中药材川贝母DNA指纹鉴定

分子生物学方法鉴别川贝母及饮片的技术要点探析中药是我国的传统药物，在临床和日常保健中有着越来越广泛的应用。

中药材和中药饮片的质量关系到临床治疗的安全有效，对我国中医药产业的快速健康发展也至关重要。

中药材和饮片的真伪鉴别一直是行业关注的焦点之一，随着生命科学技术飞跃发展，多种分子生物学技术被逐步运用于药用动植物及中药材的基源鉴定，取得较好的效果。

《中国药典》自2010年版起，均收载了中药材和饮片（如蕲蛇、乌梢蛇和川贝母）的分子生物学方法，是采用新技术、新方法控制中药质量的有益尝试。

标准已执行4年，但兄弟单位普遍反映在检验过程中常遇到各种技术问题，无法解决。

本文以川贝母的分子生物学鉴别为例，通过总结实验过程中需要注意的技术要点以及常见问题，旨在为即将或正在从事这项检验工作的同仁们提供经验以供参考，以便更高效顺利地完成实验。

[Abstract]Traditional Chinese Medicine is traditional medicine of china，which has extensive use in clinic treatment and daily health-care.The quality of Chinese medicinal materials and Traditional Chinese Medicine decoction pieces relates greatly to the clinical curative effect and security，which is also very important to the development of Traditional Chinese Medicine property.The identification of Chinese medicinal materials and Chinese medicinal decoction pieces is a focal point in traditional Chinese medicines profession，with the development of life science and technology leap，a variety of molecular biology technology is gradually used in medicinal plants and animals and the base source identification of Chinese Medicinal Materials，achieved good results.The “Pharmacopoeia of the People′s Republic of China” since 2010，contains the Chinese medicinal materials and medicinal slices （e.g，Agkistrodon，wu pin snakes and Fritillaria cirrhosa）molecular biology method，is to adopt new technology，new method to control the quality of traditional Chinese medicine.Standard has been four years，but brother units generally reflect the various technical problems encountered in the inspection process，it can′t solve.Identification based on the molecular biology of Fritillaria cirrhosa，for example，by summing up the main points that need to pay attention to the process of technology and common problems，aiming at will or are engaged in the inspection work colleagues to provide experience for reference，so that more efficient to complete the experiment successfully.[Key words]Molecular biology；Fritillaria cirrhosa；Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism中药作为中华民族的传统用药，在临床和日常保健中有着越来越广泛的应用。

