℃条件下，经过温热处理1h或更短的时间，会产生适度变性。
对其所含氨基酸进行分析发现，适度变性的蛋白质中的氨基酸几乎没有发生变化。
在低温下储藏食品能抑制微生物的繁殖、抑制酶活性及降低化学反应速率的目的，从而延缓或防止蛋白质的腐败。
在食品工业中，从原料的处理加工到产品的储存、运输和销售的整个过程，往往涉及热处理、低温处理、脱水、碱处理和辐射，这些过程必然会引起蛋白质的物理、化学和营养变化。
这些变化有的有利于食品营养和产品质量，有的则不利。
因此，全面详细地了解食品蛋白质在加工和贮藏过程中的变化，将有助于我们选择合适的处理方法和条件，避免蛋白质发生不利的变化，从而促进蛋白质发生有利的变化。
蛋白质在加工、储藏过程中发生的主要化学反应如表3-16所示。
表3-16 蛋白质在加工、储藏过程中发生的主要化学反应一、热处理的影响热处理对食品加工中的蛋白质有很大的影响。
影响程度取决于加热温度、加热时间、湿度和还原性物质的存在等因素。
在热处理过程中，与蛋白质有关的化学反应包括蛋白质变性、蛋白质分解、氨基酸氧化、氨基酸键交换、新氨基酸键形成等。
因此，在食品加工中选择合适的热处理条件对保持蛋白质的营养价值具有重要意义。
大多数食品蛋白质在60～90℃条件下，经过温热处理1h或更短的时间，会产生适度变性。
蛋白质原有的肽链上的氢键因受热而断裂，使原来折叠部分的肽链松散，容易被消化酶作用，提高了蛋白质的消化吸收率。
因此，绝大多数蛋白质的营养价值经过温和热处理后得到了提高。
对其所含氨基酸进行分析发现，适度变性的蛋白质中的氨基酸几乎没有发生变化。
从营养学的角度来看，温和热处理所引起的蛋白质变性一般都是有利的。
例如，哺乳动物胶原蛋白在大量水存在的条件下，加热至65℃以上会出现伸展、解离和溶解现象；肌纤维蛋白在同样的条件下则出现收缩、聚集和持水力降低的现象。
实验胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。
在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。
胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。
pH＜3时，胰蛋白酶易变性。
PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。
胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。
重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。
胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。
实验（一）胰蛋白酶活性测定[原理]胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。
此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。
因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。
本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物，水解反应如下：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。
在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm 增加0.001的酶量为一个BAEE单位。
新型交联酶聚体技术
新型交联酶聚体技术是一种将多个酶分子结合成一个大分子的
技术。
这种技术可以通过化学反应或生物反应来实现，使得不同种类的酶可以被固定在一起，形成一个高效的催化系统，从而提高酶的催化效率和稳定性。
新型交联酶聚体技术具有以下优点：
1. 高效催化：由于多个酶分子被结合在一起，可以形成一个更
复杂的催化系统，提高了酶的催化效率。
2. 稳定性强：交联酶聚体可以在较宽的温度和pH范围内保持催化活性，同时也能够抵抗其他因素的影响，如有机溶剂、盐浓度等，从而提高了酶的稳定性和寿命。
