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猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条的研制的开题报告一、研究背景及意义猪传染性胃肠炎（Porcine Epidemic Diarrhea，PED）是一种由猪传染性胃肠炎病毒引起的急性胃肠炎症，导致猪崭泻、呕吐、消瘦，尤其是对幼猪的危害更为严重，经常造成大量的猪只死亡。
2013年至2014年PED在中国迅速传播，给我国畜牧业和经济带来了严重的损失。
因此，如何及早发现PED的感染情况，对于保障养猪业生产、实现养猪业的可持续发展具有重要意义。
目前，PED的诊断主要以病原学检测为基础，包括病毒抗体检测和核酸检测。
PCR、实时荧光PCR、细胞培养和酶联免疫吸附试验等被广泛用于PED的检测，但由于这些方法需要高昂的设备和专业人员，不利于现场快速诊断，因此需要开发一种简便、快速、经济、敏感和特异性较好的PED检测方法。
现有的研究表明，利用胶体金技术和免疫层析技术结合，可以制备出一种简便、快速、经济、敏感和特异性较好的PED检测方法，包括PED胶体金免疫层析试纸条。
这种试纸条不需要显微镜观察，只需要通过肉眼观察检测结果即可，能够满足现场检测的需求。
因此，本研究拟开发PED胶体金免疫层析试纸条，以期提高PED的诊断水平，为养猪业提供更好的保障。
二、研究内容及方法1. PED病毒抗原的克隆和表达：通过PCR扩增PED病毒N基因，并将其克隆到表达载体pET28a(+)中，利用大肠杆菌表达PED病毒N基因。
采用亲和层析和SDS-PAGE等方法提取纯化重组蛋白；2. PED胶体金免疫层析试纸条的研制：将制备的PED病毒N蛋白标记在胶体金颗粒表面，制备PED胶体金。
将制备的PED胶体金涂覆在膜的测试线位，根据PED病毒N蛋白的特异性，将抗PED病毒的单克隆抗体固定在纸条的测试线位上。
同时，将抗鸡IgG的单克隆抗体固定在控制线位上。
制备PED胶体金免疫层析试纸条。
3. PED胶体金免疫层析试纸条的性能评价：测量PED胶体金免疫层析试纸条的检测限、特异性和灵敏度；通过实验比较PED胶体金免疫层析试纸条和PCR、实时荧光PCR等方法的检测结果并进行统计学分析，评价PED胶体金免疫层析试纸条的准确度、去假阳性率和去假阴性率等。
胶体金免疫层析技术在食品检测中的应用研究胶体金免疫层析技术是一种在食品检测中广泛应用的方法。
该技术利用胶体金颗粒的特性，在固体支撑上进行免疫层析反应，实现对分析物的检测。
本文将从胶体金免疫层析技术的原理、方法和应用等方面进行介绍，并探讨该技术在食品检测中的优势和未来发展方向。
首先，胶体金免疫层析技术是基于免疫学原理的一种快速、灵敏、特异的检测方法。
该技术利用胶体金颗粒的特殊性质，即在纳米尺度下具有高度可控的光学和电化学性质。
由于胶体金颗粒的尺寸和形态可以通过调整合成条件进行控制，因此可以用于检测不同大小和形态的分析物，包括蛋白质、DNA、细菌等。
其次，胶体金免疫层析技术的方法简单、操作便捷、成本低廉。
在实际操作中，只需将样品滴加到含有胶体金颗粒和特异抗体的免疫纸条上，然后等待几分钟即可观察到胶体金颗粒在纸条上的迁移情况。
通过观察纸条上的色带出现与否以及色带的颜色变化，可以判断样品中是否存在目标分析物，并进行定量分析。
相比于传统的基于酶标记技术的免疫层析方法，胶体金免疫层析技术不需要复杂的仪器设备和多步酶标记过程，因此更加简便快速。
再次，胶体金免疫层析技术在食品检测中具有广泛应用前景。
目前，该技术已被应用于多种食品中的残留物检测，包括食品中的农药、重金属、毒素等。
例如，研究人员利用胶体金免疫层析技术能够检测到食品中的抗生素残留、农药残留、酶毒素等，在食品安全监测中起到了重要的作用。
此外，胶体金免疫层析技术还可以应用于快速检测食品中的转基因成分、食品中的过敏原等。
最后，尽管胶体金免疫层析技术在食品检测中已经取得了一定的成就，但仍面临一些挑战和未解决的问题。
例如，该技术在样品预处理、灵敏度、特异性等方面还需要进一步优化和改进。
此外，胶体金颗粒的稳定性和存储问题也需要解决，以确保该技术能够在实际应用中长期稳定地实现。
因此，未来的研究方向应该着重解决这些问题，提高胶体金免疫层析技术的准确度和可靠性。
综上所述，胶体金免疫层析技术作为一种快速、灵敏、特异的检测方法，具有广泛的应用潜力。
胶体金免疫层析法在食品快速检测中的应用研究进展谢桂芳，赖 飞，王艺蓉，周雪丽，王晓鹭，蔡 滔*（贵州省农产品质量安全监督检验测试中心，贵州贵阳 550001）摘 要：近年来，随着城市化进程加快，各类食品流通更为频繁，食品安全问题日益凸显,人们越来越关注食品安全，而准确、快速的检测方法是保证食品安全的重要手段。
本文介绍了胶体金免疫层析技术的基本原理和制备方法，并概述了其在检测食品中农药残留、霉菌毒素、食源性致病菌、重金属和非法添加剂等方面的应用及前景，为我国食品安全快速定量检测技术提供思路方法。
关键词：胶体金免疫层析技术；食品安全；快速检测The Progress of the Application of Colloidal GoldImmunochromatography in Rapid Food DetectionXIE Guifang, LAI Fei, WANG Yirong, ZHOU Xueli, WANG Xiaolu, CAI Tao* (Guizhou Agricultural Products Quality and Safety Supervision and Testing Center, Guiyang 550001, China) Abstract: In recent years, with the acceleration of urbanization, the circulation of various foods has become more frequent, and food safety issues have become increasingly prominent. People are paying more and more attention to food safety, and accurate and rapid detection methods are important means to ensure food safety. This paper introduces the basic principle and preparation method of colloidal gold immunochromatography technology, and outlines its application and prospects in the detection of pesticide residues, mycotoxins, foodborne pathogens, heavy metals, and illegal additives in food, providing ideas and methods for rapid quantitative detection of food safety in China.Keywords: colloidal gold immunochromatographic technology; food safety; rapidly detection近年来，食品安全事件频发，食品安全问题也受到了社会的高度关注。
