骨髓间充质干细胞的培养基

产品描述人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基操作手册产品规格：400mL产品货号：PD-016人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基专门为人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化而开 发，针对人骨髓间充质干细胞的特性优化分化试剂的配方，可增加人骨髓间充质干细胞的成脂 分化效果。

本产品含血清成分，仅用于科研用途，不可用于诊断、治疗、临床及其他用途。

培养基组成成分●人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基 ADP1：成分名称添加体积175 mL 20 mL 2 mL 2 mL 400μL 200μL 200μL 人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化诱导基础培养基 ADP1FBS谷氨酰胺 Glutamine青链霉素 Pennicillin-Streptomycin胰岛素 InsulinIBMX罗格列酮 Rosiglitazone地塞米松A Dexamethasone 200μL●人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基 ADP2（维持培养基）成分名称添加体积人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化基础培养基 ADP2175 mL FBS20 mL 谷氨酰胺 Glutamine2 mL 青链霉素 Pennicillin-Streptomycin2 mL 胰岛素 Insulin 400μL油红-O 染色液 10 m L操作流程一、人骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基的准备注：各成分请根据试剂管上标签标示温度保存。

地塞米松A和地塞米松B浓度不同，不能混用。

染色液1.本产品为试剂盒型，使用前需将试剂盒内各成分试剂混匀。

（请勿将 ADP1 与 ADP2混淆）2.使用前，请将血清置于4℃解冻，直至血清完全溶解；待血清完全溶解后，将所有添加物置于室温溶解。

待试剂完全溶解后，轻轻摇晃使试剂混合均匀（低于 500μL 体积的试剂无需此操作）。

注：为了保证微量试剂的使用效果，请将低于 200μL 的试剂管进行短暂离心，使试剂能全部收集至管底。

3.按上述两个成分表，将表一 ADP1 中的 FBS、青链霉素、谷氨酰胺、胰岛素、IBMX、罗格列酮、地塞米松A等试剂按体积大小先后加入到诱导基础培养基中；混合均匀后做好标识，培养基即可使用。

AdvCell®骨髓间充质干细胞血清培养基AdvCell®骨髓间充质干细胞血清培养基（BSM0004）根据哺乳类生物干细胞的生长需要，包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质、胎牛血清以及其他补给成分。

产品严格无菌，无病毒和支原体，性能稳定，使用该培养基能使干细胞在理想营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化（至少在10代以内）。

★产品号Cat No : BSM0004★产品组成名称产品号规格贮藏条件运输AdvCell®骨髓间充质干细胞基础培养基BM0003 500 ml2-8℃避光冰袋/常温AdvCell®Bone Marrow Mesenchymal Stem CellBase MediumAdvCell®胎牛血清BS0001 25 ml-20℃避光干冰AdvCell® Fetal Bovine SerumAdvCell®骨髓干细胞培养添加物BSMM0004 1 ml-20℃避光干冰AdvCell® Bone Marrow Stem Cell CultureSupplement★产品适用范围适用于人及哺乳类来源的骨髓间充质干细胞的培养。

★使用注意事项1.完全培养基的制备：将以上AdvCell®骨髓间充质干细胞血清培养基（BSM0004）中的AdvCell®骨髓间充质干细胞基础培养基（BM0003）、AdvCell®胎牛血清（BS0001）、AdvCell®骨髓间充质干细胞培养添加剂（BSMM0004）于37℃解冻并迅速混合。

2. 完全培养基的存储：配制好的完全培养基放在4℃冰箱避光保存，并尽量在一个月内使用完。

3. 根据需要，培养过程中可添加一定剂量青霉素∕链霉素(P∕S)。

4. 如客户自制的冻存液冻存的细胞是用作临床治疗，应避免用甘油作为保护剂。

骨髓间充质干细胞复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤目的：体外培养扩增sD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步-临床应用奠定基础。

方法：将SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后，以生长状态良好的骨髓间充质干细胞接种于制备好的组织工程化脱细胞真皮支架上，进行体外联合培养，构建组织工程皮肤。

观察细胞生长情况及组织工程皮肤结构。

结果：体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好，传代扩增容易，组织工程化脱细胞真皮基质去细胞完全，骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质中生长良好，可体外构建组织工程皮肤。