2020年版,中国药店中贝母食用的分子鉴定方法(一)2020年版中国药店中贝母食用的分子鉴定介绍中国药店中的贝母作为一种常用药材，被广泛用于药膳和中药制剂中。

然而，由于贝母的外表与其他植物相似度较高，因此需要进行分子鉴定以确保其纯正度和质量。

本文将介绍一些常用的方法，用于2020年版中国药店中贝母食用的分子鉴定。

方法一：核磁共振波谱（NMR）•优点：核磁共振技术是一种非破坏性的分析方法，可以提供关于物质结构和组成的详细信息。

对于贝母的分子鉴定来说，核磁共振波谱具有高分辨率和高灵敏度的优势。

•操作步骤：1.提取贝母样品中的化合物。

2.使用核磁共振仪获取样品的核磁共振波谱。

3.通过比对已知结构的标准谱图，确定贝母中存在的化合物。

方法二：液相色谱质谱联用（LC-MS）•优点：液相色谱质谱联用是一种常用的化学分析方法，可以在复杂基质中准确地分析出化合物。

对于贝母的分子鉴定来说，液相色谱质谱联用具有高准确度和高灵敏度的优势。

•操作步骤：1.提取贝母样品中的化合物。

2.使用液相色谱质谱联用仪器进行分析。

3.通过比对已知化合物的质谱图和色谱图，确定贝母中存在的化合物及其相对含量。

方法三：DNA条形码•优点：DNA条形码是一种基于物种特异性基因序列的分析方法，可以快速、准确地鉴定物种。

对于贝母的分子鉴定来说，DNA条形码可以识别植物的特异性序列，确认是否为贝母及其品种。

•操作步骤：1.从贝母样品中提取DNA。

2.选择合适的DNA条形码序列进行扩增。

3.通过测序和与数据库比对，确定贝母样品中的物种和品种。

方法四：高效液相色谱（HPLC）•优点：高效液相色谱是一种常用的分离和分析技术，可以在复杂混合物中分离出化合物。

对于贝母的分子鉴定来说，高效液相色谱可以鉴定贝母中的化合物及其相对含量。

•操作步骤：1.提取贝母样品中的化合物。

2.使用高效液相色谱仪进行分析。

3.通过比对标准品的保留时间和峰形，确定贝母中存在的化合物及其相对含量。

PCR-RFLP定量检测川贝母真伪的研究赵仲麟;常志远;袁超;李瑞歌;王成;王永;兰青阔【摘要】建立了一个适合中药材川贝母的聚合酶链式反应-限制性内切酶(PCR-RFLP)的分子鉴定方法.以提取的DNA为模板进行PCR扩增和酶切反应,真品川贝母扩增产物含有Sam Ⅰ酶切位点,在100～250 bp之间存在明确的2条酶切条带,而伪品贝母扩增序列中没有Sam Ⅰ酶切位点不能被切出.此外,还基于PCR-RFLP 技术针对川贝母真伪性进行了相对定量分析研究.结果表明,含量10％及以上的真品川贝母能被稳定检测出.%In this study,a molecular identification method of polymerase chain reaction restriction endonuclease (PCR-RFLP) was developed for identification of Fritillariae cirrhosae bulbus.The extracted DNA was used as the template for PCR amplification,and the amplification products were digested with endonuclease.Because Fritillariae cirrhosae bulbus has Sam Ⅰ cut site,2 distinct bands between 100 bp to 250 bp could be observed.However,the pseudo Fritillaria could not be cut.Based on the PCR-RFLP technique,the relative quantitative analysis standardization of Fritillariae cirrhosae bulbus was also studied.The results showed that products containing 10％ or more authentic Fritillariae cirrhosae bulbus could be detected.【期刊名称】《河南农业大学学报》【年(卷),期】2018(052)002【总页数】5页(P249-253)【关键词】川贝母;分子鉴定;PCR-RFLP【作者】赵仲麟;常志远;袁超;李瑞歌;王成;王永;兰青阔【作者单位】河南农业大学理学院,河南郑州 450002;浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华 321004;河南农业大学理学院,河南郑州 450002;河南农业大学理学院,河南郑州 450002;天津市农业质量标准与检测技术研究所,天津 300381;天津市农业质量标准与检测技术研究所,天津 300381;天津市农业质量标准与检测技术研究所,天津 300381【正文语种】中文【中图分类】R927.1浙贝母(Fritillariae thunbergi bulbus.) 和平贝母(Fritillariae ussuriensis bulbus.)均为传统常用中药，为百合科贝母属的干燥鳞茎，具有止咳化痰的作用，与川贝母同属贝母属。