免疫胶体金快速诊断技术的临床应用研究摘要：免疫胶体金快速诊断技术是在免疫荧光、放射性免疫和酶联免疫吸附法之后逐渐发展起来的免疫测定技术，在临床诊断中的应用，能够缩短临床诊断的速度，解决临床诊断中的问题，提升临床诊断的质量与效果，降低误诊、漏诊等问题的发生几率。
本篇文章主要从免疫胶体金技术的基本原理以及免疫胶体金快速诊断技术的临床应用等方面进行分析，结合当前临床诊断技术的发展，对免疫胶体金快速诊断技术进行研究。
关键词：免疫胶体金；快速诊断技术免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique，ICGT）是以胶体金作为示踪标志物，在抗原抗体反应中应用的新型免疫标记技术。
胶体金能够通过氯金酸在抗坏血酸、白磷等作用下，聚合形成一定大小的金颗粒，从而成为胶体金。
免疫胶体金快速诊断技术在临床诊断中的应用，能够有效提升临床诊断的质量，并逐渐发展成为一种临床检验的有效方式。
本篇文章主要结合临床诊断实际应用情况，对免疫胶体金快速诊断技术进行分析和研究，希望能够对临床诊断技术的不断发展以及患者的全面治疗产生一定的积极影响，以下为本次临床应用实践研究的具体内容。
1. 免疫胶体金技术的基本原理免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique，ICGT）主要是在还原剂的作用下，凝合而成的金颗粒，在弱碱的条件中带负电荷，进而和蛋白质分子中的正电荷基团组成较为坚固的结合体。
在这种静电结合下，不会影响蛋白质生物的特性。
除此之外，胶体金还能够和一些生物大分子相组合，例如能够和葡萄球菌A 蛋白（Staphylococcal protein A,SPA）、免疫球蛋白（immunoglobulin）以及抗生素（antibacterial）等进行结合，进而成为免疫的优良标记物[1-2]。
当前，免疫胶体金技术已经逐渐应用于临床诊断当中，并取得了较好的临床诊断应用效果，在被动凝集试验、光镜染色以及免疫印迹等多种临床诊断中应用。
胶体金免疫层析技术胶体金免疫层析技术是一种重要的生物分析技术，它在医学诊断、生物学研究、环境监测等领域有着广泛的应用。
本文将介绍胶体金免疫层析技术的原理、方法、应用及发展前景等方面，以帮助读者深入了解这一技术的重要性和特点。
一、胶体金免疫层析技术的原理胶体金免疫层析技术是一种基于抗原与抗体特异性结合原理的生物分析技术。
其原理基于胶体金颗粒的特殊性质，当胶体金颗粒与特定的抗体或抗原结合时，会产生颜色变化。
这种颜色变化可以通过裸眼观察或仪器测定来定量分析目标物质的含量，从而实现对目标分子的快速、灵敏、特异性检测。
二、胶体金免疫层析技术的方法1. 样品预处理在进行胶体金免疫层析技术前，需要对样品进行一定的预处理工作，以获得高纯度的检测目标。
这包括样品的收集、提取、稀释、清洁等操作，以确保样品的纯度和稳定性。
2. 抗原抗体结合在胶体金免疫层析技术中，首先将抗原或抗体与胶体金颗粒结合，形成胶体金-抗原或胶体金-抗体复合物。
这一步是整个技术的关键，其特异性结合决定了最终结果的准确性和可靠性。
3. 层析纸制备将样品和复合物应用于层析纸上，经过升温、冷却和其他特殊处理，使复合物在层析纸上呈现出清晰的条带，以便进行后续的观察和分析。
4. 结果分析通过裸眼观察或仪器测定，分析样品中的目标分子的含量，从而得出最终的检测结果。
三、胶体金免疫层析技术的应用1. 医学诊断胶体金免疫层析技术在临床医学中被广泛应用，例如对传染病、肿瘤标志物、生化指标等的快速检测，为疾病的早期诊断和治疗提供了重要的支持。
2. 食品安全该技术可以用于食品中有害物质的检测，如农药残留、重金属污染等，确保食品的安全和健康。
3. 环境监测胶体金免疫层析技术也可以用于环境监测领域，检测水质、土壤质量等环境参数，为环境保护和生态平衡提供数据支持。
四、胶体金免疫层析技术的发展前景随着生物技术和纳米技术的不断发展，胶体金免疫层析技术将得到更广泛的应用和改进。
未来，可以预见该技术在药物筛选、基因检测、个性化医疗等领域将发挥越来越重要的作用。
第３４卷第６期化㊀学㊀研㊀究Ｖｏｌ．３４㊀Ｎｏ．６２０２３年１１月ＣＨＥＭＩＣＡＬ㊀ＲＥＳＥＡＲＣＨＮｏｖ．２０２３黄曲霉毒素Ｂ１胶体金免疫层析试纸条的制备及性能研究董高丽１，江迎春２，郭㊀宁１，杨爽爽１，樊海亮１，刘闯军１∗，徐启杰１∗，李瑞玲１，丁亚龙１（１．黄淮学院化学与制药工程学院，河南驻马店４６３０００；２．黄淮学院医学院，河南驻马店４６３０００）收稿日期：２０２３⁃０３⁃１０基金项目：国家自然科学基金项目（５１５０６０２３，５１６７６１９０，５１６７６１９６）；河南省高等学校重点科研项目（２３Ａ１５００４７）；河南省科技发展计划项目（１１２１０２３１０６４９）作者简介：董高丽（１９７９－），女，讲师，研究方向为分析化学㊂∗通信作者，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｌｉｕｃｈｕａｎｇｊｕｎ＠ｈｕａｎｇｈｕａｉ．ｅｄｕ．ｃｎ；ｑｉｊｉｅ００１＠１６３．ｃｏｍ摘㊀要：以黄曲霉毒素Ｂ１为研究对象，制作出一种可实现对黄曲霉毒素Ｂ１含量快速检测的胶体金试纸条㊂实验采用竞争抑制法，基于试纸条的层析作用，以胶体金为标记物与黄曲霉毒素Ｂ１单抗偶联，将黄曲霉毒素Ｂ１抗原和羊抗鼠二抗固定到硝酸纤维膜上作为检测线和质控线，制备出可以快速检测黄曲霉毒素Ｂ１的免疫层析试纸条㊂通过优化，试纸条在３７ħ条件下，分别在５㊁１０㊁１５㊁２０ｄ后测试，效果没有明显降低，检测灵敏度为２０ｎｇ／ｍＬ；与磺胺类药物㊁ 瘦肉精 类药物均无交叉反应㊂该试纸条具有良好的稳定性和特异性，可实现生物样本中黄曲霉毒素Ｂ１的快速大量检测㊂关键词：黄曲霉毒素Ｂ１；胶体金；试纸条；抗体；快速检测中图分类号：Ｏ６５６．