白头翁汤正丁醇提取物对白念珠菌作用下Caco-2细胞中细胞因子、防御素及Toll样受体表达的影响
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2020年第1期(总第270期) 文献综述63白头翁汤药理作用研究进展邹志强 刘晏灼 于如娟 张亚玲 褚秀玲 苏建青*(聊城大学农学院 山东 聊城 252000)中图分类号:S853.92 献标识码:A 文章编号:1007-1733(2020)01-0063-03 白头翁汤出自张仲景《伤寒论》的清热解毒代表方剂,具有清热解毒、凉血止痢等功效,是兽医临床上使用最多的治疗痢疾和肠炎的基础方剂,能起到抗菌消炎、修复溃疡和免疫调节的作用。
整个方剂仅由白头翁、黄连、黄柏和秦皮4味中药组成。
现代药理学已经证实白头翁汤中的许多有效成分能够杀菌、消炎、镇痛等,如白头翁素、白头翁皂苷B4、盐酸药根碱、小檗碱、秦皮甲素等活性成分[1]。
1 白头翁汤的抗炎效果(1)消化道炎症是畜禽常见的疾病,特别是幼龄畜禽的消化道炎症,是引起畜禽死亡或淘汰的主要原因。
研究证实白头翁汤对于畜禽的消化道炎症有较好的治疗效果。
杨昌文[2]研究了白头翁汤及其拆方的抗炎效果,在白头翁汤、黄连、黄柏、秦皮、白头翁提取物对小鼠二甲苯性耳廓肿胀的作用比较实验,显示白头翁汤组、黄连组抗炎作用持续最长,在4h 时二甲苯致小鼠耳廓肿胀值分别为24.43±15.86µm 和24.32±18.35µm ,极显著低于4h 模型对照组的42.57±22.43µm ,各药物组的抗炎时间由长到短顺序为:白头翁汤、黄连>黄柏>秦皮、白头翁。
在白头翁汤、黄连、黄柏、秦皮、白头翁提取物对小鼠大肠杆菌致腹泻的作用比较实验中,白头翁汤组稀便率及2h 、4h 和6h 的平均腹泻次数分别是50.78%、3.53±0.2次、4.88±1.08次和6.26±2.17次,显著(P<0.05)低于对照组的78.20%、6.51±2.01次、8.23±3.10次和12.19±3.99次。
白头翁汤通过保护微血管内皮细胞的完整性及PMNs迁移杀菌功能的影响王明明;杨舒;董虹;穆祥【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2016(047)004【摘要】本研究旨在研究白头翁汤(PD)对脂多糖(LPS)诱导内皮细胞损伤的保护作用,从而揭示白头翁汤的药理作用.分别采用水溶性四氮唑(WST-1)、乳酸脱氢酶(LDH)、苏木素伊红(HE)和Hoechst33342染色法检测PD和LPS对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(RIMVECs)增殖、细胞毒性、细胞连接和细胞核变化的影响;建立中性粒细胞(PMNs)跨RIMVECs迁移的Transwel模型,检测PD对LPS损伤的RIMVECs后PMNs细胞内和细胞外细菌数量的影响.结果显示,LPS(1 μg·mL-1)致RIMVECs细胞核萎缩、细胞膜损坏,细胞毒性百分比达53.2%;细胞连接破坏导致细胞脱落,脱落率为39.6%.PD(20 μg·mL-1)对上述损伤有明显的保护作用.在20 μg·mL-1PD作用下,LPS诱导的跨内皮迁移的PMNs细胞内外细菌的存活明显减少(P<0.01).结果揭示PD可以有效保护LPS损伤的RIMVECs从而增强PMNs的杀菌能力,为临床治疗动物细菌性疾病用药提供理论依据.