第12卷第6期北华大学学报（自然科学版）Vol．12No．62011年12月JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY （Natural Science ）Dec．2011文章编号：1009-4822（2011）06-0662-04中药材贝母DNA 不同提取方法的比较王淼1，谭莹2，张丽华2（1．北华大学医学检验学院，吉林吉林132013；2．北华大学药学院，吉林吉林132013）摘要：目的探讨中药材贝母DNA 的不同提取方法，为中药贝母的分子生物学鉴定提供参考．方法利用苯酚法、CTAB 法、SDS 法从中药贝母中提取DNA ，通过紫外分光光度和琼脂糖凝胶电泳对所得DNA 样品含量及纯度进行检测．结果利用3种不同的方法提取，药材贝母DNA 的A 260/A 280在1．80ʃ0．23左右．结论利用3种不同DNA 提取方法，均可从贝母样本中提取得到DNA ，且CTAB 法提取贝母的DNA 含量高、纯度好．关键词：贝母；DNA 提取；中药中图分类号：Q503；R282．5文献标志码：A收稿日期：2011-09-04作者简介：王淼（1976－），女，实验师，主要从事分子生物学技术在药物质量控制上的应用研究；通信作者：张丽华（1957－），女，教授，硕士生导师，主要从事分子生物学技术在药物质量控制上的应用研究．Comparative Study of Different Extraction Methods for the Isolationof DNA from Traditional Chinese Medicine FritillariaWANG Miao 1，TAN Ying 2，ZHANG Li-hua 2（1．Medical Inspection College of Beihua University ，Jilin 132013，China ；2．Pharmaceutical College of Beihua University ，Jilin 132013，China ）Abstract ：Objective To discuss the different extraction methods for the isolation of DNA from traditionalChinese medicine fritillaria and provide the reference for the molecular biology appraisal of the traditional Chinese medicine fritillaria．MethodThe Phenol ，CTAB and SDS methods were used to isolate DNA from the traditionalChinese medicine fritillaria ，and ultraviolet spectrophotometry and agarose gel electrophoresis were used to examine DNA content and quality．Results The ratios of A 260/A 280for DNA were between 1．80ʃ0．23with three different extraction methods．ConclusionThe three methods can be used for the extraction of DNA fromfritillaria．The CTAB method is the best method for the extraction of DNA from fritillaria ，and the DNA with highest content and purity from fritillaria can be got with this method．Key words ：Fritillaria ；DNA extraction ；traditional Chinese medicine 目前，分子生物学技术已被广泛应用于中药材鉴定、提取等方面［1-3］，DNA 的提取和纯化是中药材研究的重要基础，因此，简洁有效地提取高纯度、大量的DNA 是对中药材实施分子标记、基因文库构建、基因分离及其遗传转化和鉴定的重要前提．然而多数中药材经过加工处理后，药材中的DNA可能会受到不同程度的降解，不利于保持DNA 的完整性．再者，中药材中因含有次生代谢产物很难与DNA 分开，会直接影响中药材DNA 的提取及后续研究．如何能够快捷有效地提取到高质量、合格的DNA ，一直是生物技术研究者关注的问题．同一中药材用不同方法提取的DNA 纯度和提取率也不尽相同，不同中药材用相同方法提取DNA其结果也不同［4-5］．我们参考前人的工作，从中筛选了3种方法［6-8］，并稍加改进，以中药材贝母为研究对象，对3种不同方法的提取浓度、效率等方面进行了特定的比较，从中选出最佳的提取方法，为中药材贝母的分子生物学鉴定提供参考．1材料与仪器1．1药材浓蜜贝母（F．mellea）、瓦布贝母（F．wabue nsis）、青贝（F．prezwalskii Maxim）、松贝（F．unibracteata Hsiao et K．C．Hsia）鲜品（四川省茂县科技局提供）；平贝母（F．ussuriensis）、浙贝母（F．thunbergii．Miq）、湖北贝母（F．hupehensis Hsiao et K．C．Hsia）干品（中国药品生物制品检验所提供）．1．2试药CTAB、PVP、Tris、β-巯基乙醇、EDTA、SDS、10ˑPCR buffer、游离脱氧核苷三磷酸dNTPs、Taq DNA Polymerase（1000U）、DGL2000DNA Marker（北京鼎国生物技术公司）；100bp DNA Ladder（北京天根生化科技公司）；琼脂糖（England）；其他化学试剂均为分析纯；引物由生工生物（上海）有限公司合成；无菌双蒸水（自制）．1．