４文献标志码：Ａ文章编号：１００８－１０１１（２０２３）０６－０５１１－０５ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１ｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｓｔｒｉｐＤＯＮＧＧａｏｌｉ１ ＪＩＡＮＧＹｉｎｇｃｈｕｎ２ ＧＵＯＮｉｎｇ１ ＹＡＮＧＳｈｕａｎｇｓｈｕａｎｇ１ＦＡＮＨａｉｌｉａｎｇ１ ＬＩＵＣｈｕａｎｇｊｕｎ１∗ ＸＵＱｉｊｉｅ１∗ ＬＩＲｕｉｌｉｎｇ１ ＤＩＮＧＹａｌｏｎｇ１１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＨｕａｎｇｈｕａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｚｈｕｍａｄｉａｎ４６３０００ Ｈｅｎａｎ Ｃｈｉｎａ２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ ＨｕａｎｇｈｕａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｚｈｕｍａｄｉａｎ４６３０００ Ｈｅｎａｎ ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ ＡｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄｔｅｓｔｓｔｒｉｐｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｆｏｒｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ，ｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄｗａｓｕｓｅｄａｓａｍａｒｋｅｒｔｏｃｏｕｐｌｅｗｉｔｈａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｄａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１ａｎｔｉｇｅｎａｎｄｇｏａｔａｎｔｉ⁃ｍｏｕｓｅｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｔｉｂｏｄｙｗｅｒｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｏｎｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｍｅｍｂｒａｎｅａｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｔｅｓｔｓｔｒｉｐｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄｔｅｓｔｅｄａｔ３７ħｆｏｒ５，１０，１５ａｎｄ２０ｄａｙｓ，ｗｉｔｈｏｕｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｅｃｒｅａｓｅｉｎｅｆｆｉｃａｃｙａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（２０ｎｇ／ｍＬ）．ＴｈｅｔｅｓｔｓｔｒｉｐｓｈａｖｅｇｏｏｄｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｒａｐｉｄａｎｄｂｕｌｋｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１ｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１；ｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄ；ｔｅｓｔｓｔｒｉｐ；ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ㊀㊀黄曲霉毒素（Ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ，ＡＦｓ）主要是由黄曲霉和寄生曲霉代谢产生的衍生化合物，化学结构类似于二呋喃香豆素［１］，是一类毒性很强的生物毒素㊂ＡＦｓ最早发现于英国伦敦郊区的大规模火鸡死亡事件，后研究发现因火鸡饲料中含有霉变的花生饼，这种霉菌产生的次级代谢产物是主要致病因，研究人员将其命名为黄曲霉毒素［２－３］㊂黄曲霉毒素种类多达２０种，紫外光照射下发出荧光，根据荧光颜色不同分为Ｂ族㊁Ｇ族和Ｍ族［４］，常见的有ＡＦＢ１㊁ＡＦＢ２㊁ＡＦＧ１㊁ＡＦＧ２㊁ＡＦＭ１㊁ＡＦＭ２㊂其中，ＡＦＢ１的毒性最大且污染广㊁理化性质稳定㊁致癌力强，是黄曲霉毒素中最主要的毒素成分㊂ＡＦＢ１进入人体后在肝脏中存留最多，对肝脏的损害最大，除肝脏外，其他脏器也会发生退行性病变［５］㊂在生命体内部ＡＦＢ１会直５１２㊀化㊀学㊀研㊀究２０２３年接导致超氧化物歧化酶㊁过氧化氢酶㊁谷胱甘肽硫转移酶等酶浓度的下降，因此ＡＦＢ１能够引起机体内细胞凋亡［６］㊂人若误食了黄曲霉毒素污染的食品，轻则可能出现发热㊁腹痛㊁呕吐㊁食欲减退等症状，重则可能出现肝区疼痛㊁下肢浮肿及肝功能异常等中毒性肝病症状，甚至导致肝癌发生［７］㊂因此建立一种高效快速的检测方法对ＡＦＢ１进行监测和控制，对保障食品安全以及人类健康具有重要意义［８－１２］㊂胶体金免疫层析技术是将多种方法有机结合到一起的固相免疫标记检测技术［１３］㊂胶体金粒子作为有色标记物对蛋白质具有较强的吸附能力，可以与霉菌毒素㊁酶㊁抗生素㊁农药残留㊁激素㊁牛血清蛋白多肽络合物等结合，通过直接观察显色情况短时间内获得检测结果㊂该方法最大特点是检测迅速㊁安全简便且不需要专业人员和仪器设备，适用于基层推广㊁现场快速监测等［１４－１６］㊂本实验采用胶体金免疫层析技术，以有色的胶体金粒子作为标记物与特异性黄曲霉毒素Ｂ１抗体结合制备出相应的金标抗体，利用竞争抑制原理制备黄曲霉毒素Ｂ１免疫层析试纸条，实现对生物样本中黄曲霉毒素Ｂ１的快速检测㊂１㊀实验材料与方法１．１㊀实验材料与仪器㊀㊀胶体金（４０ｎｍ长沙美牛生物科技有限公司），黄曲霉毒素Ｂ１单抗抗原等（广州优抗多生物技术有限公司），黄曲霉毒素Ｂ１标准品，羊抗鼠二抗ＩｇＧ，牛血清蛋白（ＢＳＡ），ＰＥＧ⁃２０００，硝酸纤维膜，玻璃纤维膜㊁吸水纸㊁ＰＶＣ衬板，ＸＹＺ三维划膜喷金仪㊁微电脑自动斩切机，数控裁条机，冷冻离心机㊂１．２㊀胶体金⁃黄曲霉毒素Ｂ１抗体偶联物制备㊀㊀移取１ｍＬ胶体金溶液于１．５ｍＬ离心管中，用０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ或０．１ｍｏｌ／Ｌ的Ｋ２ＣＯ３调节胶体金的ｐＨ到最佳，使用小型涡旋混合器摇匀㊂加入稀释为０．５ｍｇ／ｍＬ的黄曲霉毒素Ｂ１抗体，在小型涡旋混合器摇３ ５ｍｉｎ，４ħ环境下静置孵育３０ｍｉｎ㊂孵育后加入终浓度为０．