【总页数】8页(P836-843)【作者】王明明;杨舒;董虹;穆祥【作者单位】北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206;北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206;北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206;北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室,北京102206【正文语种】中文【中图分类】S853.9【相关文献】1.LPS的直接诱导对肺微血管内皮细胞ICAM-1的表达及对PMN黏附作用影响的研究 [J], 顾大勇;梁冰;唐旭东;石力;曾祥元2.LPS的直接诱导对肺微血管内皮细胞IL-8的表达及对PMN趋化作用影响的研究 [J], 顾大勇;李艳;陈莉;马布仁;杨季云;曾祥元3.白头翁汤对溃疡性结肠炎患者外周血PMN凋亡和IL-6、IL-8的影响 [J], 孙政;祝斌4.LPS直接诱导对肺微血管内皮细胞IL—8的表达及对PMN趋化作用影响的研究[J], 顾大勇; 陈莉; 马布仁; 杨季云; 曾祥元5.烧伤后PMN粘附对肺微血管内皮细胞单层通透性的影响 [J], 方勇;陈玉林;葛绳德;刘世康;朱世辉因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
白头翁汤沉淀化学成分研究
朱华旭;丁林生
【期刊名称】《中成药》
【年(卷),期】2002(024)004
【摘要】目的:对白头翁汤沉淀的化学成分进行研究.方法:运用天然药物化学的分离精制方法进行单体化合物的分离.结果:沉淀中分得6个单体化合物,通过光谱解析鉴定了其结构,并与汤剂中化学成分进行了比较.结论:沉淀中化学成分为汤剂中的主要成分.
【总页数】4页(P293-296)
【作者】朱华旭;丁林生
【作者单位】南京中医药大学,江苏,南京,210029;中国药科大学天然药化教研室,江苏,南京,210038
【正文语种】中文
【中图分类】R284.1
【相关文献】
1.白头翁汤汤剂化学成分的分离研究 [J], 朱华旭;丁林生
2.黄连与甘草化学成分的相互作用研究之一——混浊汤剂中沉淀部分的成分研究[J], 李赛君;王凡;赵晶晶;陈惠;吴瑾光
3.白首乌酒沉淀物的化学成分研究 [J], 姜洪芳;单承莺;顾震伯;张玖;张卫明
4.金雀花提取物正丁醇沉淀部分化学成分研究 [J], 张妮;穆淑珍;王家胜;孔琪;余正
文
5.白头翁汤化学成分与药理研究 [J], 黄菊红;周元安;万常玉
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白头翁汤的药理作用研究进展孙俊颖,彭新宇,魏光伟,唐兴刚(广东省农科院兽医研究所,广东广州510640)摘要:近年来,白头翁汤临床应用非常广泛,随着对白头翁汤药理作用的系统研究,发现其具有显著的药理活性。
对近年来白头翁汤药理作用的研究文献进行了分析整理,重点综述其化学成分与药理活性的关系及相关临床药理作用的研究进展,并提出进一步深入研究的建议。
关键词:白头翁汤;化学成分;药理活性中图分类号:R289.5文献标识码:A文章编号:1004-874X(2010)12-0112-02白头翁汤(Pulsatillae Decoction)源于张仲景的《伤寒论》,由白头翁、黄连、黄柏、秦皮等4味药组成,具有清热解毒、凉血止痢的功效。
《伤寒论·辨厥阴病脉证并治》记载:“热利下重者,白头翁汤主之”,“下利欲饮水者,以有热故也,白头翁汤主之”。
该方证原为治湿热痢疾的首选方剂。
近年来,随着对这一传统方剂的化学成分和药理作用的深入研究,发现其具有显著的药理活性,现已向临床各科扩展,在兽医临床也有广泛应用。
本文综述了白头翁汤的化学成分与药理活性的关系及近几年来相关药理作用的研究进展,为进一步开发应用白头翁汤奠定理论基础。
1白头翁汤的化学成分及药理活性汤剂药效的物质基础是汤剂的化学成分。
目前,对汤剂复方的研究主要是复方组成中各单味中药的化学成分。