3仪器GL-20G-Ⅱ型变速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；WD-9403C型紫外分析仪（北京市六一仪器厂）；9700型PCR扩增仪（ABI）；JY600C型双稳定时电泳仪（北京市君意东方电泳设备有限公司）；紫外凝胶成像自动分析仪（美国Cold Spring 公司）；紫外/可见分光光度计（Pharmacia4000）．2样品DNA提取方法2．1苯酚法参考文献［9］的方法，并做适当改进．称取各种样品0．1g，充分研磨后放入10mL离心管中，加入2．5mL的缓冲溶液A（50mmol/L Tris-HCl pH8．0，10mmol/L EDTA，5mmol/Lβ-巯基乙醇，2%SDS），混匀，37ħ水浴振荡过夜．室温，10000r/min离心10min．取上清液，加等体积的水饱和酚溶液（pH8．0），反复混匀，室温下作用20min．将混合液移入另一干净的离心管中，室温，10000r/min离心10min．取上层水相，先用酚-氯仿-异戊醇（25241，体积比），再用氯仿-异戊醇（241，体积比）各抽提1次，直至无白色中间层．将上清液移入离心管，加入等体积异丙醇混匀，于－20ħ放置30min．室温，12000r/min离心5min，得DNA絮状沉淀，用70%乙醇洗2次，再加入适量TE溶解，放入0．5 1μL RNaseA37ħ水浴中反应1 2h，4ħ保存．2．2CTAB法参考文献［10］的方法，并做适当改进．取各种样品0．1g，充分研磨后转移至离心管中，加入2ˑCTAB（1．4mol/L NaCl，100mmol/L Tris pH8．0，20mmol/L EDTA pH8．0，2%PVP，2%CTAB，3%β-巯基乙醇）200μL，混匀，65ħ水浴保温1h，期间不断震荡．4ħ，12000r/min离心10min．吸取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇（241，体积比）抽提2 3次，10000r/min离心5min．取上清液加2/3体积的无水乙醇，混匀后－20ħ放置1h沉淀核酸．4ħ，10000r/min离心5min，弃上清，得到DNA絮状沉淀．沉淀物用80%乙醇和无水乙醇分别漂洗两次，室温晾干，放入适量的植物TE缓冲液溶解，放入0．5 1μL RNaseA37ħ水浴中反应1 2h，4ħ保存．2．3SDS法参考文献［11］的方法，并做适当改进．取各种样品0．1g，充分研磨后转移至离心管中，加入DNA提取液（25mmol/L Tris-HCl pH8．0，50mmol/L EDTA，0．5%SDS，0．2%β-巯基乙醇）0．5mL，56ħ水浴保温30min．4ħ，12000r/min离心10min．吸取上清液，加入等体积的苯酚-氯仿（11，体积比）抽提2次，12000r/min离心5min．取上清液加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，4ħ，12000r/min离心5min，弃上清液，室温晾干后，放入适量的植物TE缓冲液溶解，再加入0．5 1μL RNaseA37ħ水浴中反应1 2h，4ħ保存．2．4DNA的纯度、产率检测将利用3种方法提取得到的模板DNA适当稀释后，用紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸光度A260和A280，以A260/A280的比值鉴定纯度，并计算DNA的浓度（见表1）．2．5DNA琼脂糖凝胶电泳检测将利用3种方法提取得到的DNA与6ˑLoading buffer（31，体积比）溶液混匀点样于0．8%琼脂糖凝胶板上，电压90V，电泳30min，并经紫外线检测拍照（见图1 3）．3结果3．1DNA纯度及浓度检测结果用苯酚法、CTAB法、SDS法提取的中药材贝母DNA的A260/A280为1．80ʃ0．23，表明3种方法366第6期王淼，等：中药材贝母DNA不同提取方法的比较均能提取得到一定量的DNA ，且DNA 的纯度较好，见表1．表17种贝母DNA 的纯度和浓度检测结果Tab．1Results of DNA purity and concentration from seven FritillariasSample Phenol method c （A 260/A 280）/（g ·L －1）CTAB method c （A 260/A 280）/（g ·L －1）SDS methodc （A 260/A 280）/（g ·L －1）F．mellea 1．7391．5051．6511．6812．2241．145F．wabuensis 1．6741．5151．6571．7431．8121．313F．prezwalskii Maxim 1．8001．7101．5951．6621．6000．770F．unibracteata 1．7801．6201．6251．6411．0091．204F．ussuriensis 1．7061．3651．6031．7142．0090．609F．hupehensis Hsiao 1．7351．4051．6001．6932．0790．627F．thunbergii．Miq1．7581．4151．6671．6901．6001．1803．2DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱通过比较，苯酚法、CTAB 法、SDS 法提取DNA 效果较好，片段长度大小一致，RNA 去除干净，并且没有出现DNA 大量降解的情况（见图1 3）．图1苯酚法贝母样品DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱Fig．1Agarose gel electrophoresis of FritillariaDNA extracted with Phenolmethod图2CTAB 法贝母样品DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱Fig．2Agarose gel electrophoresis atlas of FritillariaDNA extracted withCTAB图3SDS 法贝母样品DNA 琼脂糖凝胶电泳图谱Fig．3Agarose gel electrophoresis of FritillariaDNA extracted with SDS4讨论植物中药材不同于动物中药材，除了具有细胞壁外，还含有大量的多糖、脂质、色素和酚类等物质，同时大多数DNA 在细胞中是与蛋白质结合在一起的，给DNA 的提取和纯化带来许多困难．因此，在分离和纯化DNA 时解聚核蛋白和去除蛋白质、酚类和多糖等物质是很重要的一步，而不同中药材所含有的干扰成分及DNA 结合的蛋白质的数量、成分、牢固程度有所不同，故用不同的方法提取不同植物中药材的DNA 效果不一样．苯酚法是DNA 提取中应用较为广泛的方法，其对新鲜样品的提取效果比较好（见图1），但DNA 的质量没有改善（见表1），其原因可能是氯仿、苯酚等改变不了酚类、多糖等对DNA 质量的影响．此外，实验过程中饱和酚容易氧化，平衡时操作较为繁琐．CTAB 是一种阳离子去污剂，可以破坏植物细胞壁，以利于细胞内容物的释放．此外，CTAB 还可与DNA 结合形成复合物，有利于将DNA 与变性蛋白质及多糖分开．PVP 是一种高分子合成树脂，能络合多酚物质，防止酚类化合物氧化成醌类，避免溶液变褐而具有抗氧化作用，并且可直接通过离心或氯仿-异戊醇抽提去除．从本实验来看，CTAB 法对于许多新鲜植物DNA 的提取是较为适用的，但对干品中药材的DNA 的提取纯度相对不高（见图2）．SDS 也是去污剂，可直接裂解细胞，使其释放出核DNA ，其DNA 的质量还可以，但是产量很低，同时SDS 法存在拖尾和杂质污染现象（见图3）．通过3种不同方法对中药材贝母DNA 提取效果的比较可知：各种提取方法本身均具有不同的特点和优缺点，而这3种方法中，CTAB 法提取效率高，操作简便，所需器材和设备的要求不高，无污染，且试剂经济实惠（大多为国产试剂），最适合于中药材贝母DNA 的提取．参考文献：［1］National Pharmacopoeia Committee．Ministry of Health466北华大学学报（自然科学版）第12卷Standards for Pharmaceuticals ［S ］．Traditional Chinese Medicine Preparations Volume Sprayed ，2005：25．［2］CAI ZH ，LI Ping ，DONG T X ，et al ．Fritillaria Identifi-cation Methods in Molecular Biology Research ［J ］．Pharmaceutical University ，2000，35（4）：309-312．［3］CAO Hui ，BI PX ，SHAO P．Identification of Chinese Drug“Herbal Elephantopi ”by DNA Fingerprinting Using Random Primer PCR ［J ］．Herbs ，2005，20：643．［4］Welsh J ，Mcclelland M．Fingerprinting Genomes UsingPCR with Arbitrary Primers ［J ］．Nuel Acids Res ，2000，18：7213-7216．［5］ZHOU Zuo-bin ，GE Gang．Identify Genuine MedicinalAterials by the DNA Molecule ［J ］．Jiangxi Science ，2006，26（3）：508-510．［6］GONG B Q．Research Progress on the IdentificationMethods of Fritillaria ［J ］．Journal of Anhui Agri Sci ，2009，37（4）：1603-1604．［7］CAI PX ，Woohok-sin ，Wongman-sau ，et al ．Genotyping andSpecies Identification of Fritillariaby DNA Chips ［J ］．Acta Pharmaceutica Sinica ，2003，38（3）：185-190．［8］LU S D．Modern Molecular Biology Experiment Techno-logy ［M ］．Beijing ：Higher Education Publishing House ，2003：365．［9］内宫博文，田仲可昌，杉浦昌弘，等．植物基因工程技术［M ］．上海：上海科学技术文献出版社，2005：3．［10］Murray M G ，Thompson W F．Rapid Isolation ofMolecular Weight Plant DNA ［J ］．Nucl Acids Res ，1980，8：4321-4325．［11］Angelo Karakousis ，Peter Langridge．A High-throughputPlant DNA Extraction Method for Marker Analysis ［J ］．Plant Molecular Biology Reporter ，2003，21（1）：95．【责任编辑：陈丽华櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴】本刊声明来稿要求一式两份（一份为打印稿，另一份为电子稿）．来稿一律不退，请自留底稿．切勿一稿多投，来稿在六个月内未接到录用通知可自行处理．为适应我国信息化建设的需要，扩大作者学术交流的渠道，本刊所刊文章的全文通过《中国期刊网（CNKI ）》、《万方数据-中国数字化期刊群》和《中文科技期刊数据库》入网．作者著作权使用费与本刊稿酬一次性给付．如作者不同意将文章编入光盘及上网，请在来稿时声明，本刊将做适当处理．566第6期王淼，等：中药材贝母DNA 不同提取方法的比较。