５％的１０％ＢＳＡ溶液并混匀，在４ħ环境中封闭３０ｍｉｎ㊂然后将溶液放置在冷冻离心机中㊂调节温度为４ħ，转速１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ㊂离心后用注射器移除上清液，用配制的重悬液进行３次洗涤，最后一次离心后用重悬液复溶至原溶液体积的１／１０，制得胶体金溶液㊂本实验选择０．０１％硼酸＋１％ＢＳＡ＋１０％海藻糖＋０．２％ＰＥＧ２０００＋０．２５％吐温－２０作为重悬液配方，为提高试纸条保存时间，在重悬液中加入０．０２％生物防腐剂㊂１．３㊀胶体金免疫层析试纸条的制备１．３．１㊀硝酸纤维素膜的包被㊀㊀分别以黄曲霉毒素抗原和羊抗鼠ＩｇＧ抗体为硝酸纤维素膜（ＮＣ膜）上的检测线（Ｔ线）和质控线（Ｃ线）的包被物㊂使用ＸＹＺ三维划膜喷金仪在ＮＣ膜上划出两条平行且均匀的线㊂于恒温干燥箱中３７ħ烘干２ｈ，待用㊂１．３．２㊀样品垫、结合垫预处理用数控感应斩切机将玻璃纤维膜（型号：Ｚ７０）裁剪到尺寸为１００ｍｍˑ９ｍｍ的长条，将长条浸泡到结合垫处理液中２ｈ，阴凉处晾１ｈ，放入３７ħ恒温干燥箱烘干３ｈ，装入密封袋备用㊂将型号为ＳＢ０６的玻璃纤维膜裁成尺寸为１００ｍｍˑ１８ｍｍ长条，按照同样操作用样品垫处理液浸泡烘干㊂１．３．３㊀试纸条的组装使用ＸＹＺ三维划膜喷金仪将制备好的胶体金溶液均匀喷到结合垫上，在烘箱中烘干２ｈ㊂然后，在ＰＶＣ底板上按照ＮＣ膜㊁吸水纸㊁喷金后结合垫㊁样品垫的顺序依次粘贴，并且在接连处需要重叠１ｍｍ，如图１所示㊂将粘贴好的板子用数控裁条机裁切成３ｍｍ宽的试纸条，装壳后密封干燥保存㊂图１㊀试纸条粘板示意图Ｆｉｇ．１㊀Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｔｅｓｔｓｔｒｉｐｓｔｉｃｋｉｎｇｂｏａｒｄ１．４㊀试纸条性能测试制备的试纸条需要在阴性样本和不同浓度的阳性样本中测试，检测所制备的试纸条的灵敏度㊁稳定性以及长时间储存后其稳定性情况㊂滴加８０μＬ样本到试纸条加样口，在１０ｍｉｎ内观察其Ｔ㊁Ｃ线显色情况㊂如果Ｔ线显色㊁Ｃ线显色为阴性；如果Ｃ线显色㊁Ｔ线不显色为阳性；如果Ｃ线显色，Ｔ线显色相对较弱，则为弱阳性；如果Ｃ线不显色，则产品无效，如图２所示㊂第６期董高丽等：黄曲霉毒素Ｂ１胶体金免疫层析试纸条的制备及性能研究５１３㊀图２㊀胶体金免疫层析试纸条结果说明示意图Ｆｉｇ．２㊀Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｓｔｒｉｐ２㊀实验结果与讨论２．１㊀胶体金免疫层析试纸条的优化２．１．１㊀最佳ｐＨ确定及优化㊀㊀移取１ｍＬ胶体金溶液于２．０ｍＬ离心管中，用０．１ｍｏｌ／Ｌ的Ｋ２ＣＯ３调节胶体金的ｐＨ为５．０㊁６．０㊁７．０㊁８．０㊁９．０㊁１０．０，其中调节ｐＨ为５．０时加入４μＬ０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ，其他ｐＨ加入０．１ｍｏｌ／Ｌ的Ｋ２ＣＯ３量分别为２㊁６㊁１０㊁１６㊁２２和３２μＬ㊂然后均加入稀释为０．５ｍｇ／ｍＬ的黄曲霉毒素Ｂ１抗体８μＬ，使用小型涡旋混合器充分摇匀后，低温孵育３０ｍｉｎ，加入１０μＬ１０％ＮａＣｌ溶液，混合均匀后，低温静置２ｈ㊂观察到各管中胶体金颜色发生明显变化，当ｐＨȡ６时溶液颜色为酒红色且无聚沉现象，因此ｐＨ＝６为最佳ｐＨ，如图３所示㊂但由于ｐＨ试纸的准确度有限，对Ｋ２ＣＯ３在ｐＨ＝６时的加入量进行了优化，加入０．１ｍｏｌ／Ｌ的Ｋ２ＣＯ３量分别为１㊁２㊁３㊁４㊁５μＬ，用制备好的试纸条进行空白测试，反应１０ｍｉｎ后对Ｃ㊁Ｔ线的颜色进行比较，加入１μＬ的Ｋ２ＣＯ３表达效果最好㊂图３㊀不同ｐＨ值时胶体金颜色对比示意图Ｆｉｇ．３㊀ＣｏｌｌｏｉｄｇｏｌｄｃｏｌｏｒｃｏｎｔｒａｓｔｄｉａｇｒａｍｗｈｅｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｖａｌｕｅｓ２．１．２㊀最佳抗体标记量的确定取５支１．５ｍＬ离心管各加入１ｍＬ胶体金，调节ｐＨ为６，分别加入稀释为０．５ｇ／Ｌ的黄曲霉毒素Ｂ１抗体２㊁４㊁８㊁１２和１６μＬ，其他条件不变，按步骤制备金标液，做成试纸条进行测试，找到显色明显的最低抗体使用量㊂如图４所示，从左至右分别为加了２㊁４㊁８㊁１２和１６μＬ的黄曲霉毒素Ｂ１抗体（０．５ｍｇ／ｍＬ）的测试结果㊂通过观察可以看出随着抗体量增加Ｔ㊁Ｃ线颜色逐渐加深，抗体量达到８μＬ时颜色几乎不变且两条线颜色亮度均匀，因此选择加入８μＬ抗体即抗体含量为４μｇ时为最佳抗体量，如图４所示㊂图４㊀不同ｐＨ时胶体金颜色对比示意图Ｆｉｇ．４㊀Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｌａｂｅｌｉｎｇａｍｏｕｎｔｓ２．１．３㊀ＮＣ膜材料的筛择在免疫层析检测中，包被在硝酸纤维素膜上的蛋白质作为待测样本的捕获试剂，ＮＣ膜需要具备良好的吸附效果，ＮＣ膜的性能对于试纸条的性能好坏有很大的影响，因此选择合适型号的ＮＣ膜至关重要㊂本文对比了国内外三种型号的ＮＣ膜（ＪＪ－１２０㊁ＪＪ－１４０㊁ＣＮ１４０），通过对Ｔ线和Ｃ线的显色情况进行观察，最终选择ＪＪ１４０型号的ＮＣ膜，如图５所示㊂图５㊀不同型号ＮＣ膜筛选示意图Ｆｉｇ．５㊀ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｍｏｄｅｌｓｏｆＮＣｆｉｌｍｓｃｒｅｅｎｉｎｇｄｉａｇｒａｍ２．１．４㊀抗原、二抗固定量的选择通过筛选，选择使用上海士锋生物科技有限公司生产的黄曲霉毒素Ｂ１抗原和杭州隆基生物技术５１４㊀化㊀学㊀研㊀究２０２３年有限公司生产的羊抗鼠ＩｇＧ抗体，用含１５％蔗糖的ＰＢＳ缓冲溶液将黄曲霉毒素Ｂ１抗原稀释至浓度为０．２㊁０．３㊁０．４ｇ／Ｌ，用含有３％的甲醇和０．０３％的Ｔｒｉ⁃ｔｏｎＸ－１００的ＰＢＳ溶液将羊抗鼠ＩｇＧ抗体稀释至浓度为０．２㊁０．３㊁０．４㊁０．５ｇ／Ｌ㊂其中，加入终浓度为３％的甲醇溶液是为了使Ｃ线变宽㊂按照表１交叉组合方式使用ＸＹＺ三维喷金划线仪进行划线并制备成相应试纸条，使用阴性提取液跑板，观察显色情况㊂在保证试纸条灵敏度的前提下，阴性样品的检测线（Ｔ线）和质控线（Ｃ线）的颜色均匀且深浅一致㊂最终选择Ｔ线浓度为０．２ｇ／Ｌ，Ｃ线浓度为０．４ｇ／Ｌ的固定量，如图６所示㊂表１㊀抗原㊁二抗不同包被量的选择Ｔａｂｌｅ１Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏａｔｉｎｇａｍｏｕｎｔｓｏｆａｎｔｉｇｅｎｉｃｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ浓度１２３４５Ｔ线（ｇ／Ｌ）０．２０．２０．２０．３０．４Ｃ线（ｇ／Ｌ）０．２０．３０．４０．５０．４图６㊀抗原㊁二抗不同包被浓度示意图Ｆｉｇ．