专题三：成体干细胞(前言和间充质干细胞)

胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7。

21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织的选取 (4)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (6)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (6)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (7)3 原代培养和继代培养 (11)3—1培养基 (11)3-2培养密度 (12)3-3培养条件 (13)3—4换液 (13)3—5 传代培养 (13)3—6细胞形态与生长速度 (14)3—7 MSC的冻存与复苏： (14)4细胞表面抗原检测 (14)5生长曲线 (15)6细胞周期 (15)7分化潜能 (15)参考文献 (15)附件1不同实验室从脐带血,脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法.. 16脐带血 (16)脐带 (17)羊膜 (19)绒毛膜 (19)蜕膜层 (20)胎盘 (21)整体灌注法 (22)附件2 背景知识 (22)附件3 PMSC实验所需试剂 (23)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。

在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。

按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞(Adult stem cell，ASC）两类。

胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力.但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。

成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织,早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。

然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell， MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。

间充质干细胞及来源间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞。

间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。

间充质干细胞具有向多种类型细胞分化的能力，可以分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞。

这种多向分化的能力给人类多种疾病的治疗提供了重要的原材料。

间充质干细胞来源：间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，其中脐带来源的间充质干细胞质量高、纯净、数量多。

间充质干细胞生物学特性间充质干细胞具有以下特性：1）具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为造血细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。

2）具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。

3）具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。

正是由于间充质干细胞所具备的这些免疫学特性，使其在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。

通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。

间充质干细胞的临床应用1.间充质干细胞在细胞替代治疗中的前景以组织工程学为手段可望解决的问题几乎涉及人类面临的大多数医学难属，如烧伤、放射损伤等患者的植皮；肌肉、骨及软骨缺损的修补；髋、膝等关节的替换；血管疾病或损伤后的血管替代；糖尿病患者的胰岛植入；心脏病患者的瓣膜替代、房室间隔缺损的修补；癌症患者手术切除后组织或器官的替代；放射损伤及大剂量放疗、化疗后的造血与免疫重建；肝、肾等重要脏器因损伤或功能衰竭的置换；部分遗传缺陷性疾病的治疗等。

isct 间充质干细胞鉴定标准理论说明1. 引言1.1 概述在细胞治疗和再生医学领域，间充质干细胞（ISCT）作为一种重要的细胞资源，引起了广泛的关注。

ISCT具有多向分化潜能、免疫调节作用及促进组织修复的能力，被认为是一种理想的干细胞来源。

然而，由于缺乏统一和规范的鉴定标准，在实践应用中存在着不确定性和挑战。

1.2 文章结构本文将对ISCT进行深入探讨，并重点介绍其鉴定标准的理论说明。

文章包括以下几个部分：引言、ISCT间充质干细胞、鉴定标准理论说明、实践应用与挑战以及结论与展望。

1.3 目的本文旨在系统梳理当前关于ISCT鉴定标准的理论知识，并探讨该领域面临的实践应用和挑战。

通过对ISCT表面标记物使用、功能性特征评估方法以及分子生物学检测手段应用等方面原理的介绍，希望能够提供给读者一个全面的理论基础，并展望ISCT鉴定标准未来的发展方向。

同时，对于临床转化前景展望、存在的问题与挑战以及解决方案和研究进展等方面也将进行讨论。

以上是本文“1. 引言”部分的详细内容。

该部分概述了文章的主题和目的，并介绍了本文的结构。

接下来将继续展开描述ISCT间充质干细胞及其鉴定标准相关内容。

2. ISCT间充质干细胞2.1 定义与特征ISCT（国际干细胞治疗学会）定义了间充质干细胞（MSCs）作为一类多潜能的成体干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。

这些细胞可以从不同来源获得，包括骨髓、脐带血、脂肪组织等。

ISCT认为，MSCs应满足以下三个基本标准：1) 在培养条件下，MSCs应具备黏附能力；2) MSCs应表达特定的表面标记物，如CD73、CD90和CD105，并且在同时应该缺乏（或仅有极低水平）CD34、CD45、HLA-DR等造血和免疫相关标记物；3) MSCs应能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等不同种类的细胞。

此外，ISCT提出了额外的功能性特点来进一步确认MSCs。

这些功能性特点包括：1) 免疫调节作用：MSCs可以抑制免疫反应，并通过调节T淋巴细胞、B 淋巴细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞的功能来达到免疫调节作用；2) 细胞迁移能力：MSCs具有从注射部位向受损组织迁移的能力；3) 分泌多种生物活性分子：MSCs可以产生多种生长因子、细胞因子和表观遗传调控因子，对损伤修复和组织再生具有重要作用。

间充质干细胞是什么？间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)应具有如下基本特征:⑴贴壁生长;⑵具有特定的表面标志，如不表达CD14、CD34、CD45、HLA-Ⅱ，但表达CD29、CD73和CD105;⑶能进行自我更新，也能在体外分化为骨、软骨和脂肪等多种细胞系。

