高敏C反应蛋白检测试剂盒胶体金法

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101320041A [43]公开日2008年12月10日[21]申请号200710044730.1[22]申请日2007.08.09[21]申请号200710044730.1[71]申请人上海奥普生物医药有限公司地址201102上海市浦东新区碧波路328号C座3楼[72]发明人徐建新 [74]专利代理机构上海泰能知识产权代理事务所代理人黄志达 谢文凯[51]Int.CI.G01N 33/53 (2006.01)G01N 33/68 (2006.01)G01N 33/577 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页[54]发明名称一种快速定量检测C－反应蛋白的胶体金法及其应用[57]摘要本发明克服了常规C－反应蛋白(CRP)定量检测方法不适合单人份测试、检测时间较长等缺点，提供了一种快速、简便、准确的快速定量检测C－反应蛋白的胶体金法。

反应原理为固相双抗体夹心法的金标免疫斑点渗滤试验，待测样品经40－480倍稀释后与免疫胶体金在液相均质介质中混和均匀，再转加到反应板上，其中所含的、已与免疫胶体金在一起的待测物能为膜上固定的抗待测物另一决定簇的单抗或多抗特异性地捕获，呈红色斑点，斑点色泽与样品中CRP浓度呈正比。

200710044730.1权 利 要 求 书第1/1页1.一种快速定量检测C-反应蛋白(CRP)的胶体金法，其特征在于：待测样品经40-480倍稀释后与适当比例的抗待测物免疫胶体金在液相均质介质中充分混和均匀，再转加到反应板上，具体包括下列步骤：(1)从冷藏处取出抗CRP金标液冻干品，室温至少平衡半小时，在抗CRP金标液冻干品中，准确加入标贴或说明书中规定体积的冻干品复溶液摇匀；(2)吸取复溶后的金标液，加入空的反应管；(3)待测样品加入样品稀释液进行40-480倍稀释，充分混匀；(4)将反应板平放于实验台上，于反应孔内滴加封闭液，待完全渗入；(5)吸取稀释样品到反应管金标液中，充分混匀后将反应混合物全部加入到封闭后的反应板孔中；(6)待完全渗入后，加入洗涤液；(7)待洗涤液完全渗入后，测读CRP值。

超敏C反应蛋白测定试纸（胶体金免疫层析法）适用范围：用于体外定量测定人全血/血清/血浆样本中C反应蛋白（CRP）含量。

1.1包装规格卡型1人份、10人份/盒、20人份/盒、50人份/盒。

1.2主要组成成分每盒含10、20或50人份测定试纸和1张校准信息卡。

每人份测定试纸包括1人份hs-CRP测定试纸条、1包干燥剂和1支滴管。

hs-CRP测定试纸由玻璃纤维素膜（样品垫）、NC膜（T线包被鼠抗人CRP单克隆抗体；C线包被羊抗鼠IgG 多克隆抗体）、聚酯纤维素膜（包被胶体金标记的鼠抗人CRP单克隆抗体）、滤血膜、吸水纸、PVC胶板组成。

2.1物理性状2.1.1 外观测定试纸应整洁完整、无毛刺、无破损、无污染；材料附着牢固；标签字迹清晰，无破损。

2.1.2 膜条宽度测定试纸的膜条宽度不小于2.5mm。

2.1.3 液体移行速度液体移行速度应不低于10 mm/min。

2.2 空白限空白限应不高于0.5μg/mL。

2.3 精密度2.3.1重复性CV 应不高于10.0%。

2.3.2 批间差CV 应不高于15.0%。

2.4剂量-反应曲线的线性2.4.1线性相关系数在[0.5，64] μg/mL的范围内，用线性拟合公式拟合，剂量-反应曲线相关系数r应不低于0.99。

2.4.2线性相对偏差在（3，64]μg/mL的范围内，线性相对偏差应在±15%范围内。

2.4.3线性绝对偏差在[0.5，3] μg/mL的范围内，线性绝对偏差应不大于±0.45μg/mL。

2.5 准确度检测CRP抗原，样本回收率应在85%～115%范围内。

2.6特异性用浓度为100mg/L血清蛋白P溶液检测超敏C反应蛋白测定试纸，检测结果应小于0.5μg/mL。

2.7稳定性将测定试纸在4℃～30℃的环境中放置18个月后，取样分别检测2.1、2.2、2.3.1、2.4、2.5、2.6项，结果应符合各项目的要求。

超敏C-反应蛋白定量检测试剂盒（胶体金免疫层析法）参考值（参考范围）确定1 确定参考值（参考范围）所采用的样本来源样本选自广东省第二中医院检验科健康体检新鲜全血和血浆标本。