结论：利用体外扩增培养的骨髓间充质干细胞及制备的组织工程化脱细胞真皮基质可以体外联合构建组织工程皮肤。

标签：骨髓间充质干细胞；脱细胞真皮；组织工程皮肤对于大面积皮肤缺损患者，尽早在功能和外观上修复创面对降低病人的死亡率、提高病人的生存质量极为重要。

但由于自体皮源不足和取皮本身又造成新的皮肤缺损等原因，限制了自体皮移植的应用。

组织工程皮肤的研制和应用为大面积皮肤缺损患者带来了福音，但也存在着种子细胞来源不足和理想的支架材料没找到等问题。

骨髓问充质干细胞是具有多项分化能力的成体干细胞，在皮肤创面微环境下，它可以分化为表皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞，另外，它还可分泌多种生长因子，促进创面愈合，有望成为皮肤组织工程理想的种子细胞。

组织工程化脱细胞真皮基质是一种新开发的组织工程支架材料，具有组织相容性好，适于组织再生等优点。

本研究以骨髓间充质干细胞为种子细胞，以组织工程化脱细胞真皮为支架载体，体外联合培养，以期构建组织工程皮肤。

1材料和方法1．1材料：SD大鼠(第四军医大学实验动物中心提供)，Percoll淋巴细胞分离液(1.073g/ml，购自美国Pharmacia公司)，DMEM－F12培养基(购自美国Sigma公司)，胰酶(购自美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青犊牛应用研究所)，超净工作台(Nuair)，CO2孵箱(Nuair)，倒置显微镜(Olympus)1．2方法与步骤1．2．1组织工程化脱细胞真皮基质的制备：在无菌条件下，将BAM用醋酸溶液溶解后，加入1/10体积的胎牛血清和10X的DMEM培养基，调节pH 值为7.2，加入培养的成纤维细胞，使终浓度为106个细胞/ml，再将BAM—细胞悬液加至培养皿中，在37℃、5％CO2条件下固化30min，再加入器官培养液；每天换液，37℃条件下连续培养10天。

猪MSCs的冻存【1】来自:用猪骨髓间充质干细胞为供体生产猪的转基因胚胎细胞冻存液;L-DMEM+20%FBS+10%DMSO.【2】来自：版纳猪骨髓间充质干细胞体外培养最佳条件探索当细胞长满80%时用0.25%胰蛋白酶(trypsin,TN)消化（吸弃培养液，加入0.1MPBS洗，然后加入TN,加培养基）后，离心得到细胞沉淀，加冻存液（培养基：小牛血清：DMSO=7:2:1）。

冻存步骤-70℃过夜（用胶布或封口膜封冻存管口，纱布包若干层，软泡沫包裹，硬泡沫盒装，包布包），-152℃永久冻存（冻存管盒中置裸露冻存管）。

【3】来自：山羊骨髓间充质干细胞体外分离与培养细胞冻存液最佳选择：细胞冻存液分别为DMEM加5%、10%、15%的FBS和5%、10%、15%的DMSO.取对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，以1000r/min离心5min浓缩细胞，用冰浴的冻存液调整细胞浓度为1x107个/ml左右，充分混匀，分装冻存管，每管装0.8-1.0ml，用封口胶带封口，做上标记。

在4℃30min, -20℃60min，-40℃30min, -80℃过夜，最后放入液氮中。

细胞解冻时，取出一管细胞，在空气中停留5s再放入39℃的水中迅速搅动，待细胞冻存液全部溶化后，立即转到培养液中，离心三次去掉冻存液。

用培养液调整细胞密度为1-2x104个/ml.接种到底壁有方格的培养皿中，置于5%CO2，饱和湿度，37℃条件下培养。

培养24h后，在每个培养皿中随机选取10个方格，对每个方格中贴壁与未贴壁细胞进行计数，取平均值，计算细胞贴壁率，从而选择出最佳冻存液。

从表中得到最佳的冻存液为DMEM+10%FBS+10%DMSO或DMEM+15%FBS+10%DMSO. 【4】来自：胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离细胞冻存液：70%а-MEM+10%DMSO+20%NBS.取第1代开始进行细胞冻存。

骨髓间充质干细胞分离及条件培养基在其培养扩增中的作用摘要：【目的】建立一种简便、快速、实用的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells，MSCs)体外分离、纯化和扩增的方法。