白头翁汤的化学成分包括生物碱类、香豆素类、皂甙类、柠檬苦素类、甾醇类和木脂素类等。
其中生物碱类、香豆素类、皂甙类和柠檬苦素类化合物为白头翁汤中主要的化学成分,亦可能为汤剂发挥药效的主要物质基础[1]。
1.1生物碱类白头翁汤生物碱类物质主要包括小檗碱(Berberine)、巴马汀(Palmatine)和药根碱(Jatrorrhizine)等成分。
此类化合物主要来源于黄连和黄柏。
临床上对小檗碱研究较多。
小檗碱属异喹啉类生物碱,也称黄连素,常用其盐酸盐,为毛蓑科黄连属植物黄连、黄柏的根茎提取的主要成分。
白头翁汤治疗溃疡性结肠炎作用机制的实验研究
韩捷
【期刊名称】《河南中医药学刊》
【年(卷),期】2001(016)003
【摘要】实验分别采用灌胃与灌汤两种药途径作用于造模大鼠,观察白头翁汤对体液免疫,细胞因子,氧自由基的影响,并其在抗炎镣菌与修复溃疡方面的作用。
实验结果表明,白头翁汤能显著降低血清中IgA,IgG及IL-6的含量,同时血清中及结肠组织中的MDA含量经白头翁汤治疗后显著降低而SOD含量明显升高,研究还表明白头翁汤具有显著的抗炎杀菌及修复溃疡的作用。
灌肠组与灌胃组各项指标比较显示大体相当,但灌肠组在修复溃疡方面优于灌胃组。
【总页数】4页(P23-26)
【作者】韩捷
【作者单位】河南中医学院98级,河南郑州450003
【正文语种】中文
【中图分类】R259.746.2
【相关文献】
1.白头翁汤加味治疗溃疡性结肠炎的疗效及作用机制 [J], 袁恩
2.针灸结合白头翁汤治疗溃疡性结肠炎大鼠的实验研究 [J], 秦亚梅
3.白头翁汤调控细胞因子治疗溃疡性结肠炎作用机制研究进展 [J], 谢子葳;李鑫;谢碧岑;王勇力
4.白头翁汤治疗乙酸诱发大鼠溃疡性结肠炎的实验研究 [J], 韩捷
5.白头翁汤治疗溃疡性结肠炎作用机制研究进展 [J], 李盼盼;李东阳;李毅
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白头翁汤治疗溃疡性结肠炎的研究进展
刘京京;马科文;常苗;韩捷
【期刊名称】《中医药学报》
【年(卷),期】2024(52)2
【摘要】溃疡性结肠炎是炎症性肠病之一,其临床治疗主要以口服西药氨基水杨酸类为主,但临床易反复发作、迁延不愈。
白头翁汤是治疗湿热证型溃疡性结肠炎的
常用方剂,现代研究发现其有效成分以生物碱类、甾体类、柠檬苦素类、香豆素类、皂苷类等为主,通过调控相关细胞因子和黏附分子、调节氧化应激、肠黏膜屏障、
调节TGFβ1/Smad3、mTORC1-STAT3-COX-2、TLR4-ERK1/2等信号通路,多途径发挥抗炎杀菌、改善肠道局部循环、调节免疫功能、修复溃疡创面等作用,临床
可单独使用,也可加减与其他方剂(如芍药汤、黄连解毒汤等)或其他中医疗法(如针灸、灌肠等)联合使用,体现了中药复方不良反应少、多层次、多靶点、多途径的治疗特点。
本文将从有效成分、药理机制及临床治疗效果3个方面做总结,以期为临
床研究白头翁汤治疗溃疡性结肠炎提供理论依据。
【总页数】7页(P101-107)
【作者】刘京京;马科文;常苗;韩捷
【作者单位】河南中医药大学;河南中医药大学第一附属医院
【正文语种】中文
【中图分类】R256.33
【相关文献】
1.白头翁汤调控细胞因子治疗溃疡性结肠炎作用机制研究进展
2.白头翁汤治疗溃疡性结肠炎作用机制研究进展
3.白头翁汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制研究进展
4.白头翁汤治疗溃疡性结肠炎研究进展
5.白头翁汤治疗溃疡性结肠炎研究进展
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中国中医药报/2004年/09月/01日/白头翁药理研究新进展常怡勇白头翁是常用中药,具有清热解毒、凉血止痢、燥湿杀虫的功效。