排除有明显心血管疾患的健康体检者215人，其中男性110人，女性105人；年龄≤44岁的60人， 45-54岁的40人， 55-64岁的45人， 65-74岁的45人，≥75岁的25人。

2 参考值（参考范围）确定的方法根据高等院校教材《医学统计学》中参考值的确定方法，有正态分布法和百分位数法。

因在健康人群中生化检验指标属正态分布数据，故选用正态分布法作为本项目的参考范围制定方法。

正态分布法样本量要求≥100例，本项目测定了215例样本。

因Hs-CRP测定结果升高才有临床意义，因此本项目选定95%单侧参考值范围：x+2S。

其中：x为均数，S为标准差，u值可在下表1中查出。

表1 医学参考值（参考范围）的正态分布法u界值表3 参考值（参考范围）确定的详细试验资料及总结仪器与试剂测定仪器：鸿琪公司的免疫定量分析仪测定试剂：本公司产“超敏C-反应蛋白测定试剂盒”；批号：，有效期至：2013-11-30Hs-CRP测定原始数据见表2a与表2b表2a 110例男性样本Hs-CRP测定值(mg/l)表2b 105例女性样本ALT测定值（U/L）经计算：男性：x= S=女性：x= S=查表得：双侧u=参考值（参考范围）的确定男性：x±=±×=5～40 U/L即健康男性血清ALT参考值（参考范围）为5～40 U/L女性：x±=±×=5～35 U/L即健康女性血清ALT参考值（参考范围）为5～35 U/L总结通过对240位健康体检者的血清ALT测定值的分析，测定数据呈正态分布，故采用正态分布法确定参考值。

经计算得出本地区正常成年男性血清ALT的参考范围的上限为40U/L,下限为5U/L；正常成年女性血清ALT的参考范围的上限为35U/L,下限为5U/L。

胶体金方法的优势以及灵敏度比对数据胶体金方法的优势以及灵敏度比对数据**公司新推出的胱抑素C测定试剂盒，采用胶体金包被抗体，胶体金颗粒在546nm有最大吸收，当胶体金颗粒和样本中的CysC抗原发生凝集时，在546nm的吸光度下降，吸光度值决定于CysC的浓度。

此方法避免了抗体在反应系统中初始吸光度较低造成灵敏度低的缺陷。

采用546nm可见光区检测胶体金颗粒吸光度的改变，使得测试结果特异性更强，而且吸光度变化更为稳定。

1.1 概述免疫胶体金技术（Immunogold Technique）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原-抗体反应的一种免疫标记技术。

胶体金（colloidal gold）是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂（如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等）的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用形成一种稳定的胶体状态。

胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合只是静电结合，所以蛋白质的生物学特性不受影响。

胶体金除了可以与蛋白质分子结合以外，还可以与许多其它生物大分子（如：SPA、PHA、ConA等）结合。

利用胶体金的一些物理性质（如：高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应等）以及结合物的免疫和生物学特性，胶体金被广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等许多领域，并且发展出了一系列实验和检测技术。

1.2 反应机理利用免疫胶体金技术进行液相免疫测定是基于金溶胶的重要特性：金颗粒与抗原（抗体）形成的结合物在溶胶状态颜色基本上保持不变，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色或蓝色（图1、图2）。

这一原理可应用于定性或定量的免疫反应。

图1：胶体金液相免疫测定原理图2：Cys C反应曲线免疫胶体金技术与胶乳增强免疫比浊法相比，该方法检测的灵敏度有了很大的提高。

1.3 与同类检测产品（胶乳加强免疫比浊法）比较：取**公司的试剂与B公司的试剂同在日立7060上对比检测，测试结果如下：【定标数据对比】校准液：***公司校准液，浓度为：0.00；0.50；1.00；2.00；4.00 ；8.00 mg/L共计六点校准1）通过实验测试以吸光度的变化率来看：从标准液各点的吸光度变化上看，B公司试剂的变化远远小于**试剂的变化。