【方法】采用贴壁法分离纯化大鼠骨髓MSCs(rMSCs)，并对其形态学特征进行观察，培养时观察条件培养基对rMSCs生长的影响。

【结果】贴壁法能有效地分离rMSCs，采用条件培养液培养，细胞活力好，增殖能力强，对维持细胞正常形态有着重要作用。

【结论】贴壁分离法能成功地进行rMSCs的体外分离，采用爷件培养液建立的rMSCs培养方法有效可行。

关键词：骨髓问充质干细胞／分离和提纯；细胞培养骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种成体干细胞，具有较强的可塑性，能被诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成肌细胞等⋯1，同时发现MSCs还具有独特的免疫调节作用[2-4J。

细胞学、组织学及器官学的研究者均把目光投向MSCs，同时MSCs也受到药理研究者的关注。

MSCs除了可作为组织工程较理想的种子细胞外，也可作为药物作用的靶标或药理研究的工具，利用MSCs体内外生物学性质进行中药作用机理的研究已有众多报道I 。

但由于骨髓中的MSCs含量很低，1 个骨髓单核细胞中仅含有1～2个MSCs~11 J，加之MSCs主要存在于骨内膜_】，要获得满足药物研究所需的数量比较困难。

因此，采用合适的MSCs分离、纯化和扩增的方法是许多研究的重要前提。

1 材料与方法1．1 动物Sprague Dawley(SD)大鼠，性别不限，体质量100～120 g，本校实验动物中心提供，合格证号为SCXK (粤)2003．0001。

1，2 主要试剂低糖Dulbeceo改进的Eagle培养基(1ow glucose Dulbecco’s Modified Ea e Medium，LDMEM)由GIBCO 公司提供；胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)由杭州四季青生物工程材料有限公司提供；2．5 g／L胰酶(含0．2 g／L EDTA)由吉诺生物医药技术有限公司提供；HEPES为Sigma产品，广州威佳公司分装；青霉素、链霉素由华北制药有限公司提供；兔抗大鼠CD44、CD54、I 型胶原抗体，生物素化抗生蛋白链菌素复合(Streptavidin．Biotin．Complex，SABC)试剂盒，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒均由武汉博士德公司提供。

骨髓间充质干细胞研究与应用概况于雷;高俊玲【摘要】骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)是当下热点研究对象之一。

1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞,但研究因为条件原因未能深入。

后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究,发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群,在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长;1987年,又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。

培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。

于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell,MSC)。

【期刊名称】《华北理工大学学报：医学版》【年(卷),期】2018(020)002【总页数】5页(P164-168)【关键词】骨髓间充质干细胞;肺纤维化;缺血性脑卒中【作者】于雷;高俊玲【作者单位】[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;[1]华北理工大学基础医学院,河北唐山063000;【正文语种】中文【中图分类】R329.2骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal cells，BMSCs)是当下热点研究对象之一。

1867年德国病理学家Cohnheim教授[1]在研究创口愈合过程中发现骨髓中存在一种非造血系统的多潜能细胞，但研究因为条件原因未能深入。

后来有研究者[2]在20世纪60年代开展一系列开创性研究，发现从骨髓中分离得到长梭状、成纤维细胞样的细胞群，在塑料培养皿中呈集落样贴壁生长；1987年，又发现这种骨髓单核细胞可在一定的条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。

培养增殖二十代后仍保有其多向分化的潜能。

于是把这种多能细胞称为间充质干细胞(mesenchyma stem cell，MSC)。

isct 间充质干细胞鉴定标准理论说明1. 引言1.1 概述在细胞治疗和再生医学领域，间充质干细胞（ISCT）作为一种重要的细胞资源，引起了广泛的关注。

ISCT具有多向分化潜能、免疫调节作用及促进组织修复的能力，被认为是一种理想的干细胞来源。

然而，由于缺乏统一和规范的鉴定标准，在实践应用中存在着不确定性和挑战。

1.2 文章结构本文将对ISCT进行深入探讨，并重点介绍其鉴定标准的理论说明。

文章包括以下几个部分：引言、ISCT间充质干细胞、鉴定标准理论说明、实践应用与挑战以及结论与展望。

1.3 目的本文旨在系统梳理当前关于ISCT鉴定标准的理论知识，并探讨该领域面临的实践应用和挑战。

通过对ISCT表面标记物使用、功能性特征评估方法以及分子生物学检测手段应用等方面原理的介绍，希望能够提供给读者一个全面的理论基础，并展望ISCT鉴定标准未来的发展方向。