临床上主要用于治疗细菌性痢疾、阿米巴痢疾、妇科阴道炎等。
现代研究认为,白头翁除了抗菌和抗病原虫作用外,还具有抗癌、杀精、治疗内毒素血症等作用。
抗菌白头翁鲜汁、煎剂(0.5~ 1.0g生药/m l)、乙醇提取物(0.5~ 1.0g生药/ml)等在试管内均有明显的抗菌作用,对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等最为敏感,对痢疾杆菌、枯草杆菌、伤寒杆菌等也有较明显的抑制作用。
抗阿米巴原虫体外实验证明,白头翁煎剂于1 60(即60毫升煎液含白头翁生药1克,以下同),白头翁皂苷于1 500浓度下均能抑制阿米巴原虫的繁殖;白头翁煎剂于1 40,白头翁皂苷于1 200时能完全抑制阿米巴原虫生长。
对其它病原体的抑制作用白头翁60%乙醇浸膏或水煎剂液于5%浓度下5分钟即可杀死阴道滴虫。
白头翁及其复方对皮肤真菌、酵母菌、锥虫、白色念珠菌等均有抑制作用。
白头翁素还具有很强的杀真菌作用。
白头翁对小白鼠流感病毒感染有轻微抑制作用。
抑制巨噬细胞分泌IL-6白头翁对细菌脂多糖刺激巨噬细胞分泌IL-6有明显抑制作用,且随培养时间的延长而增强,可减轻机体过度炎症反应和全身性损伤,有助于治疗内毒素血症。
抗癌有报道,白头翁对肺部鳞癌、黑色素瘤有一定疗效,但临床一般不作重要抗癌中草药使用。
科研人员在体外抗肿瘤药物筛选时发现,白头翁水提取液和醇提取液对7721、HeLa、MKN-45细胞株均有较强的抑制作用,2mg/ml左右白头翁水提取液即可产生非常显著的抑制肿瘤细胞的作用,并提出白头翁抗肿瘤作用主要是通过其直接作用于肿瘤细胞所致。
杀精子作用科研人员通过体外杀精子研究发现,白头翁皂苷使精子瞬间失活的最低有效浓度为0. 73mg/ml。
与国外杀精剂相比,其杀精效果比TS-88强,而稍弱于NP-10。
随着对其杀精子机理、临床应用效果及安全性方面的进一步研究,白头翁皂苷可望成为一种理想的阴道杀精子药。
49科研动态白头翁汤及其拆方对cAMP-磷酸二酯酶活性影响的研究*姚星丞**,李佳***(北京农学院兽医学〈中医药〉北京市重点实验室 北京 102206)摘要:通过检测白头翁汤水提物及其组方的各单味药对中性粒细胞cAMP-磷酸二酯酶(PDE)活性的影响,探讨其抗炎机理。
结果表明白头翁汤较其组方的各单味药对中性粒细胞cAMP-PDE的抑制作用更强;白头翁汤组方中各单味药对中性粒细胞cAMP-PDE活性抑制作用是以黄连为主。
该研究显示白头翁汤水提物可能是通过抑制cAMP-PDE活性,升高炎症细胞cAMP水平发挥抗炎作用。
其抗炎成分及机理有待于进一步研究。
关键词:白头翁汤;拆分方;磷酸二酯酶doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2018.06.029白头翁汤出自张仲景的《伤寒论》,组方严谨,仅由白头翁、黄连、黄柏、秦皮四味中药组成,功擅清阳明之湿热,泄厥阴之郁火,解血分之热毒,治湿热之痢[1]。
现代研究发现,白头翁汤具有高效的抗炎及修复溃疡的作用[2],而临床上常见炎症性疾病多与中性粒细胞的炎性反应密切相关[3,4]。
磷酸二酯酶(PDE)可以通过调节细胞内cAMP 水平发挥抗炎作用[5],本试验通过检测白头翁汤水提物及其各味拆分方对中性粒细胞PDE 活性的抑制作用,初探其抗炎的相关机理与效果,为白头翁汤的临床应用提供试验依据。
1 材料与方法1.1 主要试剂c A M P 、R o l i p r a m 、P B S(pH 值7.4)、钙镁PBS(pH 值7.4)、中药白头翁、黄连、黄芩、黄柏饮片(购自北京同仁堂药店)。
