高效液相色谱法测定猪血清中的依维菌素

!$ 四川大学华西公共卫生学院 卫生检测学教研室（ 成都 %!&&’! ） ； "$ 四川大学华西药学院 药剂学教研室
# # 【 摘要】 # 目的# 建立猪血清中依维菌素 （ ()*+,*-.(/ ） 的高效液相色谱测定方法。方法 # 以 &0 &12 偏磷酸3甲 醇 （ 45 6 ） 沉淀猪血清蛋白后用乙酸乙酯提取依维菌素， 离心后取上清液用旋转真空蒸发器挥干溶剂， 用甲醇溶解 残渣后进样分析。色谱柱为反相 7!8 柱 （ 1 !,， "1& ,, 9 ’$ % ,,） ， 流动相为甲醇3水 （ :&5 !& ） ， 流速 ! ,; < ,(/， 紫 外检测波长为 "’1 /,。结果# 方法检出下限为 &$ &!& ,= < >， 线性范围为 &$ &!& ? "& ,= < >， 相对标准差为 &$ 482 ? 60 8"2 ， 加标回收率为 :’$ &2 ? !&&$ &2 。结论# 本法操作简便， 结果准确可靠， 适用于猪血清中微量依维菌素的 测定。 【 关键词】 # 高效液相色谱法# 猪血清# 依维菌素 【 中图分类号】 # @:480 % !"#"$%&’(#&)’ )* +,"$%"-#&’ &’ .&/ 0"$1% 23 4&/5 ."$*)$%(’-" 6&71&8 95$)%(#)/$(:53# !"#$ %&’()*+(,， -./ 0*1(,)23( " ，4#$ 5&)6*’，78/ !+(,)(&(,， %8#/9 :+，58 7+(,);&(< # !"#$%&’"(& )* +$(,&$%- ."/0()1)2-，3"4& 50,6 ($ +/0))1 )* 7891,/ :"$1&0，+,/08$( ;(,<"%4,&-，7A*/=BC %!&&’! ，7A(/D 【 ;2<#$(-#】 # =2>"-#&,"# EF *G.DH;(GA D A(=A I*+JF+,D/-* ;(KC(B -A+F,D.F=+DIA(- ,*.AFB JF+ .A* B*.*+,(/D.(F/ FJ ,(3 -+F3D,FC/. FJ ()*+,*-.(/ (/ I(= G*+C,$ ?"#5)8<# L)*+,*-.(/ (/ I(= G*+C, MDG *N.+D-.*B M(.A *.AO; D-*.D.* DJ.*+ .A* G*+C, I+F.*(/ MDG I+*-(I(.D.*B M(.A &$ &12 ,*.DIAFGIAF+(- D-(B3,*.AD/F; (/ .A* +D.(F FJ 45 6 （ P < P） $ EA*/ .A* GD,I;* MDG -*/3 .+(JC=*B D. ’&&& + < ,(/ JF+ 1 ,(/ D/B .A* GCI*+/D.* MDG *)DIF+D.*B .F B+O/*GG M(.A +F.D+O )D-CC, *)DIF+D.F+$ EA* +*G(BC*
# # 甲醇 （ 色谱纯） ； 乙酸乙酯 （ 分析纯） ； 偏磷酸 （分 析纯） ； 依维菌素标准储备液： 准确称取 &$ &1&& = 依 维菌素 （ 中国兽药监察所提供， 批号 TU6!":4 ） 于 "1 ,; 容 量 瓶 中， 加 甲 醇 溶 解 定 容， 此液质量浓度为 "0 && ,= < ,;。临用前， 用甲醇稀释成应用液。本实 验用水均为 S(;;(3V 纯水。 QR!!&& 液相 色 谱 仪 （ W=(;*/. 7F， XYW ） ；反 相 7!8 色谱柱 （ RA*/F,*/*N， XYW ） ： 1 !,， "1& ,, 9 ’$ % ,,； 色谱保护柱 （ RA*/F,*/*N， XYW） ； XP3"%& 紫外 可见分光光度计 （ 日本岛津） ； 离心机 （ 北京医用离 心机厂） ； @Z317 型旋转真空蒸发器（ 河南巩义市英 峪予华仪器厂） 。 D $ FE 实验方法 D $ F $ DE 色谱条件# 流动相： 甲醇3水 （ :&5 !& ） ， 流速 ! ,; < ,(/， 柱温 "1 [ ， 反相 7!8 色谱柱 （ 1 !,， "1& ,, 9 ’$ % ,,） 分离， 紫外检测波长为 "’1 /,。 D $ F $ FE 标准曲线绘制 # 取依维菌素标准应用液用 甲醇稀释成 &$ !& ,= < >，&$ "1 ,= < >， &$ 1& ,= < >， !$
图 !" 依维菌素标准色谱图 #$% !" &’( )’*+,-.+%*-, +/ $0(*,().$1 2.-13-*3