同时，对于临床转化前景展望、存在的问题与挑战以及解决方案和研究进展等方面也将进行讨论。

以上是本文“1. 引言”部分的详细内容。

该部分概述了文章的主题和目的，并介绍了本文的结构。

接下来将继续展开描述ISCT间充质干细胞及其鉴定标准相关内容。

2. ISCT间充质干细胞2.1 定义与特征ISCT（国际干细胞治疗学会）定义了间充质干细胞（MSCs）作为一类多潜能的成体干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。

这些细胞可以从不同来源获得，包括骨髓、脐带血、脂肪组织等。

ISCT认为，MSCs应满足以下三个基本标准：1) 在培养条件下，MSCs应具备黏附能力；2) MSCs应表达特定的表面标记物，如CD73、CD90和CD105，并且在同时应该缺乏（或仅有极低水平）CD34、CD45、HLA-DR等造血和免疫相关标记物；3) MSCs应能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等不同种类的细胞。

此外，ISCT提出了额外的功能性特点来进一步确认MSCs。

这些功能性特点包括：1) 免疫调节作用：MSCs可以抑制免疫反应，并通过调节T淋巴细胞、B 淋巴细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞的功能来达到免疫调节作用；2) 细胞迁移能力：MSCs具有从注射部位向受损组织迁移的能力；3) 分泌多种生物活性分子：MSCs可以产生多种生长因子、细胞因子和表观遗传调控因子，对损伤修复和组织再生具有重要作用。

大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分离与鉴定材料试剂(一)主要设备和产地1.手术器械上海手术器械厂2.台式水平离心机Eppendorf，5810R德国3.Nanopure超纯水仪日本SANYO公司4.AA一200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司5.低温高速离心机ThermoForma公司6.90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂7.电动匀速垂直转轮上海沪西分析仪器厂8.微量移液枪德国Eppendorf公司9.烧杯、容量瓶上海实生公司10.全自动酶标光度仪美国Bio-Rad公司11.6cm/10cm细胞培养皿美国Conring12.2mL冻存管、细胞冷冻储存器美国Conring13.低温高速离心机ThermoForma公司产品14.YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司15.C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司16.CK40-F200型倒置显微镜日本Olympus公司17.10ml注射器美国BD公司(二)试剂和材料1.谷氨酰胺(L-Glutamine)美国Hyclone公司2.75%消毒酒精上海生工3.肝素美国sigma公司4.胰蛋白酶美国Amresco公司5.胎牛血清美国Gibco公司6.α-MEM培养液美国Hyclone公司7.5-6周龄SD大鼠上海斯莱克实验动物有限公司8.Percoll细胞分离液美国GE公司9.DMSO(细胞培养级)美国Sigma公司Rat BMSC的分离与培养分离颈椎脱臼法处死大鼠，75%酒精中浸泡5分钟，超级工作台内依次取下大鼠两条胫骨及两条股骨。

用手术器械将长骨上附着的肌肉组织尽量去除干净，整个过程保持无菌。

用剪刀剪去长骨两端，10ml注射器吸取加入肝素的完全培养液（10%FBSα-MEM），从长骨一端开口处注入，将骨髓腔内的细胞出入到50ml离心管内，直至长骨冲洗的发白，认为骨髓腔内的细胞都被吹入离心管内。

干细胞无血清培养基排名最近总是有实验室老板和学生向我咨询到底该买哪一款无血清培养基，什么牌子的无血清培养基比较好，不知道作何选择。

确实是，目前市面上有多款无血清培养基，琳琅满目，有好也有坏，要想使用一款比较好的无血清培养基，对于刚刚使用无血清培养基的老师和同学而言还是比较不容易甄别的。

本人十几年来天天跟干细胞培养打交道，使用过市面上绝大部分无血清干细胞培养基尤其是脂肪干细胞和间充质干细胞的无血清培养基。

每次最开心的就是每当市面上出现一款新的无血清培养基的时候就买回来赶紧试一试效果，呵呵，这也算是一个小小的爱好。

1. MesenCult TM 间充质干细胞无血清培养基非常好用的一款无血清培养基，著名的Stemcell Technology公司的拳头产品。

我个人还是比较有感觉的一款培养基，以前经常用来饲养人的骨髓间充质干细胞，扩增迅速，形态也非常好，脂肪干细胞也用它培养过，效果也还是可以。

脐带来源的间充质干细胞也饲养过，个人感觉一般，主要是扩增不太好，后来就没有再用了。

顺便说一下，买了他家的产品就送一张精美的干细胞相关的大海报和精美宣传册，确实是一家比较用心的公司。

2. Advcell○R间充质干细胞无血清培养基佰通生物(BioWiseTech) 的子牌子，这个牌子在国内主要是给工业客户提供无血清培养基，在实验室可能不如Stemcell Technology和Gibco牌子响亮和普及，但是却是我非常认可的一个牌子，非常有潜力，培养效果超好（呵呵，别喷我，我不是商家，也不是推手，我不给这些公司打广告，好用就好用，不好用就不好用）。