DNA指纹图谱——辨别中药真伪的试金石假如你花费几千甚至几万元购买的一根所谓“野山人参”经专家鉴定是伪品；假如你因中药材伪品的混入而发生有害的药物反应。

你是否会想到，要是有一种能从本质上鉴别中药真伪的技术该有多好！是的，随着分子生物学的飞速发展，这种能从DNA分子水平上鉴别中药真伪的技术已经出现，这就是DNA指纹图谱技术。

一、溯流求源——追踪指纹图谱每个人的指纹都是各不相同的，根据指纹的不同，可以将不同的人区别开来。

如果能从不同种属的中药材中找出代表其自身特征的指纹，那么，就可以象鉴别人类的指纹一样，将不同种属的中药材区别开来。

怎样去寻找中药材的特征指纹呢？或者说怎样的指纹才能代表中药材自身本质的特征呢？绝大多数的中药材都是植物体、动物体和菌物体，而一切生命体都可以从基因水平或者说DNA水平上进行刻划，因此，最能从本质上表征中药材自身特征的就是DNA分子水平上的指纹。

十个手指非一般齐，这种现象说明十指的长度不同，也就是具有长度多态性。

最早的DNA指纹研究始于二十世纪八十年代初期，是一种称作限制性片段长度多态性（英文缩写RFLP）的技术。

在细胞中有一种特殊的酶——限制性核酸内切酶，它可以把DNA切割成长度不同的片段。

这种酶有一个特点，就是它只能在DNA的特定位点上进行切割，而且，只能识别这些特异的位点。

在长期的进化过程中，不同种属的生物体中DNA上的这些限制性核酸内切酶的切割位点是各不相同的，因此，当用一种限制性核酸内切酶对某种生物体DNA进行切割时，就会产生一系列长度不同的酶切片段，形成该种生物特异的DNA指纹图谱，这种指纹图谱就叫做RFLP图谱。

不同种生物的RFLP图谱是不同的，根据RFLP图谱就可以进行中药材的品种鉴定。

DNA是由四种不同的脱氧核苷酸相互连接而成的双螺旋长链。

在DNA中的许多部位上是由几个或几十个核苷酸序列片段重复串联而成的，这些部位的DNA就叫做微小卫星DNA。

不同种生物的串联重复序列的位置是不同的，而且，串联重复的长度也是不同的。

分子生物技术在川贝母鉴别中的应用展望*喻莹1**陈建伟2***陈志禹2（1. 浙江中医药大学杭州 310053；2. 宁波市药品检验所 浙江宁波 315000）摘要川贝母是中国最常用的化痰止咳贵重药草，贝母属植物种类繁多，各种属来源复杂，川贝母与其混伪品之间鉴别困难，近年来分子生物技术在川贝母鉴定中开始了大规模的应用研究，如PCR-RFLP、PCR-RAPD、SSR、PCR-ISSR、qPCR、DNA条形码、SNP、PCR-AFLP等技术的应用，并且展现出较好的应用前景。

关键词 分子生物技术川贝母鉴别中图分类号：R282.5 文献标志码：A 文章编号：1006-1533(2021)05-0073-04Prospect of the application of molecular biotechnologyin identification of Fritillaria cirrhosa*YU Ying1**, CHEN Jianwei2***, CHEN Zhiyu2(1. Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310053, China;2. Ningbo Institute for Drug Inspection, Zhejiang Ningbo 315000, China)ABSTRACT Bulbus Fritillariae cirrhosae is phlegm cough precious herbs that is the most commonly used in China. There are many different kinds of plants of the genus Fritillaria and the sources of various genus are complex. The identification between Bulbus Fritillariae cirrhosae and the adulterants are difficult. Molecular biotechnology has begun a large-scale study in identification of Bulbus Fritillariae cirrhosae in recent years, such as PCR-RFLP, PCR-RAPD, SSR, PCR-ISSR, qPCR, DNA barcoding, SNP, PCR-AFLP and other technologies and shows a good application prospect.KEY WORDS molecular biotechnology; Bulbus Fritillariae cirrhosae; identification川贝母是百合科贝母属多年生草本植物，有淸热润肺，化痰止咳，散结消痈的功能。

川贝母检验操作规程执行标准：《中国药典》2020年版一部规程：1【性状】1.1松贝呈类圆锥形或近球形，高0.3～0.8cm，直径0.3～0.9cm。

表面类白色。

外层鳞叶2瓣，大小悬殊，大瓣紧抱小瓣，未抱部分呈新月形，习称“怀中抱月”；顶部闭合，内有类圆柱形/顶端稍尖的心芽和小鳞叶1～2枚；先端钝圆或稍尖，底部平，微凹入，中心有1灰褐色的鳞茎盘，偶有残存须根。