! ’ 4 ’ 5" 样品处理及测定 5 取猪血清 *’ !! ") 置于 *! ") 离心管中， 加 !1 !(6 偏磷酸7甲醇 （ + 8 9， :$ *’ !! ")， 漩涡混匀， 加 4’ !! ") 乙酸乙酯振摇 &!! :） 次提取， 4!!! ; $ ",- 离心 ( ",-。吸 取 乙 酸 乙 酯 层 91 !! ") 于 *! ") 离心管中， 于 4! < 水浴下用旋转 真空蒸发器挥干。加 !’ &! ") 甲醇旋涡振荡 * ",并超声 * ",- 溶解， 4!!! ; $ ",- 离心 ( ",- 后取上清 液进样 *!! !)。猪血清样品色谱图见图 & 。
［ +］ 4 ’ 4 ’ 4 " 沉淀剂及其用量的选择 5 根据文献 ， 本
!! "# $ %， &’ (! "# $ %， 在仪器基线达到平直后， 分别 进样 &! !)。依维菌素保留时间为 *+’ ! ",- 左右。 以进样量 （ .， -# ） 为横坐标， 峰面积 （ /） 为纵坐标， 计算线性回归方程。本标准曲线回归方程为 / 0 *1 +(. 2 !’ *& ， ! 0 !’ 3334 。依维菌素标准色谱图见 图 *。
# # 依维菌素是一种新型高效广谱抗寄生虫药， 对 线虫、 昆虫和螨虫等均有驱杀作用， 可用于防治家畜 和宠物的寄生虫病。其在体内有一定的蓄积性， 人 食用了这些家畜肉制品后， 依维菌素会对人体健康 产生危害。因此， 需测定动物血清中依维菌素的含 量。对于基体简单的样品如药片和注射液中依维菌 ［ ! 6］ 素含量的测定可用紫外分光光度法 和高效液 ［ ’］ 相色谱法 。血清样品基体复杂， 干扰成分多， 其 ［ 1， %］ 测定相对困难， 国外已有荧光衍生3QR>7 法 的 报道， 该法灵敏度高， 但衍生化步骤繁琐， 分析成本 较高。本研究利用 &0 &12 偏磷酸3甲醇 （ 4 5 6， P< P） 沉淀血清蛋白、 乙酸乙酯提取其中微量依维菌 素， 高效液相色谱法测定含量， 取得了较为满意的结 果。
法选用 !1 !(6 偏磷酸7甲醇 （ + 8 9， : $ :） 为血清蛋 白沉淀剂， 实验结果表明， 该沉淀剂沉淀效果好， 回 收率高。本法选用该沉淀剂用量为 *’ !! ")。 4 ’ 5" 方法考察及性能实验 4 ’ 5 ’ !" 检出限和线性范围 5 以两倍信噪比计算本 法样品的检出下限为 !’ !*! "# $ %。本法线性范围 至少为 !’ !*! = &! "# $ %。 4 ’ 5 ’ 4 " 方法精密度 5 将三种质量浓度 （ !’ &( "# $ %， *1 !! "# $ %， &’ (! "# $ % ） 标准溶液于同一天内连 续进样测定 ? 次， 得日内相对标准差， 见表 * 。
表 !" 方法精密度 &-98( !" :$.’$1;3-< *(8-.$0( 2.-13-*3 3(0$-.$+1 （ ,AB;"BCD,-） $ " "#・% 2 * !’ &( *’ !! &’ (!
图 4" 猪血清样品色谱图 #$% 4" &’( )’*+,-.+%*-, +/ 6$% 2(*7, 2-,68(
四 川 大 学 学 报（ 医 学 版 ） E FJJK ； LM （D） ： DLJ G 0&-51(’ H’&,（ ?"8 0-& I8&）
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高效液相色谱法测定猪血清中的依维菌素
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