3. 可重复使用：由于交联酶聚体具有较高的稳定性和耐受性，
因此可以进行多次重复使用，降低了催化过程中的成本和环境污染。
4. 提高产率：交联酶聚体的使用能够提高底物转化效率和产物
收率，从而提高工业生产效率。
5. 应用广泛：交联酶聚体技术可以应用于多种生物催化反应，
如酶降解废水、制备医药和精细化工等领域，具有广阔的应用前景。
总之，新型交联酶聚体技术是一种具有很大潜力的生物催化技术，可应用于多种领域，提高催化效率和稳定性，降低生产成本和环境污染。
酶促交联法制备全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：酶促交联法制备是一种环保、有效的生物技术方法，可用于制备具有特殊功能和性能的生物聚合物材料。
通过酶促交联，可以改变生物聚合物的结构和性质，提高其力学性能、热稳定性和耐化学性，从而拓宽其应用领域。
本文将针对酶促交联法制备的原理、方法和应用进行介绍和探讨。
一、酶促交联法制备的原理酶促交联是一种利用酶类催化剂将多聚物链或多肽链连接成网络形状的方法。
酶在催化作用下可以使生物聚合物发生特定的化学反应，形成交联结构，增加材料的机械性能和稳定性。
酶促交联法制备的原理主要包括以下几点：1. 酶的选择：酶是一种生物催化剂，具有高效、特异和环境友好等特点。
在酶促交联法中，选择适合的酶对于反应的进行至关重要。
2. 底物的选择：底物是酶催化反应的反应物，其选择会直接影响到反应的进行和产物的性质。
在酶促交联法中，一般选择具有活性基团的生物聚合物作为底物。
3. 交联反应的条件控制：在酶促交联法中，交联反应的条件如温度、pH值、时间等都会对反应产物的性质起到重要影响。
需要对反应条件进行精细控制，以实现理想的交联效果。
酶促交联法制备的方法多种多样，常见的包括酶催化接枝、酶催化交联和酶催化重排等。
下面以几种典型的酶促交联法制备方法进行介绍：1. 酶催化接枝：酶可以通过将活性基团引入生物聚合物链中，实现生物聚合物链的连接和交联。
这种方法可以提高生物聚合物的分子量、改善机械性能和热稳定性。
常见的酶催化接枝反应包括酯化、氨化等。
3. 酶催化重排：酶可以促使生物聚合物链中的原子或基团在空间上重新排列，形成新的结构和性质。
这种方法可以改变生物聚合物的分子结构和功能，拓宽其应用领域。
常见的酶催化重排反应包括羟基基团的移位、酯键的断裂等。
酶促交联法制备的生物聚合物材料具有许多优点，如环保、高效、可控等，因此在各个领域得到了广泛的应用。
以下是酶促交联法制备在不同领域的应用：1. 医药领域：酶促交联法制备的生物聚合物材料在医药领域有着广泛的应用，如药物载体、组织工程支架、药物缓释材料等。
mTGase交联蛋白质的安全性i平价及相关检测研究进展王稳航1,师小婷1,孙孟娇1,郝艳杰1,李玉2(1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津300457；2.天津科技大学生物工程学院，天津300457)摘要：微生物谷氨酰胺转氨酶(mTGase)作为一种性能优良的交联酶，用于提高蛋白质的加工性能$由于异肽键的生成,mTGase交联能够引起蛋白质消化率和免疫原性的变化；mTGase可能会作为乳糜泻患者的自身抗原，引发自身免疫疾病。
为此，作者主要分析了mTGase交联对健康的影响和相应的检测手段，为mTGase的安全应用提供参考$关键词：微生物谷氨酰胺转氨酶(mTGase)；安全性；异肽键；交联;检测中图分类号:Q55+章编号：1673-1689(2021)02-0010-09DOI：10.3969/j.issn.1673-1689.2021.02.002Research Progress on Safety Evaluation of mTGase Cross-Linking forProtein and Related Detection MethodsWANG Wenhang1,SHI Xiaoting1,SUN Mengjiao1,HAO Yanjie1,LI Yu2(1.College of Food Science and Engineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457,China;2.College of Bioengineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin300457,China)Abstract:Microbialtransglutaminase(mTGase),as a high-performance cross-linking enzyme,isoften used to improve protein's techno-fUnctional properties,however,more attention should be paidto the potential health problems caused by its protein cross-linking products and its own.Due to theformation of isopeptide bonds,mTGase cross-linking can cause the changes of protein digestibilityand immunogenicity.mTGase may act as an autoantigen in patients with celiac disease,causingautoimmune diseases.Therefore,this paper mainly analyzes and discusses the health effects ofmTGase cross-linking and the corresponding detection methods,in order to enrich and expand theresearch field of mTGase and provide reference for the safety application of mTGase.Keywords:microbial transglutaminase(mTGase),safety,isopeptide,cross-linking,detection method近几十年来，研究者通过酶促反应来改变食品蛋白质的功能特性以提高最终产品的感官质量和营养品质’因此，酶促修饰的方法是改善和：新功能特性产品的叫酶应和、特异性强、安全性强、效率高等特点，因而成为食品蛋白质改性的重要’生物谷酶(mTGase)是目的蛋白质酶，已应食品。
化学生物学小论文-胰蛋白酶的研究及应用
胰蛋白酶是一种酶类蛋白质，主要存在于胰腺的分泌液中。
它作为一种消化酶，在人体消化中扮演着非常重要的角色。
胰蛋白酶通过水解蛋白质的肽键来分解食物中的蛋白质成为小肽和氨基酸，以供身体吸收利用。
胰蛋白酶具有非常广泛的应用，主要有以下几个方面：
一、医学应用
胰蛋白酶可以用于治疗胰腺不足症和胰腺疾病等。
在胰腺不足症患者中，由于胰腺功能不良，使得胰蛋白酶分泌不足，导致无法对食物中的蛋白质进行消化分解。
而外源性添加胰蛋白酶可以补充消化酶，促进食物的消化吸收，对于保障机体营养具有非常重要的意义。
二、制药行业
胰蛋白酶作为生化制药行业中的一种重要原料，广泛应用于肿瘤、心血管、消化等领域。
通过在胰蛋白酶分子中特定位点上引入基团或者交联化学反应，可以显著增加其稳定性和活性，从而提高胰蛋白酶的制剂质量与产值。
三、食品加工
胰蛋白酶可以被应用于制作乳制品、肉制品、啤酒等食品。
在乳制品中，胰蛋白酶可以加速乳酸菌的生长与增殖，起到促进酸奶、发酵奶等乳制品中菌群发酵的效果。
在肉制品中，胰蛋白酶可以使其细腻、鲜嫩；在啤酒中，胰蛋白酶的加入可以提高酵母的生长率，促进酵母对麦芽中淀粉的消化利用。
总的来说，胰蛋白酶在医疗、生物制药、食品加工等领域中的应用十分广泛。
同时，尤其是在制药行业中，随着对胰蛋白酶安全性、纯度和活性质量的不断提高和发掘，胰蛋白酶将会在更多领域中得到应用。
目的要求（1）学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的大体方式。
（2）了解酶的活性与比活性的概念。