虽然不同研究组对人脐带中分离出的细胞给出基质细胞、基质干细胞和MSCs等多种命名，但通常均具有上述基本特征，本文拟对这一来源的MSCs的生物学特征进行综述。

1、基因分析对人脐带MSCs进行基因分析表明，该细胞与造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)和胚胎干细胞(embroynic stem cells，ESCs)类似，其高表达的常见基因包括未分化的ESCs表达的基因、形态发生相关蛋白、细胞外黏附分子、神经营养因子以及3个胚层衍生的子代细胞标志物[1]。

此外，RT-PCR分析显示人脐带基质干细胞还表达多种未分化细胞标志、3个胚层和滋养外胚层相关的基因和一系列多能干细胞标志，如Nanog、Oct-4、Sox-2、Rex-1、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81[2]。

2、细胞标志物的表达以流式细胞学技术、PCR技术、微点阵方法和免疫组织化学方法对脐带基质细胞的表面标志表达情况进行分析的诸多研究表明，这些细胞与其他来源的MSCs类似，表达CD10、CD13、CD29、CD44、CD49 b、CD49 c、CD49 d、CD49e、CD51、CD73、CD90、CD105、CD146、CD166、HLA-1和HLA-A，B，C等;但不表达CD14、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD56、CD123、CD133、CD235a、HLA-G、HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR和Strol-1[21。