质硬而脆，断面白色，富粉性。

气微，味微苦。

1.2 青贝呈类扁球形，高0.4～1.4cm。

直径0.4～1.6cm。

外层鳞叶2瓣，大小相近，相对抱合，顶部开裂，内有心芽和小鳞叶2～3枚及细圆柱形的残茎。

1.3 炉贝呈类扁锥形，高0.7～2.5cm，直径0.5～2.5cm中。

表面类白色或浅棕黄色，有的具棕色斑点。

外层鳞叶2瓣，大小相近，顶部开裂而略尖，基部稍尖或较钝。

1.4 栽培品呈类扁球形或短圆柱形，高0.5～2cm，直径1～2.5cm。

表面类白色或浅棕黄色，稍粗糙，有的具浅黄色斑点。

外层鳞叶2瓣，大小相近，顶部多开裂而较平。

2【鉴别】（1）本品粉末类白色或浅黄色。

2.1.1 仪器与用具：显微镜、玻片。

2.2 .2 操作步骤：按药材(饮片)及成方制剂显微鉴别法标准操作规程操作。

松贝、青贝及栽培品淀粉粒甚多，广卵形、长圆形或不规则圆形，有的边缘不平整或略作分枝状，直径5～64µm，脐点短缝状、点状、人字状或马蹄状，层纹隐约可见。

表皮细胞类长方形，垂周壁微波状弯曲，偶见不定式层孔，圆形或扁圆形。

螺纹导管直径5～26µm。

炉贝淀粉粒广卵形、贝壳形、肾形或椭圆形，直径约至60µm，脐点人字状、星状或点状，层纹明显。

螺纹导管及网纹导管直径可达64µm。

（2）2.2.1 试剂：浓氨试液、二氯甲烷、乙酸乙酯，甲醇、稀碘化铋钾试液、亚硝酸钠乙醇溶液。

2.2.2 仪器与用具：电子天平 (1/100)、量筒、展开缸、硅胶G薄板层板2.2.3 操作步骤：取本品粉末10g，加浓氨试液10ml，密塞，浸泡1小时，加二氯甲烷40ml，超声处理1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。

川贝母检验标准操作规程目的：建立川贝母检验标准操作规程。

规范检验操作，确保川贝母质量。

适用范围：适用于川贝母的检验。

责任者：质量管理部经理、质检中心主任、质量检验员。

内容:1品名：川贝母2取样：按药材和饮片取样标准操作规程（SOP—QC-ZJ—6065）取样3检验依据：川贝母内控质量标准（STP-QS-ZJ-3015）4性状松贝取本品,置明亮处用肉眼观察，呈类圆锥形或近球型,尺量，高0.3~0。

8cm,直径0。

3～0.9cm。

，表面类白色。

外层鳞叶2瓣，大小悬殊，大瓣紧抱小瓣,未抱部分呈新月形，习称“怀中抱月”；顶部闭合,内有类圆形,顶端稍尖的心芽和小鳞叶1～2枚;先端钝圆或稍尖,微凹入，中心有1灰褐色的鳞茎盘,偶有残存须根。

质硬而脆，断面白色，富粉性。

气微，味微苦。

青贝呈类扁球形，高0.4~1。

4cm，直径0。

4~1.6cm。

外层鳞叶2瓣，大小相近，相对抱合,顶部开裂，内有心芽和小鳞叶2～3枚及细圆柱形的残茎.炉贝呈长圆形，高0.7～2。

5cm，直径0.5~2。

5cm。

表面类白色或浅棕黄色，有的具棕色斑点。

外层鳞叶2瓣，大小相近,顶部开裂而略尖,基部稍尖或较钝.5鉴别：5。

1仪器：显微镜、超声波清洗机、电子恒温水浴锅、薄层喷雾气压泵、电子天平 5。

2试剂与试液5。

2.1试剂：二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、浓氨试液5。

2.2试液水合氯醛试液：取水合氯醛50g，加水15ml与甘油10ml使溶解，即得。

甘油乙醇试液：取甘油、稀乙醇各1份，混合，即得.碘化钾溶液：取碘化钾16.5g,加水使溶解成100ml,即得。

临用新制。

稀碘化铋钾试液:取次硝酸铋0。

85g，加冰醋酸10ml与水40ml溶解后，即得。

临用前取5ml，加碘化钾溶液（4→10）5ml，再加冰醋酸20ml,加水稀释至100ml，即得。

亚硝酸钠乙醇试液:取亚硝酸钠1g,加乙醇使溶解成100ml，即得。

5.3对照品与：贝母辛对照品、贝母素乙对照品5。

贝母类药材的商品规格与鉴定杜宜润山东中医药大学，济南长清 250355摘要贝母的品种较多，有炉贝、青贝、松贝、平贝母、浙贝母等，外表性状上非常相似，但其治疗疾病的用途不—样，价值也有高低之分，临证时需将贝母的性状加以鉴别．关键词贝母品种商品规格鉴定贝母是百合科多年生植物的干燥鳞茎，有清热润肺，止咳化痰功效，用于治疗痰热咳嗽，痰多胸闷，为治疗虚痨咳嗽，心胸郁积，咳血及气管炎及慢性支气管炎常用药，全球贝母属植物约有85种以上，其性状各有特点。

