荧光法测定羟基自由基

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.06.12C N 103149188 A (21)申请号 201310069048.3(22)申请日 2013.03.05G01N 21/64(2006.01)(71)申请人东华大学地址201620 上海市松江区松江新城区人民北路2999号(72)发明人张煊 司芳 阎克路(74)专利代理机构上海天翔知识产权代理有限公司 31224代理人吕伴(54)发明名称一种荧光定量检测羟基自由基的方法(57)摘要本发明涉及一种荧光定量检测羟基自由基的方法，特别是涉及一种以苯五甲酸为荧光探针的荧光定量检测羟基自由基的方法，具体步骤为：将捕捉剂苯五甲酸加入待测体系中，使其摩尔浓度为羟基自由基产生物摩尔浓度的1倍及1倍以上；检测待测体系荧光强度，由荧光强度计算此时待测体系中羟基自由基的产生量。

苯五甲酸苯环结构仅含一个反应位点，与羟基自由基加成后生成唯一荧光性产物—羟基苯五甲酸，使定量检测更准确。

本发明可在20～98℃对产生羟基自由基的体系(pH ≥5)进行定量检测。

本发明操作简单快速、专一性强、灵敏度高。

有助于探究纺织化学、环境化学、制浆造纸等产生羟基自由基工艺体系的机理，从而更好地指导生态生产工艺。

(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书6页 附图5页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页 附图5页(10)申请公布号CN 103149188 A*CN103149188A*1/1页1.一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征是：所述方法的荧光探针为苯五甲酸，其分子结构式为2.根据权利要求1所述的一种荧光定量检测羟基自由基的方法，其特征在于，具体步骤为：将捕捉剂苯五甲酸加入待测体系中，使其摩尔浓度为羟基自由基产生物摩尔浓度的1倍及1倍以上；捕捉反应结束后调节待测体系pH 为9～10；检测待测体系的荧光强度，根据荧光强度与羟基苯五甲酸浓度的线性关系及羟基自由基与羟基苯五甲酸的一一对应关系，由荧光强度计算出此时待测体系中羟基自由基的产生量。

对苯二甲酸荧光检测羟基自由基原理苯二甲酸荧光检测羟基自由基原理是一种常用的生物化学实验方法，用于研究羟基自由基活性。

该原理是基于苯二甲酸自由基被氟化铈(Ce3+)氧化生成激发态氧化铈离子(Ce4+)，从而产生荧光信号的原理。

首先，苯二甲酸荧光检测羟基自由基的实验中，加入苯二甲酸(1mM)和氟化铈(Ce3+)(0.1mM)在提取样品体系中，制备苯二甲酸自由基(C_6H_4(COO^·)–COO^·)。

接下来，将苯二甲酸自由基与羟基自由基反应，生成荧光产物。

羟基自由基是一种高活性的自由基，具有氧化还原能力。

羟基自由基与苯二甲酸自由基反应时，会将苯二甲酸自由基还原为苯二甲酸。

反应过程如下:C_6H_4(COO^·)–COO^·+·OH-->C_6H_4(COOH)_2反应进行到一定程度时，苯二甲酸的量同时减少，氟化铈(Ce3+)则被氧化为激发态氧化铈离子(Ce4+)。