3、端粒酶活性端粒酶活性在干细胞的增殖能力方面发挥重要作用。

2024 年 3月第 61 卷第 2 期Mar. 2024Vol. 61 No. 2四川大学学报（自然科学版）Journal of Sichuan University （Natural Science Edition）成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化杨雅丽1，2，司琪琦1，王思瑜1，周嘉裕1，郭泰林2（1.西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031； 2.西南交通大学医学院，成都 610031）摘要: 为探究成骨细胞（OBs）线粒体移植对骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨分化的影响，本研究体外人工提取BMSCs线粒体和OBs线粒体，分别移植入受体BMSCs.实验结果发现，接受成骨细胞线粒体的BMSCs表现出显著增强的增殖、迁移、抗凋亡和成骨能力.此外，接受成骨细胞线粒体的BMSCs胞内活性氧水平降低、氧气消耗速率上调、ATP产量增加.以上结果表明，（1）成骨细胞线粒体移植能够增强体外BMSCs功能，促进其向成骨分化；（2）相较于接受骨髓间充质干细胞线粒体，接受成骨细胞线粒体移植的受体BMSCs具有更强的有氧代谢能力以及更强的成骨分化能力，有望为骨生长与骨损伤修复提供一种候选方法.关键词: 线粒体移植；骨髓间充质干细胞；成骨细胞；成骨分化；代谢中图分类号: Q599 文献标志码:A DOI:10.19907/j.0490-6756.2024.026001Mitochondrial transplantation of osteoblasts promotes proliferation，migration and osteogenic differentiation of bone marrowmesenchymal stem cell in vitroYANG Ya-Li1，2， SI Qi-Qi1， WANG Si-Yu1， ZHOU Jia-Yu1， GUO Tai-Lin2（1.School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 6100031， China；2.School of Medicine， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China）Abstract: To explore the effect of mitochondrial transplantation of osteoblasts （OBs） on osteogenic differen‑tiation of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs）， this study artificially extracted BMSCs mitochon‑dria and OBs mitochondria in vitro and transplanted them into recipient BMSCs respectively.The experimen‑tal results showed that BMSCs receiving osteoblast mitochondria showed significantly enhanced proliferation，migration， anti-apoptosis and osteogenesis.In addition， the level of intracellular ROS in BMSCs receiving os‑teoblast mitochondria decreased， the rate of oxygen consumption increased， and ATP production increased. These results indicated that：（1） Mitochondrial transfer can enhance the function of BMSC in vitro and pro‑mote its osteogenic differentiation；（2） Compared with bone marrow mesenchymal stem cell mitochondria，recipient BMSCs receiving osteoblast mitochondrial transplantation may have stronger aerobic metabolic ca‑pacity and osteogenic differentiation ability， which is expected to provide a candidate method for bone growth and bone injury repair.Keywords: Mitochondria transplantation；Bone marrow mesenchymal stem cells；Osteoblasts；Osteogenic differentiation； Metabolism收稿日期: 2023-02-13基金项目: 四川省科技厅应用基础研究项目（Q114321S01003）作者简介: 杨雅丽（1998-），女，陕西商县人，硕士研究生，研究方向为代谢与骨组织工程.E-mail： yangyali0331@通讯作者: 周嘉裕.E-mail： spinezhou@第 2 期杨雅丽，等：成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化第 61 卷1　引言骨缺损指骨的结构完整性被破坏，是临床上常见的病症［1，2］.间充质干细胞（MSCs）是一种多能、自体更新的成体干细胞，可分化为多种组织［3］.骨髓间充质干细胞（BMSCs）易于从骨髓中分离，并可以在体外扩增到足够数量用于临床应用［4］，因此被认为是骨组织工程中很好的治疗工具.然而，在体外长期分离培养后，BMSCs的功能特性可能会受损［5］，因此修饰BMSCs以增强其功能已成为干细胞介导的骨组织再生研究的主要焦点.成骨细胞谱系细胞包括骨髓间充质干细胞、前成骨细胞、成骨细胞（OBs）（通常称为成熟成骨细胞）、骨内衬细胞和骨细胞.骨健康取决于成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡［6］.成骨细胞源于骨髓间充质干细胞，成熟的成骨细胞分化后形成骨基质并开始矿化形成骨组织.成骨细胞是骨重塑的基础，对骨骼的生长和维持至关重要.