实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生必然改变后转变成有活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为，最适～，在pH=3时最稳固，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。
Ca2+离子对胰蛋白酶有稳固作用。
重金属离子，有机磷化合物和反映物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。
最近发此刻一些植物的块基（如马铃薯、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。
胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，关于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。
另外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。
胰蛋白酶对这些键的灵敏性顺序为：酯键> 酰胺键> 肽键。
因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。
目前经常使用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。
用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。
本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。
酶活力单位的规定常因底物及测定方式而异。
从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一样是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提掏出来，然后再依照等电点沉淀的原理，调剂pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白和非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白和非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。
动物胰蛋白酶的纯化、性质及其固定化研究进展王卿惠;徐兴军;邵淑丽;田金波;张伟伟;王有祥;薛明强【摘要】根据近年国内外胰蛋白酶最新研究报道,综述了动物胰蛋白酶的研究进展,包括酶的纯化、特性以及酶的固定化,以期为胰腺蛋白酶的研究、开发和利用提供一定的参考.【期刊名称】《高师理科学刊》【年(卷),期】2016(036)012【总页数】6页(P39-44)【关键词】动物;胰蛋白酶;纯化;固定化【作者】王卿惠;徐兴军;邵淑丽;田金波;张伟伟;王有祥;薛明强【作者单位】齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006;齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔161006【正文语种】中文【中图分类】Q955胰蛋白酶（trypsin，EC3.4.21.4）广泛应用于轻工业、医药工业、食品加工业、畜牧业和现代生物技术等领域，日益成为研究热点.作为丝氨酸蛋白酶家族的成员之一，胰蛋白酶激活前常以酶原前体形式存在.胰蛋白酶原前体[1]含有一段由15个氨基酸组成的信号肽序列和一个由6～8个氨基酸组成的激活肽（TAP）序列.若信号肽序列被结合于内质网膜上的信号肽酶切除，则胰蛋白酶原前体转变成胰蛋白酶原；若其中的激活肽序列再被肠肽酶水解掉，最后转变为具有活性的胰蛋白酶.胰蛋白酶属于内肽酶，主要水解Arg或Lys赖氨酸羧基端的具有高度专一性的肽键.胰蛋白酶具有“双重”作用，它不仅可以消化普通蛋白质，还可以激活胰腺分泌的其它酶原[2]，在蛋白质水解方面发挥重要的作用.大多数脊椎动物体内的胰蛋白酶以上述形式被活化，而对于在无脊椎动物（如昆虫及甲壳动物），其激活机制可能是“自我活化”[3].但Buettner K[4]研究发现，人类胰蛋白酶原的激活也存在“自我活化”现象.1.1 胰蛋白酶催化特点胰蛋白酶一般存在于高等动物胰液和低等动物胃液中，也广泛存在于鸟类的肝脏、胰腺和肠道内.