６㊀Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏａｔｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆａｎｔｉｇｅｎｔｉｃｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ２．２㊀性能测试２．２．１㊀灵敏度㊀㊀将黄曲霉毒素Ｂ１标椎品稀释为５㊁１０㊁２０㊁３０㊁４０μｇ／Ｌ，分别对应图７中的５㊁４㊁３㊁２㊁１，各滴加８０μＬ于试纸条上，５ １０ｍｉｎ内观察显色情况，用三重蒸馏水作为阴性样本（对应图７中的６）㊂相对阴性样本Ｔ线颜色明显变淡则为弱阳性，Ｔ线颜色消失则为阳性，Ｔ线消失时对应的浓度为检出限㊂如图７所示，研制的试纸条在１０μｇ／Ｌ时Ｔ线颜色明显变淡，在２０μｇ／Ｌ时Ｔ线消失，因此本试纸条的检出限为２０μｇ／Ｌ㊂图７㊀试纸条灵敏度测试Ｆｉｇ．７㊀Ｔｅｓｔｓｔｒｉｐｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ２．２．２㊀特异性测试特异性时，由于条件限制，采用了同组成员的标准品进行了测试，即磺胺以及瘦肉精类的莱克多巴胺和盐酸克伦特罗㊂测试结果如图８所示：在制备的试纸条上分别滴加２０μｇ／Ｌ黄曲霉毒素Ｂ１标准品㊁８０μｇ／Ｌ磺胺标准品㊁８０μｇ／Ｌ瘦肉精类标准品㊂如图８所示，２０μｇ／Ｌ黄曲霉毒素Ｂ１标准品Ｔ线消失，而其他几种８０μｇ／Ｌ浓度标准品结果与阴性样本测试结果无异㊂制作的黄曲霉毒素Ｂ１胶体金试纸条特异性符合检测要求㊂图８㊀试纸条特异性测试Ｆｉｇ．８㊀Ｔｅｓｔｓｔｒｉｐｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ２．２．３㊀稳定性在２５ħ条件下，对储藏５㊁１０㊁２０㊁３０ｄ时使用阴性和２０μｇ／Ｌ的阳性标品进行测试，结果如图９所示㊂从左至右依次为第５㊁１０㊁２０㊁３０ｄ时的测试结果，可以看出，阴性和阳性测试结果均比较理想，说明所制备的试纸条的稳定性符合使用要求㊂图９㊀试纸条稳定性测试Ｆｉｇ．９㊀Ｔｅｓｔｓｔｒｉｐｓｔａｂｉｌｉｔｙ３㊀结论基于胶体金竞争抑制法原理，通过标记方案的改变，不同材料的选择，改进了黄曲霉毒素Ｂ１免疫层析产品的稳定性能和灵敏度，并对所制备的黄曲霉毒素Ｂ１胶体金免疫层析试纸条进行了特异性㊁稳定性㊁精密性测试，结果达到了试纸条的使用要求㊂另外，所设计制备的黄曲霉毒素Ｂ１胶体金免疫层析试纸条，具有成本第６期董高丽等：黄曲霉毒素Ｂ１胶体金免疫层析试纸条的制备及性能研究５１５㊀低廉㊁携带方便㊁适合现场检测等优点，可实现对大量样本中的黄曲霉毒素Ｂ１进行快速检测，有望在未来黄曲霉素的检测领域发挥作用㊂参考文献：［１］ＤＡＳＩＬＶＡＪＢ，ＰＯＺＺＩＣＲ，ＭＡＬＬＯＺＺＩＭＡＢ，ｅｔａｌ．ＭｙｃｏｆｌｏｒａａｎｄｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１ａｎｄｆｕｍｏｎｉｓｉｎＢ１ｄｕｒｉｎｇｓｔｏｒａｇｅｏｆＢｒａｚｉｌｉａｎｓｏｒｇｈｕｍ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，４８（９）：４３５２⁃４３５６．［２］高秀洁，邓中平，焦红，等．黄曲霉毒素Ｂ１快速检测方法的研究进展［Ｊ］．热带医学杂志，２００８，８（１２）：１２９７⁃１３００．ＧＡＯＸＪ，ＤＥＮＧＺＰ，ＪＩＡＯＨ，ｅｔａｌ．ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅｒａｐｉｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，８（１２）：１２９７⁃１３００．［３］ＲＡＳＴＯＧＩＲ，ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡＡＫ，ＲＡＳＴＯＧＩＡＫ．ＬｏｎｇｔｅｒｍｅｆｆｅｃｔｏｆａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１ｏｎｌｉｐｉｄｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎｉｎｒａｔｌｉｖｅｒａｎｄｋｉｄｎｅｙ：ｅｆｆｅｃｔｏｆｐｉｃｒｏｌｉｖａｎｄｓｉｌｙｍａｒｉｎ［Ｊ］．ＰｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙＲｅｓｅａｒｃｈ，２００１，１５（４）：３０７⁃３１０．［４］林雅宁，徐忠玉．黄曲霉毒素Ｂ１诱发昆明鼠高血氨的实验研究［Ｊ］．国际检验医学杂志，２０１４，３５（２）：１３２⁃１３３．ＬＩＮＹＮ，ＸＵＺＹ．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｓｔｕｄｙｏｎｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｅｍｉａｏｆＫＭｍｏｕｓｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１４，３５（２）：１３２⁃１３３．［５］居乃琥．黄曲霉毒素［Ｍ］．北京：北京轻工业出版社，１９８０．ＪＵＮＨ．Ａｆｌａｔｏｘｉｎ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＢｅｉｊｉｎｇＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒｙＰｒｅｓｓ，１９８０．［６］王海彬．花生中黄曲霉毒素免疫层析快速定量技术研究［Ｄ］．北京：中国农业科学院，２０１２．ＷＡＮＧＨＢ．Ｓｔｕｄｙｏｎａｎｅｎｈａｎｃｅｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃａｓｓａｙｆｏｒａｆｌａｔｏｘｉｎｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｐｅａｎｕｔｓ［Ｄ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２．［７］刘美辰，李培真，郭健，等．胶体金测试条法对粮食中赭曲霉毒素快速定量测定的研究［Ｊ］．粮食与食品工业，２０１３，２０（３）：６２⁃６４．ＬＩＵＭＣ，ＬＩＰＺ，ＧＵＯＪ，ｅｔａｌ．Ｓｔｕｄｙｏｎｒａｐｉｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｏｃｈｒａｔｏｘｉｎｉｎｇｒａｉｎｗｉｔｈｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄｓｔｒｉｐｓｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｃｅｒｅａｌ＆ＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙ，２０１３，２０（３）：６２⁃６４．