能量代谢是从营养物质中产生能量（即ATP）的过程［7］.这一过程对于维持细胞稳态和对不同条件作出反应是必不可少的.细胞需要能量来生长和维持，并且已经进化成具有多种产生能量的途径［8，9］.遗传和功能研究都表明，能量代谢，如葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代谢，在骨细胞（包括成骨细胞、骨细胞和破骨细胞）的形成和功能中起着重要作用［10］.此前有文献证明移植骨髓间充质干细胞线粒体增强了干细胞的增殖、迁移以及成骨分化能力［11］ .在骨骼发育和重塑的过程中成骨细胞发挥重要功能［12］，有研究证实成骨细胞比骨髓间充质干细胞更依赖糖酵解产生能量，其中的线粒体DNA的拷贝数、呼吸酶的蛋白亚基、耗氧率和ATP含量均有所增加［13］.然而，有关成骨细胞线粒体移植对于干细胞分化影响有关的研究尚未见报导.为了探究不同来源线粒体移植对干细胞增殖和分化的影响，实验同时设置了3个组别，采用体外人工提取骨髓间充质干细胞线粒体和成骨细胞线粒体的方法，分别移植入受体骨髓间充质干细胞，通过CCK-8，RT-qPCR，Western Blot等手段评估不同来源线粒体移植对BMSCs增殖、迁移以及促成骨能力的影响，以期为进一步探究改善提供参考.2　材料与方法2.1 材料1-2 w Sprague Dawley大鼠（成都达硕实验动物有限公司，中国）.2.2 方法2.2.1　细胞提取、培养及传代采取断颈法处死大鼠，提取骨髓间充质干细胞：剪下大鼠的后腿股骨，用针管将细胞从骨髓腔中吹出，在配置好的α-MEM培养基（90% α-MEM培养基+10% FBS+1%双抗）中培养；提取OBs：剪下大鼠的头盖骨，用刮刀轻轻的将头盖骨刮至透明状态，放入α-MEM培养基（同上）培养.细胞在培养箱（37 ℃，5%，CO2）中培养，2~3 d换一次培养基.细胞生长至80%~90%，进行传代培养：去除培养基，加入胰蛋白酶（0.25%，含1 mmol/L EDTA）消化下来后离心（1200 r/min，5 min），除去上清液至培养瓶中继续培养［14］.所有实验均使用3~5代的细胞. 2.2.2　线粒体提取和移植使用线粒体提取试剂盒Mammalian Mitochondria Isolation Kit for Tis‑sue and Cultured Cells（Biovison，美国）提取线粒体.将受体细胞和供体细胞都接种在6孔板中（10万/孔），供体细胞长至融合度80%~90%时消化供体细胞.加入1 mL线粒体分离缓冲液并用注射器吹打5 s，加入10 µL试剂A，冰上孵育5 min.4 ℃下以600 g离心10 min，收集到的上清液在4 ℃下以7000 g离心10 min，将得到的线粒体使用培养基重悬后加入受体细胞，缓慢均匀摇晃促进线粒体进入［11］.2.2.3　线粒体、细胞骨架荧光染色用不含血清、酚红的DMEM培养基（Sigma，美国）稀释线粒体绿色荧光探针MitoGreen（江苏凯基生物，中国）原液至500 nmol/L.供体细胞接种在6孔板中（10万/孔），每组设置三个平行样，待供体细胞长至融合度80%~90%时消化供体细胞.用预热的染色液悬浮细胞，37 ℃孵育30 min.完成染色后，避光提取线粒体，转移至受体细胞中共同培养24 h.消化受体细胞后用无血清、无双抗的DEME培养基重悬（1×106细胞/mL），每孔加入100 µL ，20 µg/mL鬼笔环肽-罗丹明（Sigma，美国）进行细胞骨架染色.避光室温孵育30 min，离心弃上清，用PBS悬浮细胞，重复两次以上洗涤步骤后每个样随机选取5个视野使用荧光显微镜（FV1000，第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期Olympus，日本）进行观察并拍照.2.2.4　流式细胞术为了进行定量验证，在分离前使用浓度为500 nmol/L的MitoGreen FM（吸收/发射=530 nm/590 nm）标记供体OBs中的线粒体（方法同上2.2.3）.使用BD Accuri C6 Plus流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）对受体BMSCs 进行定量，每组设置三个平行样，每个样本至少有10 000个细胞，使用FlowJo软件分析FITC发射区的平均荧光强度（MFI）.2.2.5　CCK-8 按实验组别在96孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞（1万/孔），每组设置三个复孔.培养24 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液（DOjinDO，中国上海），孵育2 h后用酶标仪（SPECTROstar Nano，BMG LABTECH，德国）测定450 nm处的吸光度.对照组和实验组分别以空白组为参照，用公式计算细胞存活率=［（As-Ab）］×100%（As：对照孔/实验孔吸光度；Ab：空白孔吸光度），得到的数据使用GraphPad Prism 8软件分析制作直方图.2.2.6　细胞划痕按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞进行培养，每组设置三个复孔，待细胞生长至80%~90%左右时，在每孔的中间用1 mL移液枪枪头轻轻划一道粗细相同的空隙.将孔板放至光学显微镜下拍照（10×）后继续放入培养箱培养，48 h后再次拍照（10×），对比每组别细胞迁移情况.2.2.7　细胞凋亡按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞进行培养，每组设置三个复孔，待细胞生长至80%~90%时收集细胞上清.向孔板中加入胰蛋白酶（0.25%）消化细胞，2~5 min后用收集的上清终止消化收集细胞；用PBS清洗细胞两次后用DAPI染色液（Biosharp，中国安徽）和细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-EGFP/PI Cell Apoptosis Detection kit （Service‑bio，中国武汉）处理，随后在每个样随机选取5个视野在荧光显微镜下用三色滤光片进行观察，DAPI呈蓝色荧光信号，Annexin V-EGFP呈绿色荧光信号，PI呈红色荧光信号.2.2.8　RT-qPCR 按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞，每组三个平行样，分别培养4，7，14 d.培养结束后加入Trizol试剂（Life Technologies，美国）提取RNA.使用逆转录试剂盒（Thermo Fisher，美国）按照一定的体系逆转录（25 ℃，5 min→42 ℃，60 min→70 ℃，5 min→4 ℃，∞）为cDNA.