其催化特点为：（1）无需提供能量；（2）有高度的专一性；（3）底物与酶的活性中心结合是可逆的，这种结合使得蛋白质特定肽键因弯曲变形更易于受到水分子攻击.1.2 胰蛋白酶活性测定由于胰蛋白酶不仅能催化由碱性氨基酸（Arg，Lys）的羧基与其它氨基酸的氨基形成的肽键，还能催化由碱性氨基酸的羧基形成的酰胺键或酯键.因此，若以含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物，便可通过测定产物的变化来测定胰蛋白酶的活力.目前常用的底物包括苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（BAPA，NAPNA）、苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（BANA）、苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）以及对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）.以BAEE为底物，在253 nm下测定反应产物的吸光值变化，一般吸光值每升高0.001即为一个胰蛋白酶酶活单位（1 μmol/min）.张东裔[5]等选用TAME作为底物，由于该底物受胰蛋白酶作用后转变成对甲苯磺酞基精氨酸，使反应混合物的pH值下降；以酚红为指示剂，通过测定555 nm 处光吸收值降低来监测pH值变化，在0.001～0.3 μg范围内，胰蛋白酶含量与光吸收值降低呈线性关系，从而可以用光吸收值降低值表示胰蛋白酶的相对酶活力.朱忠胜[6]等对菲牛蛭（Poecilobdella）不同生长阶段幼体组、亚成体和成体组及摄食前后的消化酶活性进行了测定，发现亚成体组胰蛋白酶活力最强.甘丽萍[7]等调查家蚕幼虫（Bombyx mori）胰蛋白酶活性，探讨了其与丝氨酸蛋白酶基因表达之间的关系.张建萍[8]等采用紫外线吸收法测定了塔里木兔（Lepus yarcandensis）和家兔（Oryctolagus curiculus）胰蛋白酶活力.结果表明，家兔胰腺和肠道胰蛋白酶活性高于塔里木兔.可见，胰蛋白酶活性的有效测定为研究动物生理和酶基因表达提供了前提条件.福林酚试剂[9]在碱性条件下可以被酚类化合物还原为蓝色物质（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质含酚基氨基酸，因此可以利用此原理测定蛋白酶活力.Dong M[10]最新采用7肽（CRRRRRR）底物建立一个简单敏感的胰蛋白酶测定的电化学方法.在方波内金属钌电极的伏安电流增加与胰蛋白酶活性在0.004 7～0.052 0 μmol/min/mL范围内成线性关系.可见，测定胰蛋白酶的关键是选择合适的底物，然后用胰蛋白酶催化，找出产物的变化规律与胰蛋白酶活性的相关性，用产物或产物引起的直接能测定的参数变化来表示胰蛋白酶的活性.2.1 胰蛋白酶提取从动物胰脏中分离、提取胰蛋白酶时，一般需几个连续的步骤：（1）用稀酸将酶原从胰腺细胞中抽提出来；（2）调节pH值至等电点，去除酸性杂蛋白；（3）硫酸铵分级沉淀胰蛋白酶原；（4）酶原用极少量活性胰蛋白酶激活；（5）再次盐析除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶；（6）收集胰蛋白酶组分获得粗品.2.2 胰蛋白酶纯化动物胰蛋白酶纯化方法改进的几个实例见表1.由表1可见，为了获得更纯的酶，一般需要过色谱柱.在纯化胰蛋白酶时，可以先活化后层析；也可以先层析后活化[11]41-42.为避免糜蛋白酶等非特异性酶切，常需要对胰蛋白酶进行修饰[12].表1在纯化猪胰蛋白酶时使用了反相层析.所谓正相和反相主要是由固定相和流动相极性大小决定的.正相柱的固定相极性大于流动相，反相柱则相反.因此，正相柱是极性小的先出峰，反相柱是极性大的先出峰[13]79-80.DEAE-纤维素柱层析属于阴离子交换层析，一般分离时碱性蛋白先出峰，酸性蛋白后出峰.苯甲脒类物质是胰蛋白酶的广谱抑制剂，苯甲脒类可以先偶联到琼脂糖凝胶6B上，然后对胰蛋白酶样品进行纯化.