我最初用这个牌子的无血清培养基是因为我采用人的眼袋组织分离脂肪干细胞的时候，使用了其他无血清培养基都没有分离出来，最后无奈在市面上买了一款他家的针对脂肪干细胞的无血清培养基马上用上，结果有很多细胞贴壁，FACS显示CD29，CD44表达高达98%，CD90和CD105表达也在95%左右。

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定干细胞研究一直是生物医学领域的前沿热点，其中骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其具有多向分化潜能和低免疫原性而备受。

在众多研究中，大鼠BMSCs的体外培养和鉴定方法为其在科研和临床领域的应用提供了基础。

本文将就大鼠BMSCs的培养、鉴定方法进行详细介绍，并结合实验数据进行阐述。

BMSCs是一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。

因其来源广泛，免疫原性低，大鼠BMSCs已成为再生医学、免疫调节等领域的重要研究对象。

近年来，随着生物技术的不断发展，BMSCs的培养和鉴定方法也得到了不断优化和改进。

BMSCs的培养需要无菌环境，常用的培养基为DMEM、F12等，添加适量的生长因子和抗生素以维持细胞的生长和存活。

细胞的鉴定主要包括形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实。

其中，表面标志物如CDCD90等可用来区分BMSCs和其他细胞，多向分化潜能的证实包括成骨、成脂和成肌等方向的诱导分化。

本实验采用大鼠BMSCs的常规体外培养方法。

具体步骤如下：采集大鼠骨髓：在无菌环境下，用注射器抽取大鼠股骨和胫骨骨髓，加入肝素抗凝。

细胞分离：将采集的骨髓用密度梯度离心法分离出单个核细胞。

细胞培养：将单个核细胞接种于培养瓶中，用含10%血清、1%抗生素和1%谷氨酰胺的培养基培养。

细胞鉴定：经过约7-10天的培养，细胞达到80%-90%融合时，进行细胞鉴定。

通过形态学观察、表面标志物检测和多向分化潜能的证实，对BMSCs进行鉴定。

通过观察细胞的形态和生长情况，发现培养的BMSCs呈典型的长梭形，且细胞间连接紧密（图1）。

经表面标志物检测，BMSCs表达CD29和CD90等间充质干细胞表面标志物（图2）。

在多向分化潜能的证实中，我们发现BMSCs经成骨、成脂和成肌诱导后，可分别形成矿化结节、脂肪滴和肌纤维（图3）。

这些结果说明所培养的细胞为BMSCs。

人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体特性研究一、本文概述Overview of this article随着生物医学领域的快速发展，干细胞及其分泌产物的研究已成为当前生命科学领域的热点之一。

人骨髓来源间充质干细胞（hMSCs）作为一种具有多向分化潜能的成体干细胞，其在组织工程、再生医学以及疾病治疗等领域的应用潜力备受关注。

近年来，随着对外泌体（Exosomes）研究的深入，人们发现hMSCs分泌的外泌体在细胞间的信息传递、免疫调节以及组织修复等方面发挥着重要作用。

因此，本文旨在深入研究人骨髓来源间充质干细胞分泌外泌体的特性，以期为hMSCs在医学领域的临床应用提供新的思路和方法。

With the rapid development of the biomedical field, research on stem cells and their secreted products has become one of the hotspots in the current field of life sciences. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs), as an adult stem cell with multi-directional differentiation potential, have attracted much attention for their potential applications in tissue engineering, regenerative medicine, and diseasetreatment. In recent years, with the deepening of research on exosomes, it has been found that exosomes secreted by hMSCs play important roles in intercellular information transmission, immune regulation, and tissue repair. Therefore, this article aims to investigate in depth the characteristics of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells secreting exosomes, in order to provide new ideas and methods for the clinical application of hMSCs in the medical field.本文将首先介绍hMSCs的基本生物学特性及其在组织工程和再生医学中的应用。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养以及成脂、成骨诱导分化一，C57小鼠BMSCs原代培养1，实验前准备好相关手术器械，培养器材及相关试剂PBS 平衡缓冲液、10％FBS，IMDM培养基。