通过NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/）查找所需目的基因序列，使用 Primer-BLAST 设计目的基因的引物序列，引物由擎科生物科技有限公司（成都）进行合成.引物序列见表1.以逆转录得到的 cDNA为模板链，在ABI QuantStudio3实时聚合酶链式反应系统（CFX96，Bio-rad，美国）上进行定量实时聚合酶链式反应｛95 ℃，5 min→（95 ℃，15 s →60 ℃，1 min）循环39次→70 ℃到95 ℃梯度升温（0.02 ℃/s）｝［15］.2.2.9　Western Blot 按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞，每组三个平行样，分别培养4，7，14 d.培养结束后每孔加入 120~ 150 μL RIPA裂解液（Boster，美国），1%广谱蛋白酶抑制剂（Boster，美国）和1% PMSF（Boster，美国）裂解蛋白.加5× loading buffer（Boster，美国）95 ℃水浴10 min.总蛋白提取液（30 μg）经10%（w/v）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离后，转移到PVDF膜上.用5%（w/v）的脱脂牛奶封闭膜，在4 ℃下与Runx2鼠源一抗（1∶100，sc-390351，SANTA CRUZ，美国），β-actin鼠源一抗（1∶5000，bam-33036M，Bioss，中国北京）孵育过夜，然后羊抗鼠二抗（1∶5000，BA1054，Boster，美国）孵育2 h.使用Clarityt TM Western ECL Sub‑strate（BIO-RAD，美国）进行显色，适当时间后用凝胶成像系统（ChemiDoc MP，Bio-rad，美国）进行表1　实时定量聚合酶链式反应引物序列Tab.1　RT-qPCR primer sequences基因名（Gene name）GAPDHOsteopontin （OPN）Osteocalcin（OCN）RUNX family transcription factor 2 （Runx 2）Alkaline phosphastase （ALP）上游引物序列（5′→3′）CCCTTAAGAGGGATGCTGCC CTTGCTTGGGTTTGCAGTCTT CCGTTTAGGGCATGTGTTGC AATTAACGCCAGTCGGAGCA GGGCCTGCTCTGTTTCTTCA下游引物序列（5′→3′）TACGGCCAAATCCGTTCACAGCCACTGCAGGCTTACCTTGTTTCGAGGCAGAGAGAGGGACACTTCTCGGTCTGACGACGCTGAGATTCGTCCCTCGCTG第 2 期杨雅丽，等：成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化第 61 卷放射自显影.蛋白质表达水平归一化为β-actin. 2.2.10　茜素红染色按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞（10万/孔），每组设置三个复孔.将培养板放在培养箱预培养（37 ℃，5%，CO2的条件下）培养.贴壁后更换成骨诱导培养基（100 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸）［16，17］，培养14 d后每组随机选取5个视野在光学显微镜下拍照观察细胞密度，随后用PBS清洗，加入95%乙醇固定15 min，每孔加入1 mL，1%的茜素红（源叶生物，中国上海），室温放置30 min，对细胞进行染色后用体式显微镜（SG-700，萨伽，中国苏州）观察.2.2.11　碱性磷酸酶染色按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞（10万/孔），每组设置三个复孔.贴壁后更换成骨诱导培养基（100 nmol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L抗坏血酸）培养14 d后每组随机选取5个视野在光学显微镜下拍照观察细胞密度，随后移除培养基，加入95%乙醇，固定15 min.用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒（碧云天，中国上海）进行染色，每孔加入1 mL BCIP/NBT染色工作液，室温避光孵育30 min，去除BCIP/NBT染色工作液，用体式显微镜（SG-700，萨伽，中国苏州）观察.2.2.12　ROS 按组别在6孔板中接种接受了线粒体移植后的受体细胞（10万/孔），每组设置3个复孔.待细胞生长至80%~90%时，用无血清α-MEM培养基（1%双抗）稀释活性氧检测试剂盒（YEASEN，中国上海）中的DCHA-DA，使其终浓度为10 mmol/L.每孔加入1 mL稀释好的DCFH-DA工作液，37 ℃培养箱避光孵育30 min；用无双抗α-MEM培养基（10%胎牛血清）洗涤细胞1~2次后每个样随机选取5个视野使用荧光显微镜（488 nm激发波长，525 nm发射波长）观察并拍照.2.2.13　细胞线粒体压力测定实验前一天预热海马生物能量测定仪（Agilent Seahorse XFp，Sea‑horse，美国）；在前一天专用Seahorse XFp 细胞培养板（Agilent Seahorse XFp，103025-100，美国）中按组别加入BMSCs（1万/孔），每组三个平行样.实验当天，从Seahorse XF DMEM Medium （103575-100）中分装出9.7 mL，向其中分别加入100 μL glucose、100 μL pyruvate、100 μL glutamine混匀配置成检测液.培养好的贴壁细胞中的培养基置换为配置好的检测液，置放入37 ℃，无CO2细胞培养箱培养60 min后加入药物（A孔加入20 μL，15 μmol/L oligomycin，B孔加入22 μL，15 μmol/L FCCP，C孔加入25 μL，2.5 μmol/L FCCP ，D孔加入207 μL，5 μmol/L FCCP）.上机运行XFp Cell Mito Stress Test实验.2.2.14　统计分析本研究通过t检验（Graph‑pad，Version 8.0，SanDiego，CA，USA）比较两组的数据，通过Tukey多重比较检验及方差分析（ANOVA）对多组间数据进行分析.P＜0.05表示差异具有统计学意义.3　结果3.1　成骨细胞线粒体在体外成功移植入骨髓间充质干细胞为了验证从成骨细胞中提取的线粒体能否有效地移植到骨髓间充质干细胞中，在提取线粒体前用MitoGreen标记供体成骨细胞中的线粒体（图1a）供体细胞/受体细胞比例为1∶1）.