C反应蛋白检测试剂盒（胶体金免疫层析法）
适用范围：本产品用于体外半定量检测人血清、血浆、全血样本中C反应蛋白。

1.1产品规格
条型：1人份/袋、1人份/盒、25人份/盒、50人份/盒、100人份/盒；
25人份/筒、25人份×4/盒。

卡型：1人份/袋、1人份/盒、25人份/盒、50人份/盒。

1.2主要组成成分
2.1外观
外观应整洁完整，无毛刺，无破损，无污染。

2.2膜条宽度
膜条宽度应不小于2.5mm。

2.3液体移行速度
液体移行速度应不低于10mm/min。

2.4 准确度
本产品用空白对照和0.5μg/mL、1.0μg/mL、3.0μg/mL、10.0μg/mLCRP 质控液，进行检测。

检测结果与相应参考溶液标示值相比，同向不超过一个量级，不得出现反向相差。

阳性参考溶液不得出现阴性结果，阴性参考溶液不得出现阳性结果。

2.5 重复性
检测结果的一致性不低于90%。

2.6 检出限
用浓度为1.0μg/mL C反应蛋白样品检测，结果不能为阴性。

2.7分析特异性
2.7.1 与胆红素的交叉反应
检测浓度为250ng/mL的胆红素，结果均应为阴性。

2.7.2 与胆固醇的交叉反应
检测浓度为250ng/mL的胆固醇，结果均应为阴性。

2.7.3 与人血红蛋白的交叉反应
检测浓度为150ng/mL的人血红蛋白，结果均应为阴性。

2.8 批间差
检测结果之间相差不超过一个量级。

2.9 稳定性
2℃～30℃贮存至有效期后2个月内，对产品进行检验，应符合2.3～2.7的要求。

C-反应蛋白（CRP）检测试剂盒（胶体金法）
适用范围：可定性检测人血清/血浆/全血样本中的常规C-反应蛋白（CRP）异常，用于CRP的临床辅助诊断。

1.1 条型：单人份/袋；25人份/筒
1.2 板型：单支/袋，10支/袋
1.3 主要组成成分
试剂系由抗-CRP单克隆抗体和抗鼠IgG多克隆抗体分别固相于硝酸纤维膜，并与胶体金标记的抗-CRP单抗（固相）制成。

稀释液成分：磷酸盐缓冲液（PBS）0.01 mol/L，pH 7.4。

2.1 物理性状
2.1.1 外观：试纸条整洁完整、无毛刺、无破损、无污染，标签应清晰。

2.1.2 液体移行速度：液体移行速度应≥10 mm/min。

2.1.3 条宽：试纸条宽度应≥2.5 mm。

2.2 最低检测限：应不高于10 mg/L。

2.3 特异性
2.3.1 与高胆红素样本的交叉反应：检测含有高胆红素（TBil≤200 μmol/L）的样本，结果应为阴性。

2.3.2 与高脂样本的交叉反应：检测含有高脂（TG≤20 mmol/L）的样本，结果应为阴性。

2.4 重复性
用10 mg/L的CRP重复性参考品平行检测10人份，其反应结果应一致。

2.5 稳定性
4℃～30℃条件下放置24个月后两个月内的试纸进行检测，产品的物理性能、最低检测限、特异性和重复性应符合2.1、2.2、2.3和2.4的要求。

2.6 批间差
取3个批号的试纸条，对重复性进行检测，要求反应结果均为阳性，且显色度均一。

专利名称：C反应蛋白胶体金定量检测试剂盒专利类型：实用新型专利
发明人：张国华
申请号：CN201220062352.6
申请日：20120224
公开号：CN202471725U
公开日：
20121003
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本实用新型涉及胶体金检测试剂盒领域，具体公开了一种C反应蛋白胶体金定量检测试剂盒，包括盒座、盒盖和试剂条，所述试剂条固定于所述盒座中部且位于所述盒座与盒盖之间，所述盒盖与盒座卡接，所述盒盖上设有加样口与观察口；所述试剂条包括塑料薄片以及固定于所述塑料薄片上头尾依次衔接的滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸；所述免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗CRP单克隆抗体I，所述免疫硝酸纤维素膜上设有两条分别包被有抗CRP单克隆抗体II的检测线和一条包被有羊抗鼠IgG的质控线。

本实用新型的试剂盒敏感性高、特异性强、操作简便省时，检测结果准确、稳定，适合定性及定量检测样本中的C反应蛋白。

申请人：上海凯创生物技术有限公司
地址：201317 上海市浦东新区下沙镇工业园区鹤立路
国籍：CN
代理机构：上海光华专利事务所
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胶体金检测试剂盒使用方法胶体金检测试剂盒是一种常用于生物医学研究和临床诊断中的实验试剂。