目前，研究人员已从贝母属植物中分离出97种生物碱，还有许多微量元素，如钙，铁，钾，镁，镍等，贝母类药材来源复杂，地区性用药各不相同，目前有十几种植物磷茎可作为贝母代用品使用，贝母资源稀缺，价格较高，常有不法分子利用光慈姑，山慈姑等伪品伪充正品或混用现象，为真实反映贝母药材的内在质量和用药功能，达到安全，有效，可控，稳定的目的，就要对贝母属植物的品种研究，商品药材及产地，生物性状，化学及应用仪器分析方法来对贝母的鉴别。

贝母的商品药材及产地1)川贝母：主产于四川甘孜洲阿坝州及青海西藏交界等地，一般分为松贝，青贝，炉贝三种1．松贝：因其过去集散于四川松潘县附近，所以称为松贝。

本品外形呈类圆锥形或近球形，高0.3～0.8cm，直径0.3～0.9cm。

因其如豆如珠，又称“珍珠贝”、“米贝”。

表面类白色，外有鳞瓣2枚，大瓣紧抱小瓣，未抱部分呈新月形，俗称“怀中抱月”；内有类圆柱形、顶端稍尖的心芽或小鳞叶1～2枚；顶端闭合，稍尖或钝圆，底部平，微凹入，中心有鳞茎盘，偶有残存须根，习称“蒜泥点”或“蒜泥蒂”。

质地坚硬且脆，断面白色，富粉性。

气微，味微苦。

2．青贝：因其过去集散于四川青川县附近故称青贝。

本品类扁球形，高0.4～1.4cm,直径0.4～1.6cm。

外层两枚鳞瓣大小形态相近，相对抱合，在顶端形成裂口。

鳞瓣内有心芽和小鳞叶2～3枚及细圆柱形的残茎，底部钝圆。

气微，味微苦。

生物技术在中药鉴定方面的应用浙江理工大学生命科学学院，浙江杭州 310018摘要现代生物技术是以现代生物学和生命科学为基础，按照所研究的层次不同，可以分为酶工程、发酵工程、细胞工程、基因工程、蛋白质工程等五大类，核心是基因工程。

我国药材资源丰富,药用动植物约1万余种。

但目前使用的药材来源复杂,互混、互代、掺假现象普遍存在因此对各种药材进行准确鉴定显得十分必要。

近年来，随着生物科学的飞速发展，许多新学科理论和实验技术不断的被运用到中药的鉴定当中，以确保中药使用更安全有效。

关键词中药鉴定 PAGE技术 RAPD技术 DNA序列分析生物芯片中药鉴定学研究的主要内容是中药材及基原鉴定，包括鉴定方法和鉴定标准。

鉴定的方法有很多，生物方法有分子鉴定，化学方法鉴定技术有红外光谱鉴定、色谱鉴定，形态鉴定技术有仿生技术。

现从生物技术角度主要介绍蛋白标记技术和基于PCR的DNA分子鉴定技术。

1 蛋白质标记技术1.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中药材中含有多种组分，如有机酸、蛋白质、生物碱和酶等，其电荷和分子量和分子结构大不相同。

在电场作用下，经一定时间，各组泳动的方向、速度和距离也不同，采用电泳技术进行蛋白质谱带数目、宽窄、位置及染色程度分析，可以获得很多信息从而达到中药鉴别的目的[1]。

该方法操作方便，设备简单，分辨率高，尤其对种子类药材有很好的鉴别作用。

赵华英等应用PAGE技术，对6种外形相似的苋科种子类药材青箱子、牛膝子、鸡冠花子、邹果苋子、苋子、反枝苋子之间进行了可溶性蛋白质电泳分析，电泳图谱显示各样品特征带，可以准确区分各种药材，鉴别真伪，在临床用药时保证用药安全[2]。

2 DNA分子鉴定2.1随机引物扩增多态性(randomamplifiedpolymor2phicDNA,RAPD)技术RAPD技术在PCR技术的基础上发展于20世纪90年代,是用人工合成的较短的单个随机引物,以药材总DNA为模板,在DNA聚合酶作用下,进行非特异性的聚合酶链式反应,分析扩增产物电泳图谱在不同类群中的变异,扩增片段具有品种、品系及单株特异性。