线粒体移植24 h后，染受体细胞的细胞骨架（图1b），然后在荧光显微镜下进行观察，在受体细胞出观察到了供体线粒体的荧光（图1c）.这表明来自成骨细胞中的线粒体能够成功移植进入受体细胞.用流式细胞术检测线粒体成功移植的效率，线粒体在分离前也用MitoGreen标记，受体细胞或对照细胞的平均荧光强度通过FACS定量.对照组中阳性细胞的百分比设定为0.15%，接受成骨细胞线粒体移植的受体细胞阳性率为34.1% （图1d），表示受体细胞中34.1%成功移植了线粒体.3.2　成骨细胞线粒体移植增强骨髓间充质干细胞的体外增殖、迁移、抗凋亡能力骨髓间充质干细胞需要很强的增殖能力才可以有足够的数量治疗骨缺损，本实验研究了成骨细胞线粒体移植对体外培养的骨髓间充质干细胞增殖能力的影响.在移植线粒体24 h后进行CCK8检测，移植了线粒体的细胞的增殖能力比未移植线粒体的细胞强，其中，接受成骨细胞线粒体的细胞（实验组）的增殖能力比接受骨髓间充质干细胞线粒体的细胞（对照组）的增殖能力增强了21.5%（图2a）.第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期图1　线粒体成功移植入受体细胞（a，b，c）免疫荧光染色（n=3）；（d）流式细胞术分析每组受体细胞内标记线粒体的数量（显示为每个细胞的荧光强度）（n=3）Fig.1　Successful mitochondrial transplantation was tested by fluorescence staining （a，b，c） Immunofluorescence staining （n=3）；（d） Flow cytometry was used to analyze the number of labeled mitochondria in each group of recipient cells （shown as fluorescence intensity per cell）（n=3）图2　线粒体移植促进BMSCs生长，迁移，抑制凋亡（a） CCK-8分析结果（n=3）（**P<0.01）；（b）细胞凋亡染色以及DAPI细胞核染色（n=3）；（c）细胞划痕实验检测细胞迁移能力（n=3）Fig.2　Mitochondrial transplantation promoted the growth， migration and apoptosis of BMSCs （a） Results of CCK-8 analysis （n=3）（**P<0.01）；（b） Apoptosis staining and DAPI nuclear staining （n=3）；（c） Cell migration ability was detected by cell scratch assay （n=3）第 2 期杨雅丽，等： 成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化第 61 卷由于MSCs 在体外长期或连续传代培养后可能凋亡，本实验研究了成骨细胞线粒体移植是否可以抑制骨髓间充质干细胞的凋亡.线粒体移植后，第6~8代的细胞进行DAPI 和Annexin V -EGFP/PI 染色，观察到未转入线粒体的细胞处于凋亡晚期，转入骨髓间充质干细胞线粒体的细胞处于凋亡早期，而转入了成骨细胞线粒体的细胞未发生凋亡（图2b ）.因此，成骨细胞移植能够有效抗凋亡.骨髓间充质干细胞有足够的迁移能力才能迁移到骨缺损部位进行骨修复，为了测试受体细胞的迁移能力，本研究做了细胞划痕实验.在细胞长至融合度80%~90%时，在三个组别划同样宽度的划痕，48 h 后在倒置显微镜下观察细胞迁移情况，发现接受成骨细胞线粒体的实验组迁移能力最强，接受骨髓间充质干细胞的对照组次之，空白组迁移能力最弱（图2c ）.因此，成骨细胞线粒体移植显著促进了BMSCs 的迁移，综上结果表明其可能通过促进干细胞增殖、迁移、抗凋亡而在组织修复中发挥积极作用.3.3　成骨细胞线粒体移植提高骨髓间充质干细胞体外成骨能力Alp 、Ocn 、Opn 与Runx2是骨髓间充质干细胞成骨分化的标记基因.因此，分别在线粒体移植第4，7，14 d 进行mRNA 表达水平的RT -qPCR 检测，结果表明，随着时间的增加，转录水平增加，且第7天接受成骨细胞线粒体移植的骨髓间充质干细胞的Alp 表达水平比接受干细胞线粒体的骨髓间充质干细胞的Alp 表达水平高38.1%，Runx2表达水平提高了39.9%（图3a ）.对Runx2进行蛋白水平的Western Blot 验证，同样观察到第7天实验组中Runx2的表达水平比对照组高42.2%（图3b ）.地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸盐的化学混合物可在体外诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞.在线粒体移植后，用成骨分化培养基培养细胞14 d ，在光学显微镜下观察到细胞密度相当（图4a ，c ），随后对其进行茜素红染色和碱性磷酸酶染色（图4b ，d ），结果表明成骨细胞线粒体移植提高了骨髓间充质干细胞的体外成骨能力.3.4　成骨细胞线粒体移植减少受体细胞的ROS水平、增加ATP 生成线粒体是细胞产生能量的主要场所，为了揭示线粒体移植后细胞增殖、迁移能力和成骨分化增强的潜在机制，对成骨细胞线粒体移植后细胞ROS 水平和线粒体功能进行了检测.ROS 荧光染色结果显示，相较于空白组和对照组，移植了成骨细胞线粒体图3　成骨细胞线粒体移植促进BMSCs 成骨发育（a ） RT -qPCR 分析成骨标志基因的表达；（b ） Western Blot 检测成骨分化蛋白Runx2的表达（n =3）（*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001）Fig.3　Mitochondrial transplantation of osteoblasts promotes osteogenic development of BMSCs（a ） The expression of osteogenic marker genes was analyzed by RT -qPCR ； （b ） Western Blot analysis of Runx2 expression （n =3） （*P <0.05， **P <0.01， ***P <0.001）第 61 卷四川大学学报（自然科学版）第 2 期的实验组细胞产生的ROS 最少（图5a ），表明移植成骨细胞线粒体有助于减少胞内ROS 水平.