该方法流速高，非特异吸附少，填料粒度均匀，分离效果好，是纯化胰蛋白酶最适合的填料[14]3-8.另外采用先凝胶过滤后离子交换方法的顺序效果也很好[15]126-132.2.3 胰蛋白酶的酶学性质胰蛋白酶纯化方法的改进有重要意义，高纯度胰蛋白酶的获得是研究其酶学性质的关键.几种鱼类胰蛋白酶的纯化、性质及催化动力学研究见表2.比较Khangembam[14]8-12和Liu Chun-Hung[16]839-841研究的胰蛋白酶纯化结果可以发现，纯化的倍数越高，得率越小.因此，高纯度酶的获得是以“牺牲”胰蛋白酶为代价的.水产鱼类中胰蛋白酶分子量范围一般在20～30 kDa之间.根据文献[18]报道，2种不同鳕鱼（Gadus macrocephalus和Eleginus gracilis）的胰蛋白酶分子量均为24 kDa，与鲑点石斑鱼的胰蛋白酶分子量一致.陈荣昌[19]等纯化的2种青鱼分子量分别为44 kD和43.5 kD.研究发现，EDTA对青鱼胰蛋白酶的抑制作用很大，推测该酶可能为金属蛋白酶.对于哺乳动物而言，胰蛋白酶分子量大小也在20～30 kDa范围内，如牛胰蛋白酶分子量为23.3 kDa，猪胰蛋白酶为24.0 kDa[20].相比之下，鸟类胰蛋白酶的分子量可能要大一些，如岑亮[21]等从鸭肝中获得的胰蛋白酶相对分子量为35 kDa.一般哺乳动物胰蛋白酶的最适温度接近体温，如丁凌霄[11]等研究的猪胰脏酶最适温度为37 ℃.然而鱼类的最适温度比较高，在40～55 ℃之间.吴志强[22]研究表明，日本新糠虾蛋胰蛋白酶最适反应温度为37 ℃，接近哺乳动物胰蛋白酶的最适温度.鱼类的最适pH值为7～10之间.但哺乳动物胰蛋白酶pI一般为8.0～9.0，属于碱性蛋白酶；鱼类胰蛋白酶的pI为4.5～6，属于酸性蛋白酶.虾类胰蛋白酶的pH值为2～6，酸性更加明显.在使用SDS-PAGE电泳对获得的胰蛋白酶纯品进行初步验证的基础上，一般需要进一步采用埃德曼反应（Adman reaction）对蛋白质的N-端进行测序，从而更准确地通过比对（blast）来鉴定所得胰蛋白酶与其它胰蛋白酶的亲源关系.也可以对蛋白质样品作质谱（MS）分析，通过获得“小肽片段”对纯化的胰蛋白酶加以鉴定.从表2中可知，大多数胰蛋白酶的蛋白质N-段都存在IVGG 4个氨基酸高度保守的序列，这可以作为鉴定胰蛋白酶的特异标记序列.根据文献[14]报道，填加2mM CaCl2保温8 h能提高胰蛋白酶活力，可见Ca2+对胰蛋白酶有稳定作用.Liu Chun-Hung[16]842-846等使用BAEE为底物，发现胰蛋白酶活性随NaCl浓度（0～0.6 M）的增加而减小.Khaled[15]125-127使用BAPNA为底物，研究了金色小沙丁鱼胰蛋白酶的动力学.不同酶的Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同.因此，在计算Km值时，要考虑到所选择的底物.Km值可近似反映出酶与底物亲和力的大小：Km值越大，表明酶与底物的亲和力越小.结合表2可知，卡特拉鱼（Catla Catla）胰蛋白酶对底物的亲合最大（Km=0.062）.对于金色小沙丁鱼（Sardinella aurita）的胰蛋白酶而言，尽管有3种同工酶亚型A，B，C，而且分子量、最适pH值和温度都相同，但N-端氨基酸序列和动力学参数皆不相同，说明3种酶的催化效率不同.这可能是3种酶细微的氨基酸序列或种类不同所至.总之，在研究胰蛋白酶的酶学性质时，不仅要研究酶的分子量、最适温度、最适pH值以及酶的动力学参数变化，也要对酶的一级结构进行分析，从而研究酶的构效关系.2.4 影响胰蛋白酶活性的因素不同金属离子以及不同的理化处理可以改变胰蛋白酶的结构和催化性质.2.4.1 重金属离子对胰蛋白酶的影响金属离子（如Cd2+，Al3+，Zn2+，Cu2+，Pb2+，Hg2+）可能是胰蛋白酶的抑制剂.研究金属离子对酶的影响可使用多种技术和方法：（1）同步扫描荧光光谱技术（SFS）；（2）紫外可见吸收；（3）圆二色（CD）光谱法；（4）等温滴定量热法（ITC）；（5）酶活试验等.Zhang Tong[9]1805-1807等调查了Cu2+，Pb2+，Zn2+等离子对胰蛋白酶毒性产生的原因.