［８］杨红秀．抗黄曲霉毒素Ｂ１抗独特型抗体的制备及其性质分析［Ｄ］．武汉：华中农业大学，２０１３．ＹＡＮＧＨＸ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｔｉ⁃ＡＦＢ１ａｎｔｉ⁃ｉｄｉｏｔｙｐｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｄ］．Ｗｕｈａｎ：ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１３．［９］ＸＵＬ，ＺＨＡＮＧＨＱ，ＹＡＮＸＷ，ｅｔａｌ．Ｂｉｎｄｉｎｇ⁃ｉｎｄｕｃｅｄＤＮＡｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｓｅｎｓｉｎｇａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１［Ｊ］．ＡＣＳＳｅｎｓｏｒｓ，２０１８，３（１２）：２５９０⁃２５９６．［１０］ＥＲＧÜＤＥＲÖ，ＫＥＳＫＩＮＳＳ，ＮＡＲＩ，ｅｔａｌ．ＡｆｌａｔｏｘｉｎＢ１ａｃｔｓａｓａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｅｎｅｒｇｙｄｏｎｏｒｔｏｅｎｈａｎｃｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆｙｅｌｌｏｗｅｍｉｓｓｉｖｅｃａｒｂｏｎｄｏｔｓ［Ｊ］．ＡＣＳＯｍｅｇａ，２０２２，７（３３）：２９２９７⁃２９３０５．［１１］ＲＥＮＷＪ，ＬＩＺＦ，ＸＵＹ，ｅｔａｌ．Ｏｎｅ⁃ｓｔｅｐｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｂａｓｅｄｏｎｎａｎｏｂｏｄｙ／ｎａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｆｕｓｉｏｎｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１ｉｎｃｅｒｅａｌ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１９，６７（１８）：５２２１⁃５２２９．［１２］ＭＷＡＫＩＮＹＡＬＩＳＥ，ＭＩＮＧＺ，ＸＩＥＨＬ，ｅｔａｌ．ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＭｙｒｏｉｄｅｓｏｄｏｒａｔｉｍｉｍｕｓｓｔｒａｉｎ３Ｊ２ＭＯａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１９，６７（１６）：４５９５⁃４６０２．［１３］林一民，王云龙，胡永芳，等．胶体金免疫层析技术在临床疾病诊断中的研究进展［Ｊ］．重庆医学，２０１３，４２（１）：９１⁃９３．ＬＩＮＹＭ，ＷＡＮＧＹＬ，ＨＵＹＦ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｉｎｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３，４２（１）：９１⁃９３．［１４］ＶＯＩＳＩＮＦ，ＬＥＬＯＮＧＧ，ＧＵＩＧＮＥＲＪＭ，ｅｔａｌ．Ｆｌａｓｈｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅａｓｓｅｍｂｌｙｉｎａｍｉｌｌｉｆｌｏｗｓｙｓｔｅｍ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍｏｎｉｃａｎｄｆｏｒｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｐｔｉｃａｌｓｉｇｎａｌｓ［Ｊ］．ＡＣＳＡｐｐｌｉｅｄＮａｎｏＭａｔｅｒｉａｌｓ，２０２２，５（５）：６９６４⁃６９７１．［１５］ＹＵＨＳ，ＬＩＵＨ，ＹＡＮＧＹＪ，ｅｔａｌ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆａｒａｐｉｄｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓａｙｆｏｒＣＯＶＩＤ⁃１９ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＡＣＳＯｍｅｇａ，２０２２，７（４１）：３６２５４⁃３６２６２．［１６］ＬＩＡＮＧＰＨ，ＧＵＯＱ，ＺＨＡＯＴＹ，ｅｔａｌ．ＡｇｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｗｉｔｈｕｌｔｒａｔｈｉｎＡｕｓｈｅｌｌ⁃ｂａｓｅｄｌａｔｅｒａｌｆｌｏｗｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｆｏｒｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｎｄＳＥＲＳｄｕａｌ⁃ｍｏｄｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳ⁃ＣｏＶ⁃２ＩｇＧ［Ｊ］．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０２２，９４（２３）：８４６６⁃８４７３．［责任编辑：吴文鹏］。
克伦特罗胶体金免疫层析试纸条的技术报告1 胶体金的制备1.1 玻璃器皿的准备玻璃器皿表面的少量污染会干扰金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗，硅化。
硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于含5％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1min，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。
专用的玻璃器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。
将玻璃器皿用酸液浸泡72小时后，取出，大量自来水冲洗，洗洁精洗涤，蒸馏水浸泡24h后用去离子水冲洗三次，37℃温箱烘干后备用。
1.2 柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液在胶体金免疫层析试验中，检测信号是由于金颗粒在检测线或质控线上聚集而成，所以如果金颗粒太小就不能产生足够的颜色信号，如果太大又会遇到空间位阻问题。