使用海马生物能量测定仪对三个组别进行线粒体压力水平测定，结果（图5b ）表明，移植了成骨细胞线粒体的细胞OCR （氧气消耗速率）最大，同时ATP 生成率、基础呼吸率、最大呼吸率也最高，其中实验组ATP 生成率比对照组高50.1%，实验组的基础呼吸率比对照组高71.9%，表明移植了成骨细胞线粒体的BMSCs 线粒体功能最优.结果表明，线粒体移植能够增加细胞的有氧代谢水平和线粒体ATP 的产生.图4　成骨细胞线粒体移植促进BMSCs 成骨发育（a ） 茜素红染色前显微镜下照片； （b ） 茜素红染色；（c ） 碱性磷酸酶染色前显微镜下照片；（d ） 碱性磷酸酶染色（n =3）Fig.4　Mitochondrial transplantation of osteoblasts promotes osteogenic development of BMSCs（a ）Microscopic photographs before alizarin red staining ； （b ） Alizarin red staining ； （c ） Microscopical photograph before alkaline phosphatase staining ； （d ） Alkaline phosphatase staining （n =3）图5　海马生物代谢仪检测线粒体功能（a ） ROS 染色；（b ） 线粒体压力检测（n =3， *P <0.05，**P <0.01，***P <0.001）Fig.5　Mitochondrial function was measured by hippocampal biometrics（a ） ROS dyeing ； （b ） Mitochondrial pressure detection （n =3， *P <0.05， **P <0.01， ***P <0.001）第 2 期杨雅丽，等：成骨细胞线粒体移植促骨髓间充质干细胞体外增殖、迁移和成骨分化第 61 卷4　讨论与结论本实验分别将骨髓间充质干细胞和成骨细胞的线粒体移植入受体骨髓间充质干细胞，并评估其对细胞功能变化的影响.（1）通过CCK8、细胞划痕和细胞凋亡实验可得出结论，成骨细胞线粒体移植可以显著增加体外BMSCs的增殖、迁移和抗凋亡能力.增强BMSCs的功能是优化干细胞介导的骨修复的关键，增加的增殖能力使MSCs能够在体外扩增到足够数量，用于临床移植；增强的迁移能力使MSCs能够迁移至损伤部位；抗凋亡能力使MSCs抵抗老化带来的对生存和功能的影响.（2）RT-qPCR结果表明，成骨细胞线粒体移植能够有效促进ALP等成骨相关指标基因表达水平的提高；由于OCN与OPN为分泌型蛋白，因此，我们选用位于细胞内部的Runx2作为成骨标志蛋白，Western Blot结果同样表明其含量增加；茜素红可以与钙发生显色反应，反应体外细胞钙结节沉淀情况，侧面说明成骨分化程度；ALP是成熟后成骨细胞的标识酶，成骨细胞内的ALP酶在碱性条件下能被水解成萘酚，而萘酚能与重氮盐物质结合形成不溶于水的蓝色沉淀物［18］.以上结果从基因及蛋白质等层面均证实成骨细胞线粒体移植有利于MSCs成骨分化.（3）ROS荧光染色和海马生物能量代谢仪检测线粒体压力结果表明，移植骨髓间充质干细胞线粒体的BMSCs胞内活性氧水平降低、氧气基础消耗速率较空白组上调了96.3%、ATP产量增加了80.7%，与前人的实验结果吻合［11］.同时证实移植成骨细胞线粒体较骨髓间充质干细胞线粒体的受体细胞线粒体功能更优，氧气基础消耗速率上调了71.9%、ATP产量增加了50.1%.本研究观察到干细胞功能的变化，可能有以下几个的原因.首先，细胞在体外增殖过程中需要增加耗氧量和ATP的产生，尤其是进入细胞周期后氧化磷酸化起到主导作用提供能量［19］；其次，细胞分化过程也与线粒体的含量和功能有关［20］；最后，在细胞迁移过程中需要ATP提供能量［21］.同时，已有研究表明ATP不仅能够直接提供能量，还发挥着信号转导的作用，其主要作用受体分为两类：P2X和P2Y，其中P2X受体的激活具有促进成骨的作用，而P2Y受体的激活则抑制成骨作用，它们的激活状态主要受到ATP浓度调控［22］.此外，还有研究证实ATP可以促进成骨细胞释放PGE2，导致成骨细胞钙离子的内流［23］；以及促进丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinase，MAPK）信号通路的激活等［24］.因此本研究推测线粒体移植通过增加细胞的有氧代谢水平和线粒体ATP的产生来增强细胞的增殖、成骨分化能力和迁移能力.然而本研究结果仍需进一步延伸.（1）虽然移植了成骨细胞线粒体的BMSCs具有更强的骨再生能力，但是否为通过激活信号通路从而促进成骨的尚待进一步研究.（2）本研究显示移植了成骨细胞线粒体的BMSCs功能优于移植了干细胞线粒体的BMSCs，对于成骨细胞线粒体和干细胞的线粒体，还未研究得到结论究竟是什么差异带来这种区别.（3）虽然成骨细胞线粒体移植有助于干细胞功能优化，而且骨髓间充质干细胞可以在体外扩增到足够的数量，在骨组织工程具有很大的潜力［22，23］，但其临床应用有待进一步载体优化.水凝胶作为一种聚合物生物材料，以其生物相容性和生物可降解性在各种治疗中输送功能性药物、分子和细胞［24］.作为缓释药物的载体，水凝胶可以保护受损区域免受不良外部刺激，保持受损部位湿润，提高药物的利用率［25，26］.设想将载有接受线粒体移植的骨髓间充质干细胞的水凝胶涂覆于骨支架表，这可能为骨缺损治疗提供了新策略.参考文献:［1］ Lee W C，Guntur A R，Long F X，et al.Energy metabolism of the osteoblast： Implications for osteo‑porosis ［J］.Endocr Rev， 2017， 38： 255.［2］Guo B L， Yang M W， Liang D，et al.Cell apoptosis induced by zinc deficiency in osteoblastic MC3T3-E1cells via a mitochondrial-mediated pathway ［J］.MolCell Biochem， 2012， 361： 209.［3］Alan T，Courtney M.Stem cell therapies in clinical trials：Progress and challenges ［J］.Cell Stem Cell，2015， 17： 11.［4］Parekkadan B， Milwid J M.Mesenchymal stem cells as therapeutics ［J］.Annu Rev 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间充质干细胞外泌体的作用及其在口腔领域的研究进外泌体是由多种细胞分泌的直径约30~100nm的微小囊泡，电镜下为双层磷脂分子包裹的扁形或球形小体，部分为杯状。