2，脱颈法处死C57小鼠，在75％乙醇中浸泡5min，转移至超净工作台中，无菌条件下分离出小鼠的长骨(股骨和胫骨)，浸泡于PBS溶液中。

3，对股骨和胫骨进行深层次解剖，去除附着的肌肉组织，剪掉长骨两端的干骺端，用10％FBS，IMDM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白，收集洗涤液，用移液枪轻轻吹散分离为单个细胞。

4，细胞接种于六孔板中培养，轻微摇匀，使细胞在孔中均匀分布，放置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养，培养期间不要移动六孔板，使BMSCs充分贴壁。

5，培养48h后换液，用预热的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次，添加新鲜培养基，之后每隔48h换液1次。

原代培养6-7d 后细胞铺满80％(图1)，可进行传代培养。

图1：BMSCs原代培养6-7d二，BMSCs成脂诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成脂诱导培养基(IMDM中加入10%FBS，10μg/ml胰岛素，1μM 地塞米松，0.5mMIBMX，0.1mM吲哚美辛)。

3d换液1次，分化12d。

待脂滴形成后进行油红O染色，PBS缓冲液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS缓冲液清洗2次，油红O染液浸染30min，PBS缓冲液清洗2次，苏木素染液浸染1min，弃去染液，倒置显微镜下观察拍照。

成脂诱导分化过程中发现在诱导5d时，细胞形态开始变圆并大量脱落，部分细胞中出现细小脂滴(图2)。

图2：BMSCs成脂诱导5d三，BMSCs成骨诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成骨诱导培养基(IMDM中加入10%FBS,5μg/ml胰岛素，0.1μM 地塞米松，0.2mM维生素C和10mMβ-甘油磷酸盐)。

猪骨髓间充质干细胞的培养与分离实验准备：器材:手术刀片，手术刀柄，剪刀，镊子，弯钳,5ml灭菌注射器，7号注射针头，10ml离心管，离心机，100mm培养皿，75ml培养瓶试剂：低糖DMEM（含有10%FBS,75µg/ml青霉素，50µg/ml硫酸链霉素）1000iu/ml青链霉素的PBS(生理盐水）(装入灭菌的洗瓶中)无血清低糖DMEM。

2%台盼蓝染液材料采集：一,胎猪骨髓采集：【1】 1，无菌条件下从猪子宫内取出胎儿置入到保温瓶中，加入含有青链霉素的PBS或生理盐水中，立即送回实验室.2，在无菌操作下取下左右股骨，除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织;用PBS冲洗3-4次用灭菌生理盐水冲洗干净，在超净工作台内剥离肌肉和骨膜,得到完整的股骨.立即用含有1。

0ml DMEM+3000iu/ml肝素的注射器冲骨髓腔，迅速换上5号的针头将冲出的骨髓血轻轻吹打，再加入等量培养液（DMEM+10％FBS)稀释，然后以1：4比例缓慢加入到Percoll分离液（1。

073g/ml）的表面，1000r/min 30min，小心吸取乳白色的有核细胞层。

目前用于分离MSCs的方法主要有密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和贴壁筛选法。

密度梯度离心法目前主要包括利用percoll分离液分离MSCs和利用淋巴细胞分离液分离MSCs两种。

Percoll密度梯度离心法根据细胞密度不同将细胞分为数层,因此得到的MSCs纯度较高，但是操作繁琐,而淋巴细胞密度梯度离心法虽得到的MSCs不及percoll密度梯度离心法得到的细胞纯度高，但是操作简单，且获得的MSCs增殖活性较强.【13】来自：胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离取2—3月龄猪胎儿，在无菌操作下取下左右股骨，用含1000iu/ml青链霉素的PBS浸泡30min,除净肌肉、骨膜及股骨两端软骨组织；用PBS冲洗3—4遍;用吸有4ml а-MEM细胞培养液的一次性无菌5ml注射器刺入处理好的股骨的一端,冲出骨髓，然后用7号针头轻轻吹吸数次,使冲出的骨髓尽可能分散为单个细胞,100目滤沙过滤；1000rpm/min,离心5min,用а—MEM细胞培养液制成细胞悬液，计数后，调整有核细胞的密度为1-2x107/ml。