产淀粉酶菌株的筛选及生理生化鉴定

产淀粉酶菌株的筛选及生理生化性质的鉴定一实验目的及要求：为了从自然界获得产淀粉酶活力较高的菌株,从面粉、储存面仓、发霉玉米等样品中筛选出1株产淀粉酶活力较强的菌，并对产淀粉酶菌的生理生化进行了探讨。

从面粉中得到的产淀粉酶菌共有三种，颜色有红色和白色。

从其菌体形态初步了解其特征，随后用唯一碳源实验、葡萄糖酵解实验、过氧化氢酶实验等分析并鉴定其生理生化特性。

二名词定义：淀粉酶分离鉴定淀粉酶 amylase，AMY,AMS一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶。

根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶（EC3．2．1．1．）与β-淀粉酶（EC3．2．1．2．）。

α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。

微生物的酶几乎都是分泌性的。

此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。

因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。

另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1,6-键的α-极限糊精。

一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。

β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。

主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。

对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。

作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。

从上述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用方式，分别提出α-1,4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（α-1,4-glucan 4-glucanohydrolase）和α-1,4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（α-1,4-glucan maltohydrolase）的名称等而被使用。

南昌大学实验报告淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定一、实验目的：1、学习从土壤中分离微生物的方法；2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。

二、实验原理：土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。

将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。

故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。

在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。

淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括a—淀粉酶和B -淀粉酶等，a -淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的a -1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。

淀粉遇碘呈蓝色。

这种淀粉- 碘复合物在660nm 处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。

随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定a -淀粉酶的活力。

三、实验器材及试剂：1、培养基：（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCI5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至，121C灭菌15min，待冷却至50C左右时，于超净工作台倒平板）（2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉20g, 硝酸钾1g, 磷酸氢二钾, 氯化钠, 硫酸镁, 硫酸亚铁, 琼脂20g, 水1000毫升，调整pH值到〜。

）（3）摇瓶培养：淀粉培养液。

2、试剂：碘液、2%可溶性淀粉、磷酸氢二钠- 柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、L 乙酸、%生理盐水。

3、器材：培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。

土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。

由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。

但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。

从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。

平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。

本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。

二、分离及纯化1、材料试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等器皿：移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱其他：报纸、纱布、棉花、面线绳2、方法2.1培养基与器皿的准备和灭菌（1）培养基的配制称量1.2克淀粉。

加少量水加热溶化，然后加入6.8克营养琼脂，加水至150毫升，煮沸后倒入250ml容量的三角瓶中，加棉塞后放入高温蒸汽灭菌锅内灭菌备用。

（2）无菌水的制备分别取9ml蒸馏水加入5支试管中，加塞后用报纸包扎捆绑，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。

取90ml蒸馏水加入250ml三角瓶中，同样的操作，灭菌备用。

（3）器皿的准备将刻度吸管用报纸包扎，培养皿装入专用灭菌杯分别放入高温灭菌箱灭菌备用。

2.2菌悬液的制备和梯度稀释取10g土壤样品加入90ml无菌水中震荡, 然后静置2分钟。

取六只试管编号1—6分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml 上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作六个试管，得到10ˉ1—10ˉ6六个稀释度的菌悬液。