它利用胶体金颗粒与待检测物质发生特异性反应，通过观察胶体金颗粒的颜色变化来判断待测物质的存在与浓度。

下面将介绍胶体金检测试剂盒的使用方法。

1. 样品制备首先，我们需要准备待测样品。

具体制备方法根据不同的实验目的和待测物质而有所不同。

通常情况下，样品可以是血液、尿液、唾液等生物液体，或者是细胞培养上清液、细胞裂解液等。

2. 样品处理在使用胶体金检测试剂盒之前，需要对待测样品进行处理。

处理方法可以包括稀释、过滤、还原等步骤。

这些步骤的目的是为了提取和浓缩待测物质，同时排除其他干扰物质，以保证最终结果的准确性。

3. 试剂准备接下来，我们需要准备胶体金检测试剂盒的试剂。

试剂通常包括胶体金溶液、稀释缓冲液、控制品等。

根据试剂盒的要求，按照指定比例将试剂与样品混合。

4. 检测操作将混合好的样品和试剂溶液滴于胶体金检测试剂盒提供的检测条或孔板上。

确保每个样品和试剂的滴加顺序和时间相同，以保证结果的比较性。

5. 反应时间待检测物质与胶体金颗粒发生反应后，需要等待一定的时间让反应充分进行。

反应时间通常为几分钟到几十分钟不等，根据试剂盒的要求进行具体操作。

6. 观察结果观察胶体金颗粒的颜色变化。

正常情况下，胶体金颗粒呈现红色或紫色，与胶体颜色浓度成正比。

若待测物质存在，胶体金与待测物质发生特异性反应后，溶液颜色会发生变化，比如出现蓝色或者不规则沉淀。

7. 结果分析根据试剂盒上的说明书或者标准曲线，将观察到的颜色变化与已知浓度的标准物质进行比较，从而得到待测物质的浓度。

根据需要，还可以通过光密度计等仪器来量化测定。

总结：以上是胶体金检测试剂盒的使用方法。

使用者在操作过程中应当注意保持试剂的新鲜性和操作的准确性，避免与其他物质产生交叉反应，以确保检测结果的准确性和可靠性。

同时，还应当仔细读取试剂盒上的使用说明和注意事项，确保按照规定进行操作。

犬c反应蛋白检测方法
犬c反应蛋白（CRP）检测是一种常见的炎症指标检测方法。

以下是
目前常用的几种检测方法：
1.ELISA法：利用CRP特异性抗体进行检测，可定量测定CRP浓度。

该方法有高灵敏度和特异性，且操作简便，但需要专业人员进行操作。

2.胶体金法：将CRP与胶体金共价结合，再通过胶体金-抗体的反应
形成颜色变化，可定性检测CRP水平。

该方法快速简单，但定量测定精度
有限。

3.免疫荧光法：利用荧光染料标记CRP抗体，与样品中的CRP结合后，通过荧光显微镜观察染色物质的亮度和位置，可定性定量检测CRP浓度。

该方法有高灵敏度和特异性，能够检测到极低的CRP水平。

4.免疫层析法：利用CRP特异性抗体固定于膜上，样品中的CRP与抗
体结合后通过膜上滤过，形成具有颜色的线条，可用于定性检测CRP水平。

该方法操作简便，结果易于判读，但定量测定精度有限。

C反应蛋白测定试剂盒产品技术要求C反应蛋白(CRP)是一种在炎症反应过程中产生的蛋白质，可用于炎症性疾病的诊断和疾病监测。

胶体金免疫层析法是一种常用的CRP测定方法，其基本原理是将样品中的CRP与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，再与胶体金标记的第二抗体结合形成红色沉降线。

下面是C反应蛋白(CRP)测定试剂盒(胶体金免疫层析法)的产品技术要求。

1.试剂盒组成：试剂盒应包含标准品、检测缓冲液、胶体金标记的抗体、试纸、样品处理液等。

每个试剂应标明名称、规格、批号和有效期。

2.灵敏度：试剂盒的灵敏度应低于特定浓度的CRP，以确保能够准确测量样品中的CRP含量。

灵敏度应在规定的范围内。

3.特异性：试剂盒的特异性应高，能够准确测定样品中的CRP含量，而不受其他蛋白质的干扰。

特异性应在规定的范围内。

4.准确度：试剂盒的准确度应高，能够准确测定样品中的CRP含量。

应提供与已知浓度的CRP标准品相比的准确度数据。

5.稳定性：试剂盒中的试剂应具有良好的稳定性，能够在规定的保存条件下保持活性和有效性。

试剂的稳定性应在规定的时间范围内。

6.操作简便性：试剂盒应具有简便易操作的特点，使得使用者能够方便地进行测定。

试剂盒应提供详细的操作说明书和示意图。

7.时间效应：试剂盒应具有较短的测定时间，以满足临床实验室的快速检测需求。

测定时间应在规定的范围内。

8.存储条件：试剂盒的每个试剂应在标明的温度和湿度条件下存储，以确保试剂的稳定性和有效性。

9.试剂盒封装：试剂盒的每个试剂应采用密封包装，以防止污染和损坏。

试剂盒应提供合适的包装材料和封装方式。

10.质量控制：试剂盒应提供质量控制制品，以用于用户的质量控制过程。

质量控制制品应具有合适的浓度范围和稳定性。

总结：C反应蛋白(CRP)测定试剂盒(胶体金免疫层析法)的产品技术要求应包括试剂盒组成、灵敏度、特异性、准确度、稳定性、操作简便性、时间效应、存储条件、试剂盒封装和质量控制等方面。