激发态氧化铈离子(Ce4+)具有发光性质。

当它返回基态时，会发出蓝色荧光。

最后，通过荧光光谱仪检测样品溶液中的荧光信号，荧光信号的强度与羟基自由基的浓度成正比。

苯二甲酸荧光检测羟基自由基的原理可总结为两个部分：首先，苯二甲酸和氟化铈的反应生成苯二甲酸自由基；其次，苯二甲酸自由基与羟基自由基反应生成荧光产物。

该方法有以下优点及应用领域：1.灵敏度高：荧光检测方法可以灵敏地检测到低浓度的羟基自由基。

2.反应选择性强：该方法可以选择性地检测羟基自由基，与其他自由基和化合物不发生反应。

3.操作简单：实验步骤简单，并且不需要复杂的仪器设备。

4.广泛应用：该方法可用于测定生物体内羟基自由基的浓度，研究羟基自由基在生物体内的生成和消除过程等。

综上所述，苯二甲酸荧光检测羟基自由基通过利用苯二甲酸自由基在与羟基自由基反应时产生蓝色荧光的特性，实现了对羟基自由基活性的检测。

该方法在生物化学研究中具有广泛的应用前景。

活性氧（ROS）在许多致病过程中起关键作用，包括致癌作用、炎症、缺血再灌注损伤和信号转导。

目前开发的几种方法包括电子自旋共振法和化学荧光法。

其中，荧光检测在高灵敏度和实验方便性方面是优越的。

细胞溶质Ca2+的荧光指示剂，极大地促进了细胞中Ca2+依赖性信号转导的实验研究。

然而，几种用于检测ROS的荧光探针（包括2,7-二氢二氢荧光素（DCFH））可与各种ROS（超氧化物，过氧化氢等等）发生反应。

此外，DCFH易于自氧化，导致暴露在光下时荧光自发增加。

因此，将这些探针视为检测细胞中特定的氧化物质（例如过氧化氢）是不合适的。

胞内羟基自由基测定机理：2-[6-(4-羟基)苯氧基-3H-黄嘌呤-3-酮基-9-基]苯甲酸（HPF）被设计并合成为新型荧光探针，用于检测选择性高活性氧（hROS），即羟基。

这种新开发的ROS指示剂HPF比二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）具有更高的特异性和稳定性，因此被广泛用于更精确的胞内ROS 定性测量。

尽管HPF本身几乎不发荧光，但HPF选择性地和剂量依赖性地在与hROS反应时产生强荧光化合物，但不与其他活性氧物质（ROS）反应。

因此，通过单独使用HPF，可以将hROS 与过氧化氢，一氧化氮和超氧化物区分开来。

此外，HPF对光诱导的自动氧化具有抗性。

胞内羟基自由基测定方法：在本研究中，用PBS洗涤500 μL藻类培养物，并在黑暗条件和室温下于10 μM HPF （Invitrogen，美国）的终浓度下温育40 min。

用PBS洗涤一次后，通过FL1通道检测胞内羟基自由基水平。

胞内超氧阴离子自由基测定机理：一种名为二氢乙锭（DHE）的荧光素被广泛用于测量细胞内超氧阴离子自由基。

DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。

根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化，二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪可直接观察。

羟自由基清除能力检测
羟自由基清除能力（Hydroxy free radical scavenging activity）是一种衡量物质抗氧化能力的重要指标。

目前有关羟自由基的分析测试方法主要有高效液相色谱法、化学发光法、荧光分析法、分光光度法等。

其中测定羟自由基清除能力最常用的是通过分光光度法测定样本抑制显色物邻二氮菲的吸光度的下降，从而反映样品清除羟自由基的能力。

测定原理为：
H2O2/Fe2+通过Fenton反应产生羟自由基，将邻二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化为Fe3+ ，导致536nm吸光度下降，样品对536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了样品清除羟自由基的能力。

迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测羟自由基清除能力。

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生化法测定羟自由基清除能力样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。

周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 羟自由基清除能力信息。

西北师范大学硕士学位论文接触辉光放电等离子体产生的羟基自由基的检测及其在聚合反应中的应用姓名：吴建林申请学位级别：硕士专业：分析化学指导教师：高锦章;杨武2008-06摘要低温等离子体技术是上世纪后期出现的一种新型水处理技术， 即在常温常压下，通过非法拉第电解可以产生大量活性粒子，如羟基自由基（·OH）(标准氧化电位为2.80V)，以及紫外线和冲击波，对水体中的污染物有很强的破坏作用。

该类报道甚多，相对而言，对于活性粒子的测定研究较少。

本文的目的之一就是研究辉光放电电解等离子体中羟基自由基的测定方法； 同时研究了自由基引发的聚合反应，合成高分子阻垢剂。

结果表明，所建立的分析方法和合成方法均有实际应用价值。

论文由五章组成:第一章介绍了等离子体的基本概念，综述了羟基自由基的检测方法和应用范围、自由基引发阻垢剂合成的现状， 最后，简要介绍了实验中用到的正交实验方法。

第二章以水杨酸为捕获剂，采用高效液相色谱检测了接触辉光放电产生的羟基自由基，在体系pH值为3.2的条件下，考察了放电电压和溶液电导率对辉光放电等离子体中产生的羟基自由基浓度的影响，并半定量地计算了辉光放电电解过程中羟基自由基的产量与实验条件之间的关系。