淀粉酶产生菌的筛选注意事项淀粉酶是一种重要的酶类，在食品加工、制药和生物技术等领域有着广泛的应用。

而淀粉酶产生菌则是淀粉酶发酵的关键微生物，因此筛选合适的淀粉酶产生菌对于淀粉酶的生产至关重要。

下面将从以下几个方面介绍淀粉酶产生菌的筛选注意事项。

一、筛选前的准备工作1. 确定筛选目标：在进行淀粉酶产生菌筛选之前，需要明确自己所需要的菌株特性，如产量、稳定性、适应性等。

2. 了解基础知识：在筛选之前需要对淀粉酶发酵过程中微生物代谢途径、营养需求等基础知识有一定了解，以便于更好地设计实验方案。

3. 准备培养基：根据所需菌株特性选择合适的培养基，并进行消毒和质量检测。

二、筛选方法选择1. 传统方法：传统方法包括平板法、液体培养法等，这些方法简单易行，但筛选效率较低。

2. 高通量筛选：高通量筛选方法可以同时对大量菌株进行筛选，具有快速、高效的优点，但需要较高的设备和技术要求。

3. 分子生物学方法：分子生物学方法通过扩增和检测目标基因来确定淀粉酶产生菌，具有高灵敏度、高特异性和快速等优点。

三、菌株的来源选择1. 野生菌株：采集自然环境中的微生物进行筛选，可以获得多样性较高的菌株，但需要进行适应性培养和改良。

2. 已知菌株：已知菌株包括文献报道的、已经商业化应用的等，在筛选时可以优先选择这些已知稳定可靠的菌株。

3. 自体分离：自体分离是指从淀粉酶发酵中分离出产酶微生物进行筛选，这种方法具有与发酵过程相适应、稳定性好等特点。

四、实验设计与操作注意事项1. 设计合理实验方案：实验方案需要考虑到微生物营养需求、培养条件等因素，同时需要进行对照实验和重复实验以确保结果的可靠性。

2. 严格控制操作条件：操作过程中需要严格控制温度、pH值、氧气含量等因素，以确保微生物的正常生长和代谢。

3. 合理选择筛选指标：筛选指标需要与淀粉酶产生相关，如淀粉酶活力、淀粉酶产量等。

4. 筛选后的确认和评价：在筛选出淀粉酶产生菌后，需要进行进一步的确认和评价，包括菌株稳定性、代谢途径分析等。

土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。

2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。

3．掌握分离纯化微生物的方法。

4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。

二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。

在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。

24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。

然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。

枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。

三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。

高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。

3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。

2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。

产淀粉酶菌株的分离及筛选摘要：【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。

2了解产淀粉酶菌株的分离方法。

3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。

【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂.。

【实验目的】1学习从土壤等环境中分离微生物的技术。

2了解产淀粉酶菌株的分离方法。

3观察产淀粉酶菌的形态特点，并分析不同条件下酶的特性。

【实验原理】淀粉酶广泛在于动植物和微生物中，是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。

淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域。

在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程均有重要价值，如添加高温淀粉酶可提高啤酒质量，中温蒸煮条件下添加适当耐高温a-淀粉酶可提高糖化率及酒精出酒率，降低甲醇含量，提高酒精质量，同时可提高设备利用率等。

淀粉酶在面包焙烤过程中分解淀粉产生的可溶性糖被酵母转化成酒精和CO2气体，不仅能增加面包体积，同时还有改善面包表皮色泽、提高面包软度、延长保质期的作用，对面包冷却和冷冻也有重要作用。

由于微生物数量多，繁殖快，工业生产主要采用向生物发酵法大量生产该制剂。

本实验从土壤中分离的淀粉酶产生菌从温度、pH值两方面探讨其产酶的最适条件。

通过平板培养法，从样品中初步分离出淀粉产生菌株，再通过单菌落培养从而获得比较纯的菌种。

然后对其进行二级扩大培养，最终测定液体培养基菌液中被酶分解得到的葡萄糖含量来讨论菌株的最适条件（温度、pH值等），为工业街道淀粉酶及饲料添加剂提供候选菌株。

【仪器、材料和试剂】（一）仪器1、恒温培养箱2、高压蒸气灭菌锅3、摇床4、恒温水浴锅5、生物显微镜6、电子天平（二）材料样品一：存放过久发霉的麦芽和周围粉尘样品二：米饭生产线附近草坪上的土壤（三）试剂与器材1、锥形瓶（50ml、100ml、500ml等）2、培养皿（25个左右）3、大小试管（30个左右）4、移液枪（1000μl、100μl）及大小枪头若干5、酒精灯、接种针等6、牛肉膏或酵母膏7、蛋白胨8、NaCl9、可溶性淀粉10、琼脂11、卢戈氏碘液11、草酸铵结晶紫12、碘液13、95%酒精14、蕃红染色液15、蒽胴试剂（现配）16、葡萄糖标准液(0.1 g/L)实验环节1 产淀粉酶菌株的初筛【实验步骤】1、称取一个样品5g，倒入盛有45mL无菌水带塞的三角锥形瓶中，摇床振荡30min制成样品悬液记为10-1土壤稀释液；2、用无菌移液管吸取10-1的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中吹吸数次混匀即为10-2稀释液，照此方法分别制成10-2~10-9稀释液；3、分别取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9土壤稀释液各0.5mL，涂布于平板培养基表面，一个稀释度涂布接种2块平板，37℃下恒温培养16h ；4、待长出菌落后滴加卢戈氏碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，作为初筛菌株。

实验一淀粉酶产生菌的筛选一、实验要求：1、写出完整的分离纯化淀粉酶产生菌的实验步骤；2、写出分离培养基及其相关试剂所需的量、仪器、器皿所需的量；3、掌握从土壤分离酵母菌的方法和技术，从样品中分离出所需菌株；4、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养淀粉酶产生菌的培养条件和培养时间。

