羟自由基清除率测定.docx

抗氧化活性的测定(参考)——测定活性物质对羟自由基的清除率
（羟自由基清除试验）
采用Fenton 试剂：过氧化氢/亚铁盐。

原理：H 2O 2与亚铁离子反应生成·OH,·OH 自由基一般存活时间比较短，具有较高的反应活性。

当在反应体系中添加水杨酸，便能快速的捕捉·OH 而产生紫色化合物（2,3-二羟基苯甲酸），该有色化合物在510nm 处有较大吸收峰，测其吸光度可表示羟自由基（•OH ）的多少，吸光度与羟自由基（•OH ）的量成正比。

反应体系中若加入羟自由基（•OH ）清除剂后，被氧化的水杨酸减少，则体系颜色变浅甚至消失，吸光度变小。

操作：
样品处理：蔬菜水果切分，榨汁（切分后可放在2%的盐酸或草酸溶液中护色）。

将蔬菜汁或果汁放入50ml 离心管中（如有颜色加适量活性炭或白陶土），在3000~ 4000rpm 下离心10min~ 20min 后（若样品蛋白含量较高，需加适量乙酸锌，亚铁氰化钾）快速过滤，滤液备用。

取25ml 比色管2支（样品管、空白管），分别加入5ml 1mmol/L 硫酸亚铁溶液、5ml 3mmol/L H2O2溶液，样品管中加入1ml 样品溶液，空白管中加入1ml 蒸馏水，混合均匀后用3mmol/L 水杨酸溶液定容至刻度，在37℃(0.1±℃)的恒温水中反应15min 后，用分光光度计在510nm 的波长下测定各管的吸光度。

以3mmol/L 水杨酸溶液调零。

其对•OH 自由基的清除率SA （%），可根据下式进行计算：式中：
A0—不加样品的吸光度； A1—加入样品的吸光度
###【以往经验，不一定全适用】：若样品不进行脱色处理，则操作如下：在3支25ml 的比色管中（样品管、空白管、样品本底管）依次加入5ml1mmol/L 硫酸亚铁溶液，空白管和样品管中各加入5ml3mmol/L H 2O 2溶液，本底管中H 2O 2溶液用蒸馏水代替。

本底管和样品管分别加入1ml 样品溶液，空白管中加入1ml 蒸馏水，混合均匀后用3mmol/L 水杨酸溶液定容至刻度。

在37℃(0.1±℃)的恒温水中反应15min 100A0A1-A0= SA(%)⨯清除率
后用分光光度计在510nm的波长下测定吸光度。

空白管为A0，样品管为A1，本底管为A2。

其对·OH自由基的清除率SA（%），可根据下式进行计算：
清除率SA(%) =｛[(A0—(A1- A2) ]/A0｝×100[10]
式中：A0—不加样品的吸光度
A1—加入样品的吸光度
A2—本底的吸光度。