研究发现，重金属的毒性效应应归于本身的特性而非所带有的电荷.Zn2+对胰蛋白酶没有明显影响；Cu2+和Pb2+直接损伤酶的结构和功能；Cu2+能够和胰蛋白酶结合，从而导致胰蛋白酶的荧光淬灭并使其疏水性增加；高浓度的Pb2+也能改变胰蛋白酶的结构，减少胰蛋白酶的活性.同时发现，对胰蛋白酶活性的影响按Cu2+>Pb2+>Zn2+的顺序逐渐减弱.等温滴定量热学分析表明，这些重金属离子与胰蛋白酶之间的相互作用是自发的和放热的，说明它们对胰蛋白酶具有抑制作用.2.4.2 物理因素对胰蛋白酶的影响及原因采用超高压技术处理胰蛋白酶可以改变其空间结构，从而可以研究酶空间结构变化与酶活力之间的关系.对胰蛋白酶二级结构变化的观察可以采用傅立叶红外光谱；对其三级结构的变化研究可以采用荧光光谱；测定酶活性的变化可以使用福林酚法.刘平[23]等对超高压（100～600 MPa）处理后的胰蛋白酶进行了研究.结果发现，与未处理的相比，超高压对胰蛋白酶活力影响显著.通过300 MPa处理，胰蛋白酶活力提高了0.386倍.此时胰蛋白酶的α-螺旋与β-转角的峰面积比值达到最大，荧光强度达到最高.超声波对胰蛋白酶也有影响.黄卓烈[24]等研究发现，超声波处理使胰蛋白酶活力普遍升高，Km值变小，Vmax值也降低，酶对底物的亲和力增大.2.4.3 化学因素对胰蛋白酶的影响张国文[25]等研究发现，邻苯二甲酸二丁酯（DBP）通过氢键和范德华力与胰蛋白酶形成基态复合物而淬灭胰蛋白酶的内源荧光.DBP与胰蛋白酶的结合使酶的α-螺旋、β-折叠和β-转角含量减少，使无规卷曲的含量增加，从而使蛋白质聚集.分子模拟结果表明，DBP结合于胰蛋白酶S1疏水空腔附近，与氨基酸His57，Ser195和Gly193形成氢键，从而抑制了胰蛋白酶活性.吐温（或聚山梨酯）为非离子型表面活性剂，是一系列聚氧乙烯去水山梨醇的部分脂肪酸酯.宋九华[26]等通过紫外和荧光光谱法研究了吐温与牛胰蛋白酶之间的相互作用.研究发现，吐温与牛胰蛋白酶主要表现为疏水作用力，对牛胰蛋白酶活性影响较少.但它们之间的相互作用能改变牛胰蛋白酶分子中的芳香族氨基酸残基在酶空间结构中所处的微环境，使微环境的疏水性增强.吐温对牛胰蛋白酶荧光淬灭效应起因于牛胰蛋白酶与吐温形成了复合物，能量转移作用较小，属于静态淬灭.由于液相胰蛋白酶存在严重自溶、解折叠作用，限制了胰蛋白酶在生产上的直接应用.而酶固定化技术能使胰蛋白酶稳定性增加并可重复利用，从而为胰蛋白酶在生产上更广泛地应用开辟了道路.固定化酶就是采用理化方法，使酶与载体结合或把酶包埋在其中，形成凝胶或半透膜微囊体.固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类，前者包括物理吸附法和包埋法等.安红[27]等采用吸附法对胰蛋白酶在磁性核壳介孔分子筛（Fe3O4·MCM-41）上的固定化进行了研究，发现与游离酶相比，固定化酶的耐温区间和pH值适应范围明显变宽，载体能保持良好介孔结构.孙俊[28]等通过静电相互作用，将胰蛋白酶固定于羧甲基壳聚糖磁性纳米颗粒（Fe3O4（PEG+CM-CTS））表面.结果表明，纳米颗粒对胰蛋白酶的吸附符合Langmuir等温吸附模型，载体对胰蛋白酶的最大固载量达117.6 mg/g，剩余的相对酶活性高达87.9％.固定化酶具有良好的操作稳定性和较高的储藏稳定性.Maciel[29]经Fe3+共沉淀以及采用聚苯胺将胰蛋白酶包裹合成磁性纳米颗粒，平均直径大约15 nm，以相对高自发磁化方式表现出磁化行为，主要以磁赤铁矿（γFe2O3）形式存在.固定化胰蛋白酶活性进一步提高，达到为原始活性的89％.化学法包括结合法和交联法，结合法又分为离子结合法和共价结合法.阮贵华[30]等以多孔介质材料Fe3O4·mSiO2·nSiO2为载体，采用γ-氨丙基三乙氧基硅烷接枝和戊二醛交联方法对胰蛋白酶进行了固定化.研究表明，φ（戊二醛）=1.875％，给酶量为0.3 mg/mL，反应时间为4 h时酶的固定化效率可达50.5％，酶保留了77.3％的活性.Song X[31]使用静电纺丝技术，将胰蛋白酶嵌入聚L-乳酸（PLLA）中，获得活性纳米纤维，可用于水解明胶.为改进被聚L-乳酸纳米纤维包合胰蛋白酶（NF-TR）稳定性和酶催化效率，在纤维表面使用戊二醛将胰蛋白酶分子交联起来形成（CL-TR）.在严峻的条件（50 ℃）下，CL-TR比NF-TR显示了更好明胶水解能力，从而改善了CL-TR催化能力和稳定性.