二、实验原理：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌三、实验材料：1.培养皿、移液管、刮铲、显微镜等,2.可选取厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤 ;3.培养基与试剂 :牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、蒸馏水、琼脂粉。

四、实验步骤：1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤5g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。

土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。

2、培养基的配置，(1)分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉pH调至7.2121℃灭菌15min待冷却至50℃左右时于超净工作台倒平板。

注:先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状再加到溶化好的培养基中调匀; (2)分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。

3、取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土壤悬液,此时的稀释度为10-1。

另取7支试管分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度每支试管内加入9mL无菌水。

用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀,再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中,依此类推直至10-7试管。

从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定试验一、实验目的1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法；2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练；3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。

4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。

二、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽抱杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。

待实验前取样即可。

2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。

在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。

3、芽抱是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽抱最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。

它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。

细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽抱，再在80-90 C温度下杀死菌体，可使芽抱得到富集。

4、芽抱杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25C到75C以上；最低生长温度大约5C到45C；生长最低pH值，从一8到2左右；耐盐范围从低于2%勺NaCI到25%NaC；营养明胶(22°C) 7天内液化1厘米或1厘米以上。

枯草芽抱杆菌和地衣芽抱杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。

5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽抱杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。

土壤中产淀粉酶细菌菌株的筛选张路、彭亚娣、吴亚琴、王思怡、蒲兰琼、陶蕾摘要土壤中含有多种微生物，通过选择培养基可将需要的微生物从中分离出来。

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。

由于不同微生物对营养物质的要求不同，可在培养基中加入或减少某种物质以营造一个只适于所选微生物生长而抑制其他微生物生长的环境，便可淘汰不需要的微生物，分离出所需微生物。

可用平板法分离土壤中产淀粉酶的微生物。

关键词培养基、微生物、分离、平板法（一）引言自然界中各种微生物混杂生长在一起，即使取很少量的样品也会有很多微生物共生在一起。

人们要想研究某种微生物的特性或要确定每种微生物菌株的分类，首先应该对该微生物进行纯培养。

稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，这几种方法不需要特殊的仪器设备，操作比较简单，一般情况下就能得到比较好的效果。

土壤中含有各种微生物，将含有微生物的土壤制成菌悬液，用十倍递减稀释法稀释后涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，在适宜的条件下培养，待长出菌落后，从各个菌落上挑取单菌种接种到淀粉培养基上，适宜条件下培养，长出菌落后，在各个菌落上滴加碘液，菌落周围如出现无色透明圈，说明淀粉被酶解，即该细菌菌株能产淀粉酶。

我们分离得到产淀粉酶的细菌后可快速高效的生产淀粉酶，以运用到实际生活中，如制淀粉酶片，以助含淀粉酶事物的消化。

（二）人员安排1、包装器材、配培养基（1）配培养基牛肉膏蛋白胨培养基：陶蕾、吴雅琴淀粉培养基：蒲兰琼、王思怡（2）无菌水：彭亚娣、张路（3）包扎：彭亚娣、张路、王思怡、蒲兰琼2、高压灭菌高压灭菌过程中彭亚娣、吴雅琴全程看守，控制阀门的开和关3、制菌悬液、第一次接种（1）取土：陶蕾、吴雅琴（2）配液：王思怡、吴雅琴、张路（3）接种：陶蕾、彭亚娣、吴雅琴、蒲兰琼4、第二次接种（转接）转接:吴雅琴、彭亚娣、王思怡、张路、蒲兰琼、陶蕾5、检测滴定：吴雅琴、彭亚娣、王思怡、张路、蒲兰琼、陶蕾6、结果分析：陶蕾、吴雅琴7、拍照：王思怡、陶蕾、张路8、资料搜集：张路、陶蕾（三）材料与方法1、材料已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏1.5ｇ、蛋白胨2.5ｇ、琼脂10ｇ、NaCl 0.5ｇ、水500ml、pH 7.0～7.2）、已灭菌的淀粉培养基（蛋白胨2.5ｇ、淀粉1.5ｇ、NaCl 0.5ｇ、琼脂10ｇ、pH7.2～7.4）、90ml无菌水一瓶、含9ml无菌水的试管6支、无菌培养皿18个、1ml 无菌移液管、土壤样品、天平、称量纸、试管架、涂布器、500ml烧杯2个等。