空间位阻可以阻止小分子蛋白质接近金颗粒的zeta电位，例如IgG 分子(160 000 DaLtons)大约8nm，约有4nm可以与金颗粒的表面结合，其最适的标记金颗粒为40nm，而对小分子抗原来说，可以使用20nm的胶体金颗粒进行标记。
取0.01％氯金酸水溶液100mL用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液1.0mL，继续搅拌加热10min，溶液呈透亮的红色。
室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存。
1.3 胶体金的质量鉴定1.3.1 肉眼观察用肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好无杂质、透明度较高。
1.3.2 紫外扫描鉴定取冷却后的胶体金溶液进行400～600nm紫外扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰形、峰宽。
紫外扫描的最大吸收峰波长为525nm，根据回归方程Y= 0. 4271X + 514. 56计算得到胶体金颗粒粒径为24.4nm。
由图谱可以看出最大吸收峰的峰宽较小,说明胶体金颗粒分布比较均匀1.3.3 透射电镜鉴定透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致，有无椭圆形及多角形。
拍片放大后测量胶体金颗粒直径大小，取多个点计算胶体金颗粒的平均直径。
免疫层析试纸条检测技术的研究进展周梦婕; 李小盼; 代荣阳【期刊名称】《《检验医学与临床》》【年(卷),期】2019(016)022【总页数】5页(P3382-3386)【关键词】免疫层析; 胶体金试纸条; 荧光试纸条; 纳米酶试纸条【作者】周梦婕; 李小盼; 代荣阳【作者单位】西南医科大学生物化学与细胞生物学系四川泸州 646000; 中国科学院生物物理研究所蛋白质与多肽药物实验室北京 100101; 吉尔生物科技(天津)有限公司天津 300270【正文语种】中文【中图分类】R446.1; R446.6免疫层析试纸条检测技术是20世纪70年代兴起的适用于患者床旁检测或家庭检测的检验技术，相较于酶联免疫吸附试验(ELISA)，其具有普适性、快捷性等优点。
免疫层析试纸条检测技术具有操作简便、结果快速且稳定、不需要大型设备及成本低廉等优点，因此在临床诊断等领域迅速普及。
免疫层析试纸条检测技术随着纳米标记材料的不断进步(从胶体金到荧光微球、量子点，再到纳米酶)而不断发展，展现出巨大的潜能。
免疫层析试纸条的应用范围也从生物大分子检测扩展到环境监测、食品卫生检测、疾病筛查与诊断等多个领域。
本文从多个方面对免疫层析试纸条检测技术的发展进行总结，并对其未来进行展望。
1 免疫层析试纸条检测技术免疫层析试纸条检测技术是基于免疫标记技术和色谱层析技术发展起来的一种可用于检测抗原、抗体或半抗原的检测技术。
其特点是应用抗原-抗体特异性的免疫学反应和层析技术，并以干片式试纸的形式，达到快速、特异、准确地显色以检测待测物的目的，同时该技术不需依赖专业技术人员和大型仪器设备[1]。
其检测原理：基于毛细管床自发运送液体从样品垫至结合垫，通过液体层析将样品与示踪颗粒共同带往信号产生膜，发生抗原抗体结合反应。
示踪颗粒在信号发生区显色或产生其他信号反应，10 min左右即可直观地观察到检测结果。
该技术成本低，省去了洗涤、分离等诸多烦琐的步骤，操作快捷、简便，是床旁诊断(POCT)的一种主要形式。
Hans Journal of Nanotechnology纳米技术, 2019, 9(2), 55-59Published Online May 2019 in Hans. /journal/nathttps:///10.12677/nat.2019.92006Colloidal Gold ImmunochromatographyStrip Technique and Its Applicationin Clinical DiagnosisPing MengLaboratory of Nephrology, Huadu District People’s Hospital of Guangzhou, Huadu Hospital of Southern Medical University, Guangzhou GuangdongReceived: Apr. 9th, 2019; accepted: Apr. 23rd, 2019; published: May 6th, 2019AbstractColloidal gold immunochromatography strip (CGIS) is a new immunoassay technique in clinic. It combines the visualization of colloidal gold technique and the specificity of immunochromatography.It has been extensively applied in clinic, laboratory and family with its excellent features at present.It has good prospects for development especially in infectious diseases and autoimmune diseases.This paper will introduce and summarize the development of CGIS technique in the disease diagno-sis. Research and development of CGIS will be in the direction of more sensitive specificity and mul-tiplexed detection in the future.KeywordsColloidal, Colloidal Gold Immunochromatography Strip, Disease Diagnosis胶体金免疫层析试纸条在临床诊断中的研究进展孟萍南方医科大学附属花都医院，广州市花都区人民医院肾病实验室，广东广州收稿日期：2019年4月9日；录用日期：2019年4月23日；发布日期：2019年5月6日摘要胶体金免疫层析试纸条技术(colloidal gold immunochromatography strip, CGIS)作为近年来临床上兴孟萍起的新的免疫检验技术，结合了胶体金检测的可视化和免疫层析检测特异性强等特点，因其操作简单迅速、成本较低等特点，适合于临床、实验室、现场及家庭的快速诊断，是目前应用广泛的检验方法，在感染性疾病、自身免疫性疾病等疾病诊断中具有良好的发展前景。