胰蛋白酶被PLLA纳米纤维表面交联而固定，胰蛋白酶的变性、自溶和沥滤受到抑制，从而使酶的性质得到改善.LI Valuev[32]最新研究发现，丙烯酰胺水凝胶固定化胰蛋白酶活性依赖于水溶胶膨胀率、孔径分布和酶结合方式.影响胰蛋白酶固定化制备的因素很多，包括载体材料结构和性能、固定化方法、位点和条件等，其中载体选择和方法是固定酶制备的关键.酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于自动化生产.固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有较好的应用前景.但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间.总之，采取各种有效的层析方法对胰蛋白酶进行提取和纯化，是研究胰蛋白酶酶学性质的基础.在此基础上，研究各种理化因素对胰蛋白酶的影响为深刻认识胰蛋白酶结构和功能的“构效关系”提供了重要的科学数据.胰蛋白酶的固定化是提高胰蛋白酶稳定性的重要手段，将在工业上胰蛋白酶的开发和利用方面发挥重要作用，具有潜在的应用价值.随着固定化方法的改进，必将获得酶活性更高、稳定性更好的固定化胰蛋白酶，并应用于生产中以创造更高的经济价值.【相关文献】[1]Psochiou E，Sarropoulou E，mamuris Z，et，al.Sequence analysis and tissue expression pattern of sparus aurata chymotrysinogens and trypsinogen[J].Comp Biochem Physiol，2007，147（3）：367-377[2]Darias M J，Murray H M，Gallant J W，et al.The spatiotemporal expression pattern of trypsinogen and bile salt-activated lipase during the larval development of red porgy （Pagrus pagrus，pisces，Sparidae）[J].Mar biol，2007，152（1）：109-118[3]王镜岩.生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002[4]Buettner K，Kreisig T，Sträte N，et al.Protein surface charge of trypsinogen changesits activation 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固定化胰蛋白酶的制备研究
一、背景介绍
固定化酶技术是指将酶固定在载体上，形成固定化酶，以提高其稳定
性和重复使用性。
胰蛋白酶是一种重要的消化酶，常用于医药和食品
工业中。
因此，制备固定化胰蛋白酶具有重要的应用前景。
二、制备方法
1. 固定化胰蛋白酶的载体选择：常用的载体有凝胶、纤维素、硅胶等。
其中凝胶是最常用的载体。
2. 固定化方法：包括物理吸附、共价键结合和交联等方法。
其中，共
价键结合法是最常用的方法。
3. 制备步骤：
（1）将选好的载体与活性胰蛋白酶混合；
（2）加入交联剂进行交联反应；
（3）去除未固定的胰蛋白酶和交联剂；
（4）测定固定化后的活性。
三、影响因素
1. pH值：pH值对于固定化后的活性有较大影响，一般选择pH 7.0-8.0为最佳条件。
2. 温度：温度也是影响固定化后活性的重要因素。
一般情况下，选择
40℃为最佳条件。
3. 固定化时间：固定化时间对于固定化后的活性也有影响。
一般情况下，选择1-2小时为最佳条件。
四、应用前景
固定化胰蛋白酶具有较好的应用前景。
在医药领域，可以应用于制备消化酶剂和治疗胰腺疾病；在食品工业中，可以应用于酿造、发酵等过程中的蛋白水解反应。
五、总结
固定化胰蛋白酶的制备是一项重要的技术，在医药和食品工业中具有广泛的应用前景。
其制备方法包括载体选择、固定化方法和测定固定化后活性等步骤。
同时，pH值、温度和固定化时间等因素也对其活性产生影响。