外泌体可传递生物信号分子包括蛋白质、mRNA、microRNA、DNA片段等，构成细胞间信息传递系统。

外泌体广泛存在并分布于各种体液，包括血液、尿液、唾液、脑脊液及羊水等，与多种疾病的发生发展密切相关。

外泌体具有低免疫原性、低毒性和高效性，能最大程度保留其所承载物质的活性。

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）被认为是产生外泌体能力最旺盛的细胞之一，许多文献表明MSC来源的外泌体（MSC-exo）具有与MSC相似的特性，包括组织损伤修复、抗炎、免疫调节等，又能弥补MSC移植应用中的不足，因此其潜在的临床应用价值备受关注。

本文将对外泌体特性、MSC-exo的治疗应用及其在口腔领域的研究进展加以综述。

1.外泌体的生物学特性1）外泌体结构外泌体表面富含胆固醇、神经鞘磷脂、脂筏、神经酰胺及磷脂酰丝氨酸等脂类物质，主要内容物为蛋白质，一类是在外泌体中普遍存在并参与结构构成的蛋白质，包括微管蛋白、肌动蛋白和微丝结合蛋白等细胞骨架成分；膜转运和融合相关蛋白Rab、膜联蛋白Annexins、脂筏标记蛋白Flotillin；多囊泡胞内体产生相关蛋白Alix、TSG101；热休克蛋白Hsp70、Hsp90；四跨膜蛋白超家族CD63、CD9、CD81和CD82等。

另一类蛋白质与细胞来源有关，蛋白成分随来源细胞的不同而存在差异，如抗原呈递细胞分泌的外泌体质膜上含有MHC-Ⅰ与MHC-Ⅱ，以及共刺激蛋白CD80与CD86；来源于血小板的外泌体质膜上有血管性血友病因子和整合蛋白CD41。

除蛋白质外，外泌体还携带丰富的mRNA、miRNA、siRNA等生物信号分子。

外泌体形成外泌体主要由其来源细胞通过“内陷-融合-外排”的过程进行分泌，该过程受多种因素调节，如钙离子载体、结合蛋白浓度、磷脂酰肌醇激酶的活性与细胞应激状态等。

2021年间充质干细胞外泌体在女性生殖系统修复中的研究进展（全文）间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一类来源于多种成体组织的多能干细胞，以其迁移能力强大、分化潜能多元、免疫原性低、组织来源广泛且便于体外分离扩增等优势在组织及器官损伤性疾病的治疗中得到广泛关注和应用。

外泌体作为MSC 旁分泌作用的主要方式之一，在MSC发挥治疗效应中扮演着十分重要的角色。

外泌体不仅能够调节细胞间的物质运输和信息交流，更携带有蛋白质、脂质及核酸等多种生物活性成分，并能高效穿透多种生物屏障，进而改变靶细胞内的信号传导及基因表达，使其发展成一种高效的药物载体和基因治疗制剂。

更重要的是，MSC外泌体能够模拟并发挥母细胞MSC的功能，有效促进组织再生能力，调节损伤局部的免疫反应，从而成为MSC治疗的潜在替代方案。

目前，对于MSC外泌体在妇产科领域的基础研究也初露端倪，其在促进子宫内膜修复、治疗早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）和多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、辅助压力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）手术治疗及加速阴道手术创面修复等方面均展现出较大的治疗潜能。

因此，本文聚焦MSC外泌体在女性生殖系统修复中的作用及其机制，归纳分析其应用现状及研究进展，综述如下。

一、MSC外泌体的生物学性状MSC是20世纪60年代由Friedenstein在骨髓中发现的一种成体多能干细胞［1］，近年来在再生医学领域获得广泛关注。

最初多将MSC的治疗作用归因于其归巢和分化能力，然而随后的多数研究结果提示，在体内自然状态下MSC定植于损伤组织局部的持续时间通常很短，且不能在非诱导条件下高效转分化为器官的实质细胞成分，这表明，MSC的主要治疗作用可能主要由其旁分泌机制介导［2?3］。

间充质干细胞研究进展【摘要】间充质干细胞是一种源于中胚层的早期干细胞，具有多向分化潜能，特定的条件下可分化为骨细胞、软骨细胞和神经细胞等，支持造血，具备低免疫原性和免疫调节活性，具有广泛的科研和临床应用价值。

本文针对间充质干细胞的研究进展和在临床医学应用进行综述。

【关键词】间充质干细胞、分化、免疫调节、应用1 引言间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）就是指在胚胎发育过程中形成的成体间叶组织（如骨髓基质、脂肪、胎盘和脐带等）中留存下来未分化的原始细胞。

MSCs主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓中含量最为丰富，少量存在于血液及其他组织中。

MSCs承担着支持造血系统细胞的使命，为造血干细胞的生长、分化及自我更新提供重要的微环境，还能分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞等多种细胞。

此外，MSCs还具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，发挥免疫重建的功能。

MSCs来源方便，易于分离、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。

MSCs的这些特性，使其在自身免疫性疾病治疗和细胞治疗等方面具有广阔的临床应用前景。

2 MSCs的来源最常见的MSCs来源是骨髓。

外周血、脂肪和胎盘等组织也可进行MSCs提取。

此外，越来越多新的MSCs来源也逐渐被人们发现，如图1，为MSCs的研究与应用提供了更丰富多样的供体。

a b图1.间充质干细胞的来源。

a ：骨髓MSCs的提取；b ：MSCs的新来源骨髓来源的MSCs来源方便,易于分离、扩增和纯化,多次传代扩增后仍具干细胞特性,无免疫排斥,体外基因转染率高并稳定高效表达外源基因，且能最终分化成骨、软骨和神经等组织。

越来越多的实验证明脐血能分离得到MSCs。

脐血MSCs的形态、免疫表型和生长方式等生物学特征与其他来源的MSCs大致类似[1]。

Cheng等从十字交叉韧带中发现了MSCs，可诱导分化为软骨细胞、脂肪细胞、骨细胞等。