本文对胶体金免疫层析试纸条检测技术在疾病诊断中的研究进展进行总结归纳，未来免疫胶体金层析试纸条将向更灵敏特异、多联检测方向进行研究和发展。
关键词胶体金，免疫层析试纸条技术，疾病诊断Copyright © 2019 by author(s) and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/1. 引言胶体金免疫层析试纸条检测技术基于胶体金作为示踪标志物，利用抗原抗体特异性反应，最早是由Faulk和Taylor在1971年创立并用于免疫电镜技术[1]。
胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。
因其操作快捷简便、价格低廉、灵敏度高等优势而广泛运用于病原体检测等方面，本文将简要介绍胶体金免疫层析试纸条的制备及其在临床诊断中的应用进展，并对其存在的问题及发展前景进行分析，为该技术的深入研究及应用奠定一定的基础。
2. 胶体金免疫层析试纸条的制备及研究进展2.1. 胶体金免疫层析试纸条的制备胶体金(colloidal gold)也称金溶胶(goldsol)，是由氯金酸被还原成金原子后形成的金悬浮颗粒，在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界限十分清楚。
金颗粒表面有大量的负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称为胶体金。
胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，不影响蛋白质的生物特性[2] [3] [4]。
制备方法多采用柠檬酸盐还原法，主要原料是氯金酸，胶体金一般通过柠檬酸三钠还原法制备，通过改变体系中氯金酸与还原剂的比例可得到所需不同直径的金颗粒。
胶体金颗粒大小一般多在1~100 nm [5]，微小的胶体金颗粒稳定均匀的呈单一分散状态悬浮在液体中，从而形成胶体金溶液。
用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质抗原或抗体结合，这类胶体金结合物成为免疫金复合物或免疫金，胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，如果低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。
如果pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合。
溶液pH值、胶体金颗粒的大小、抗体的浓度等是影响胶体金吸附的主要因素。
试纸条从下到上依次由样品垫、胶体金垫、NC膜和吸水滤纸等组成，NC膜上标记有孟萍检测线和指控线，对样本进行检测时，指控线显色指示试纸条有效，检测线根据实际情况呈现红色或无色，以显示阳性或阴性的结果[4] [6]。
试纸条可以检测的样品为血液、尿液等，使用简便快速，便于基层和家庭使用；成本较低，不需要特殊的仪器设备及人员操作；可同时进行多项检测，节省样品；本身带有颜色结果可直接肉眼观察。
2.2. 胶体金免疫层析试纸条在临床疾病诊断中的研究进展2.2.1. 在病原体检测中的研究进展近年来，越来越多的免疫胶体金检测试纸条应用在传染病病原体中的检测，最早出现的是A群链球菌及衣原体的检测[7]，Zhang等制备了检测血清中旋毛虫抗体的免疫胶体金试纸条[8]，Nardo等制备的针对食物中的黄曲霉素的免疫胶体金检测试纸条，灵敏度和特异性都非常好[9]，Song等制备出针对肺炎支原体的检测试纸条[10]，Mdluli等制备出可以半定量检测人血液中结核分枝杆菌的试纸条，实现了结合分枝杆菌的半定量检测[11]，阪崎肠杆菌可诱发新生儿和婴儿严重的脑膜炎和败血症，死亡率很高，Blakova等建立了检测的胶体金免疫层析试纸条，大大节省了检测时间[12]。
2.2.2. 在病毒检测中的研究进展Reid等制备了检测口蹄疫病毒[13]，Ma等制备了用于检测HIV-1 p24抗原的免疫胶体金试纸条，为HIV感染的早期诊断提供了有效的方法[14]，Yang等利用金标蛋白抗原或多肽建立了检测O型FMDV 病毒抗体的胶体金试纸条检测方法[15] [16]，Cheng等以抗原拦截的模式建立了检测H5和H6亚型禽流感抗体的胶体金试纸条[17]，Kong等制备出可以快速检测流感嗜血杆菌的检测试纸条[18]，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的免疫胶体金检测方法，与传统的酶联免疫吸附法相比操作简便迅速，Xiang等利用双抗体夹心法建立了检测丙肝病毒(hepatitis C virus, HCV)的试纸条[19]，都可作为临床上筛查的重要手段。
Sakurai等利用荧光微球标记单抗的方法建立了检测季节性流感的试纸条[20] [21]。
2.2.3. 在激素检测中的研究进展最早出现的抗原检测试纸条是针对人绒毛膜促性腺素(human chorionic gonadotropin, HCG)的检测[22]，目前在早早孕试纸条在医院和家庭中应用极为普遍。
血液中17α-羟孕酮浓度增高提示先天性肾上腺皮质增生症，Tripathi等利用竞争法制备胶体金免疫层析试纸条检测血清中17α-羟孕酮，灵敏度可以达到2.5 ug/L [23]。
2.2.4. 在肿瘤标志物检测中的研究进展肝癌诊断中，Yang等制备的胶体金试纸条可以检测到1 ng/ml的AFP，且标本用量少，检测时间快，10 min即可读取结果，且假阳性率和假阴性率较低[24]。
Wu等利用双抗体夹心法制备了检测前列腺特意抗原(prostate-specific antigen, PSA)的胶体金试纸条，可作为检测前列腺癌病情变化和疗效观察的有效工具[25]，Wang等建立了定量多联检测多种肿瘤标志物的试纸条[26]，Chen等利用双抗体夹心法检测肿瘤标志物糖类抗原72-4 [27]。
2.2.5. 在其它检测方面中的研究进展人心肌肌钙蛋白T (cTnT)是诊断急性心肌梗塞的高灵敏、高特异的血清学诊断指标，其免疫胶体金检测试纸条在国内外心血管疾病领域得到广泛应用[28]。
此外还有大便隐血测试卡、血清铁质测试条、免疫球蛋白血清测试条等，在临床诊断中发挥着重要作用。
3. 展望随着医院检验技术的迅速发展和不断更新，免疫胶体金检测技术是目前发展较快的临床诊断技术，孟萍由于制备简便，方法敏感、特异，不需使用放射性同位素，或潜在致癌物质的酶显色底物，更能适应现代高效快速的节奏和满足疾病的诊断要求。
根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