第三章对辉光放电等离子体技术引发合成高分子聚合马来酸酐-丙烯酰胺共聚物阻垢剂进行了研究, 借助正交设计法,考察了原料浓度、电压、后聚合时间等因素对聚合物分子量、阻垢率的影响。

第四章对辉光放电等离子体技术引发合成高分子聚合马来酸酐-丙烯酸共聚物阻垢剂进行了研究, 借助正交设计法,考察了原料浓度、电压、后聚合时间等因素对聚合物分子量、阻垢率的影响。

第五章对辉光放电等离子体技术引发合成高分子聚合马来酸酐-丙烯酸-丙烯酰胺共聚物阻垢剂进行了研究, 借助正交设计法,考察了原料浓度、电压、后聚合时间等因素对聚合物分子量、阻垢率的影响。

关键词：辉光放电等离子体；羟基自由基；高分子聚合；阻垢剂AbstractThe low-temperature plasma in aqueous solution is one of the emerging technologies for water-treatment which appeared in the early 1980's. It has received extensive attention in many fields in the world, due to its high degradation efficiency, instrumental simplicity, and amenability to the environment. It is worth notice that there are a lot of energetic species such as hydroxyl radical, caused by contact glow discharge plasma. So far, very few papers deal with the determination of hydroxyl radical yielded in the CGDE process. Thus, one of our purposes is to find a convenience method to detect hydroxyl radical in quantity. And then, an approach to initiate some polymerization was also discussed in detail. .This paper includes five chapters:Chapter 1 gives a review on the low temperature discharge plasma, the determination of hydroxyl radical and its application to the polymerization. In addition, the arithmetic of orthogonal design was also described in brief.Chapter 2 examines the effect of some of variable parameters, such as discharging voltage and electric conductivity, on the yield of hydroxyl radical during the glow discharge process at the solution pH value of 3.2, and semiquantitatively observes the relationship between output of hydroxyl radical and influencing factors.Chapter 3 studies the polymerization of maleic anhydride, acrylamide. The effects of applied voltage, concentration of reactants, time of polymerization on molecular weight of scale inhibitor.Chapter 4investigates the polymerization of maleic anhydride, acrylic acid. The effects of applied voltage, concentration of reactants, time of polymerization on molecular weight of scale inhibitor.Chapter 5 researches the polymerization of maleic anhydride, acrylic acid, acrylamide. The effects of applied voltage, concentration of reactants, time of polymerization on the molecular weight of scale inhibitor .Keywords: glow discharge plasma; hydroxyl radical; macromoleclar polymer;scale inhibitor.独创性声明独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

羟基自由基的产生与测定
一、产生
1. 光致氧化：光照射在有机物上，会使有机物中的碳原子与氧气发生反应，形成自由基；
2. 氧化还原反应：在氧化还原反应中，反应物会损失电子，形成自由基；
3. 水解反应：某些有机物会发生水解反应，从而产生自由基；
4. 化学反应：在某些化学反应中，反应物会损失电子，形成自由基；
5. 生物体的活动：有些生物体的活动会产生自由基；
6. 其他：还有一些其他的方式可以产生自由基，比如X射线、γ射线等。

二、测定
1. 光谱法：通过测定有机物中的自由基的吸收光谱，可以推断出有机物中自由基的种类和数量；
2. 荧光法：通过测定有机物中自由基的荧光，可以推断出有机物中自由基的种类和数量；
3. 电位法：通过测定有机物中自由基的电位，可以推断出有机物中自由基的种类和数量；
4. 化学法：通过测定有机物中自由基与特定抗氧化剂发生化学反应，可以推断出有机物中自由基的种类和数量；
5. 其他：还有一些其他的方法可以用来测定有机物中的自由基，比如电子受体技术、质谱技术等。

羟基自由基检测方法的研究进展刘建伟　杨长河(南昌大学建筑工程学院,南昌330031)摘　要:羟基自由基氧化是高级氧化技术重要的机理之一,也是研究的难点之一。

本文归纳总结了测定羟基自由基的几种方法,并探讨了各种方法存在的问题,提出了新的检测方法所应具备的特点。

关键词:水处理　高级氧化技术　羟基自由基1　前言随着经济的快速发展,环境污染问题越来越严峻,传统水处理方法难以有效处理成分日益复杂的污水,水处理新技术的研究与应用成为环保领域的重要研究课题。