1.2 白头翁汤及其各组方单味药水提物的制备白头翁汤及其各拆分方单味药物水提物的制备方法参照韩太云等人的方法[6],将购买的白头翁等饮片用蒸馏水淋1次,加蒸馏水煎煮2次,煎液减压浓缩至1g/mL 生药。
加无水乙醇使其浓度达到70%,边加边搅拌,4℃放置24h,取上清液用氢氧化钠调pH 值为7.5~8.0,*基金项目:北京市教育委员会面上项目(KM201510020007)*作者简介:姚星丞(1996-),男,本科在读,动物科学专业*通讯作者:李佳,女,实验师3.4 做好人才培养,为肉牛、肉羊产业发展提供技术支持在肉牛肉羊产业发展的重点区域,通过与外来企业合作引进先进的技术和人才,提高本地专业技术人才的技术能力,破解产业发展中遇到的瓶颈,提升产业发展水平,培养本地人才,提升本地科技人员的技术服务能力。
白头翁汤正丁醇提取物对白念珠菌作用下Caco-2细胞中细胞因子、防御素及Toll样受体表达的影响田歌;段强军;冯鑫;吴大强;邵菁;汪天明;汪长中【摘要】目的从细胞因子、人β-防御素(human beta defensin,HBD)及Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)途径探究白头翁汤正丁醇提取物(butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction,BAEB)抗白念珠菌的机制。
方法以Caco-2细胞为实验模型,先以BAEB作用Caco-2细胞24h,再加入热灭活的白念珠菌SC5314孢子(Candida albicans,C.A)共培养24h,以MTT法测定Caco-2细胞存活率;采用酶联免疫吸附试验检测Caco-2细胞上清液白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-8、IL-1β、HBD-2、HBD-3水平;采用普通PCR法检测Caco-2细胞TLR1、TLR2、TLR4、TLR5mRNA的表达水平。
结果与对照组比较,C.A单独作用的Caco-2细胞中IL-6、IL-8、IL-1β、HBD-2、HBD-3表达水平显著升高(P〈0.05),TLR1、TLR2、TLR4、TLR5mRNA表达水平显著上调(P〈0.05);与C.A单独作用相比,BAEB预保护Caco-2细胞后,Caco-2细胞中IL-6、IL-8、IL-1β及HBD-2、HBD-3表达水平明显降低(P〈0.05),TLR1、TLR2、TLR4、TLR5mRNA表达水平也显著下调(P〈0.05),BAEB高剂量的效应最明显。
结论BAEB抗白念珠菌的机制与下调细胞因子、HBD及TLRs表达有关。
【期刊名称】《安徽中医药大学学报》【年(卷),期】2017(036)002【总页数】6页(P46-51)【关键词】白头翁汤正丁醇提取物白念珠菌 Caco-2细胞细胞因子防御素 Toll 样受体【作者】田歌;段强军;冯鑫;吴大强;邵菁;汪天明;汪长中【作者单位】[1]安徽中医药大学中西医结合临床学院,安徽合肥230038;[2]安徽省中医药科学院中西医结合研究所,安徽合肥230038【正文语种】中文【中图分类】R285.5研究显示,多种肠道甚至肠外相关疾病与肠道菌群(主要指细菌菌群)失衡密切相关[1]。
近年来研究发现,肠道白念珠菌等真菌菌群的异常定植也可加剧肠道炎性反应,且在抗真菌治疗后,肠道炎症明显缓解[2-5]。
真菌等微生物定植于肠道黏膜所形成的肠道微生态对肠道和(或)肠道外器官的生理功能或病理变化均产生重要影响。
肠道黏膜上皮细胞不仅参与营养物质的消化吸收,同时在微生物定植或感染时其表达的细胞因子、防御素以及Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)等可引发炎性反应或固有免疫应答[6]。
白头翁汤在临床上常用于防治溃疡性结肠炎[7]。
本实验室前期发现白头翁汤提取物,尤其是其正丁醇提取物(butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction,BAEB)对白念珠菌及其毒力因子具有显著的抑制作用[8-9]。
白念珠菌黏附可诱导与固有免疫相关的细胞因子[白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-8、IL-1β]、人β-防御素(human beta defensin,HBD)及TLRs等表达。
本研究以人结肠上皮细胞(Caco-2细胞系)为实验模型,从固有免疫角度探究BAEB预保护Caco-2细胞系防治白念珠菌相关性肠道疾病的机制。
1.1 主要试剂高糖DMEM培养基:美国Gibco BRL公司;胎牛血清:浙江杭州四季青生物工程材料有限公司;青霉素、链霉素和TRIzol:Invitrogen(中国)公司;反转录试剂盒:美国Thermo公司;IL-8、IL-6、IL-1β、HBD-2、HBD-3 ELISA 试剂盒:江苏雨桐生物公司;其余试剂为国产分析纯试剂。
1.2 菌株与细胞系白念珠菌标准株SC5314由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠;Caco-2细胞系购自ATCC库。
1.3 药物白头翁汤(白头翁、黄柏、黄连、秦皮)药材购自安徽中医药大学第一附属医院中药房。
使用80%乙醇70 ℃回流3 h后过滤,收集滤渣,共重复回流3次,滤液用正丁醇萃取3次,萃取液65 ℃旋转蒸发至结晶干燥,得到BAEB。
1.4 仪器 SpectraMax M2e多功能酶标仪:美谷分子仪器(上海)有限公司;聚苯乙烯96孔微量培养板、6孔微量培养板:美国Corning公司;CO2细胞培养箱:日本三洋公司;倒置显微镜:日本Nikon公司;PCR仪、酶标仪和洗板机:美国BIO-RAD公司。
2.1 白念珠菌热灭活[10] 将白念珠菌SC5314从固态培养基中转移至液态培养基中,37 ℃恒温震荡培养16~18 h,2 000 r/min离心10 min,弃上清,再用D-Hanks重悬洗2次后,100 ℃水浴热灭活1 h。
2.2 Caco-2细胞培养与处理[10] 将Caco-2细胞从-80 ℃冰箱取出,复苏后培养,培养基为含10%胎牛血清、200 U/mL青霉素、链霉素的高糖DMEM培养基,37 ℃、5% CO2环境下培养。
待细胞长满瓶底80%~90%,胰酶消化细胞,计数,种于6孔板中,每孔2×105。
继续培养24 h后,分别加入80、60、40 μg/m L BAEB进行干预2 h。
然后将处于酵母相细胞的白念珠菌热灭活孢子(Candida albicans,C.A)计数,并制成3×106/mL悬液,每孔加入孢子悬液2 mL刺激细胞。
与Caco-2共培养24 h,用倒置显微镜初步观察不同浓度BAEB对C.A黏附Caco-2细胞的影响。
吸取上清,提取细胞总RNA。
2.3 MTT法筛选预保护Caco-2细胞的最佳BAEB浓度取对数生长期的Caco-2细胞,消化收集并稀释,按每孔2×105/mL浓度接种于96孔培养板中。
实验设置Caco-2细胞组、Caco-2细胞+BAEB用药组、Caco-2细胞+C.A组。
Caco-2细胞组加入完全培养基,Caco-2细胞+BAEB用药组分别加入40、60、80、100、120、140、160 μg/mL BAEB,Caco-2细胞+C.A组分别加入1×106、2×106、3×106、4×106、5×106 CFU/mL菌液。
置于37 ℃、5% CO2浓度的培养箱培养24 h 后,向其添加20 μL终浓度为5 mg/mL的MTT,继续培养4 h,除去上清液,并于每孔中添加150 μL的DMSO,混合均匀,置于酶联免疫检测仪上用490 nm的波长测定。