以臭氧氧化、光催化氧化、电化学氧化、超声技术、湿式氧化等为代表的高级氧化工艺(Advanced Oxi2dati on Pr ocess,AOP)处理污染物技术的形成,为我们提供了处理水体中污染物的新思路。

高级氧化工艺具有反应速度快、处理完全、无公害、适用范围广等优点。

这一概念由Glaze等[1]于1987年提出,被定义为能够产生羟基自由基(・OH)的氧化过程。

目前水处理中能产生・OH的高级氧化技术主要有臭氧氧化、Fent均相催化氧化、湿式氧化、光催化氧化、电催化氧化、光电催化氧化、超声空化氧化[2]、高压脉冲放电等离子体技术[3,4]等。

随着对其反应机理研究的深入,逐渐认识到反应过程中・OH的行为的重要性。

・OH具有一个未成对电子,使其具有极强的氧化能力(2.80V),仅次于氟(2.87V),并能引发诱导产生链反应,主要通过电子转移、亲电加成、脱氢反应等途径无选择性地与各种有机化合物直接作用并最终将其降解为C O2、H2O等无害物质。

由此,准确的・OH的检测特别是在线检测已被认为是此项研究的重要方面,也是目前各种高级氧化反应机理研究的难点之一。

由于自由基是化学反应的中间体,大部分自由基寿命极短。

在水相反应体系中的・OH的寿命仅大约10-9s[5],直接对其进行检测受到仪器操作方面的限制很大,而且其存在依赖于特定的反应环境,因而关于自由基的行为方面,推测和间接证明的为多,直接测量的为少。

荧光光谱法研究羟基自由基诱导的酪氨酸氧化孙艳辉;王卫龙;吴霖生;贾小丽【摘要】二酪氨酸是酪氨酸氧化的标志性产物.为研究影响羟基自由基诱导酪氨酸氧化的因素,采用同步荧光光谱结合二维相关技术研究羟基自由基诱导酪氨酸氧化的反应过程.结果表明:pH变化时,二酪氨酸的荧光峰位、峰强发生变化.在羟基自由基诱导酪氨酸氧化体系中,随着酪氨酸浓度的增加,二酪氨酸产量升高;随着过氧化氧浓度的增加,二酪氨酸产量降低;酸性条件下,该反应易于发生,碱性条件下该反应难以发生;随着反应的进行,二酪氨酸荧光强度先增加后减小.二维同步荧光光谱相关分析表明,292 nm处荧光强度的变化快于281,300和374 nm处荧光强度的变化.因此,荧光光谱法研究羟基自由基诱导酪氨酸氧化,简单可行.%Dityrosine is a marker of tyrosine oxidation. To study effecting factors of hydroxyl radical on tyrosine oxidation,synchronous fluorescence spectra with two dimensional correlation was used. The results showed that the peak position and intensity of dityrosine changed while pH value varied. In the system of tyrosine oxidation, with the increment of tyrosine concentration, the concentration of dityrosine decreased. With the increment of hydrogen peroxide concentration, the concentration of dityrosine increased. The oxidation reaction was prone to taking place in acid conditions while difficult to develop in basic conditions. With the development of oxidation reaction, the fluorescence intensity of dityrosine increased and then decreased.Two dimentional correlation synchronous fluorescence spectra showed that the variation in the intensity at 292 nm preceded that of 281 ,300 and 374 nm. Thus, fluorescence spectroscopy was simple and easy for studying tyrosine oxidation induced by hydroxyl radical.【期刊名称】《光谱学与光谱分析》【年(卷),期】2011(031)007【总页数】4页(P1838-1841)【关键词】荧光光谱;酪氨酸;二酪氨酸;羟基自由基;二维相关光谱【作者】孙艳辉;王卫龙;吴霖生;贾小丽【作者单位】滁州学院化学与生命科学系,安徽滁州239012;滁州学院化学与生命科学系,安徽滁州239012;滁州学院化学与生命科学系,安徽滁州239012;滁州学院化学与生命科学系,安徽滁州239012【正文语种】中文【中图分类】O657.3活性氧是由氧直接或间接转变生成的氧自由基及其衍生物,包括:超氧阴离子自由基及脂质自由基和脂质过氧化物等[1]。