每组设置6个复孔,实验重复3次,数据取平均值。
按文献[11]的方法,计算细胞死亡率。
2.4 ELISA法检测Caco-2细胞IL-6、IL-8、IL-1β、HBD-2、HBD-3表达水平BAEB干预Caco-2细胞2 h,加入白念珠菌热灭活孢子刺激细胞24 h后收集细胞上清,4 000 r/min 离心10 min,10倍稀释后,分别用人IL-6、IL-8、IL-1β、HBD-2、HBD-3 ELISA检测试剂盒检测IL-6、IL-8、IL-1β、HBD-2、HBD-3表达水平,按试剂盒说明书操作。
每个样品重复3次,取平均值。
2.5 PCR法检测Caco-2细胞TLR1、TLR2、TLR4、TLR5基因的表达2.5.1 RNA的提取取共培养24 h的Caco-2细胞,将上清培养液吸至灭菌后的离心管内,备于ELISA法检测相关指标,6孔板内细胞用D-Hanks洗1遍,每孔中加入1 mL TRIzol液,参照试剂盒说明书进行提取,根据沉淀量,每管加入20~30 μL无RNA酶的双蒸水溶解沉淀,-80 ℃保存备用。
2.5.2 引物的设计与合成根据NCBI基因库查得所需基因序列,并用Primer Premier 5.0 软件设计所需引物,委托上海生工生物工程股份有限公司合成引物,各引物情况见表1。
2.5.3 反转录为cDNA 遵照TIANGEN公司FastQuantRT试剂盒(含gDNase)说明书的反应条件,将提取的总RNA反转录成cDNA。
反应配置均在冰上操作。
各引物序列见表1。
2.6 统计学方法所有数据应用SPSS 17.0统计软件进行分析处理,连续型变量采用“均数±标准差”进行统计学描述。
多组均数比较采用单因素方差分析,均数多重比较采用LSD检验(方差齐时)或Dunne tt’s T3检验(方差不齐时)。
以P<0.05为差异有统计学意义。
3.1 BAEB对Caco-2细胞活性的影响以80 μg/mL BAEB作用Caco-2细胞24 h 及3×106 CFU/mL C.A作用Caco-2细胞24 h后,Caco-2细胞生长即受到明显的抑制,与对照组比较,细胞存活率显著降低(P<0.05),故将此浓度的BAEB作为最佳干预浓度,见图1、图2。
同时,采用倒置显微镜观察不同浓度C.A对Caco-2细胞的影响,结果显示,模型组(Caco-2+C.A)黏附于Caco-2细胞的C.A 较多,BAEB干预组则C.A相对减少。
3.2 BAEB对C.A作用下Caco-2细胞上清液中IL-8、IL-6、IL-1β、HBD-2、HBD3表达水平的影响与对照组相比,模型组IL-8、IL-6、IL-1β、HBD-2、HBD3表达水平均显著升高(P<0.05);与模型组相比,BAEB高剂量组干预下Caco-2细胞上清液中IL-8、IL-6、IL-1β、HBD-2、HBD3表达水平均明显降低(P<0.05),BAEB中剂量组IL-1β、IL-6、HBD-2表达水平均明显降低(P<0.05),BAEB低剂量组仅IL-6表达水平显著降低(P<0.05)。
结果表明,BAEB高剂量可降低炎性因子表达水平。
见表2。
3.3 BAEB对C.A作用下Caco-2细胞TLRs mRNA表达的影响与对照组相比,模型组Caco-2细胞TLR1、TLR2、TLR4、TLR5 mRNA表达水平显著上调(P<0.05)。
与模型组比较,BAEB高剂量组TLR1、TLR2、TLR4、TLR5 mRNA表达水平,BAEB中剂量组TLR1、TLR2、TLR5 mRNA表达水平,以及BAEB低剂量组TLR4 mRNA表达水平均显著下调(P<0.05)。
见表3。
白念珠菌具有酵母-菌丝二相性,但在肠道主要依靠酵母相定植于黏膜。