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人卵巢癌干细胞的分离培养和初步鉴定

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·论著·人卵巢癌干细胞的分离培养和初步鉴定*武加利1，纪新强1＊＊，刘佳1，张文卿2（1．青岛大学医学院附属医院妇科，青岛266003；2．青岛大学医学院病原生物教研室）【摘要】目的：从人卵巢癌细胞株SKOV-3中分离培养卵巢癌干细胞，并鉴定其生物学性质。

方法：卵巢癌SKOV-3细胞在含有生长因子的无血清培养基（SFM ）中悬浮培养得到肿瘤细胞球。

流式细胞术、Transwell 小室侵袭实验分别检测SKOV-3细胞及其细胞球CD44和CD117的表达，筛选细胞表面标记物和观察体外侵袭能力；将肿瘤细胞球传代扩增，并用含血清培养基（SSM ）培养促使其分化，并将细胞球和普通SKOV-3细胞分别接种于96孔板，CCK-8法检测增殖能力及其耐药性。

结果：卵巢癌SKOV-3细胞能在SFM 中形成可以稳定传代的细胞球，并显示很强的自我更新和增殖能力，含血清环境能够诱导其分化而贴壁生长；肿瘤细胞球中高表达CD44和CD117抗原标记，特别是CD44，其侵袭能力显著高于正常SKOV-3细胞（P ＜0．05）；细胞球对顺铂具有更强的耐药性，将顺铂作用于细胞球及贴壁分化细胞24，48及72h 后，细胞球抑制率分别为2．59%，8．43%，12．08%，显著低于分化贴壁细胞（抑制率分别为10．73%，28．13%，39．17%），分别比较，差异均有统计学意义（P ＜0．05）。

结论：采用无血清悬浮培养法从人卵巢癌细胞系中获取的细胞球，可能含有一小部分具有增殖和分化能力的卵巢癌干细胞，多表达CD44和CD117抗原标记，且CD44更具有特异性。

【关键词】卵巢肿瘤；肿瘤干细胞；肿瘤球状体细胞；无血清培养基，悬浮培养中图分类号：R737．31文献标识码：A 文章编号：1004－7379（2010）12－0893－04Isolation and initial identification of human ovarian cancer stem cells．Wu Jiali ，Ji Xin-qiang ，Liu Jia ，et al．Department of Gynecology ，Affiliated Hospital of Medical College of QingdaoUniversity ，Qingdao 266003【Abstract 】Objective ：To isolate and identify ovarian cancer stem cells from human o-varian cancer cell line SKOV-3and to identify their biological properties．Methods ：SKOV-3cells were cultured in serum free medium （SFM ）with EGF and bFGF to derive tumor spheres．Flow cytometry analysis and cell invasion assay were applied to examine the cell surface marker （CD44，CD117）expression pattern and cell invasive ability of both tumor spheres and parentalcells ；Tumor spheres were then expanded and cultured in serum-containing medium to permit their differentiation．The proliferative capacity and drug resistance of tumor sphere-forming cellswas tested by cell counting kit-8（CCK-8）assay．Results ：Small number of floating tumorspheres were isolated and expanded in serum free medium （SFM ）．These tumor spheres atta-ched to the bottom of culture plates and began to differentiate in serum-supplemented medium（SSM ）；CD44and CD117antigens were significantly higher in tumor spheres than those in the common SKOV-3cells ，and the invasive ability was increased than those of parental cells （P ＜0．05）．By contrast with the differentiated cells under standard serum-containing culture condi-tions ，these sphere-forming cells were more resistant to cisplatin after 24，48and 72hours oftreatment （2．3%vs 9．1%，8．6%vs 22．8%and 18．7%vs 36．8%，P ＜0．05）．Conclusion ：The sphere-forming cells isolated from human ovarian cancer cell line have the characterizationof cancer stem cells ，and significantly express CD44、CD117antigens．CD44may be a specific antigen marker for the human ovarian cancer stem cells．【Key words 】Ovarian neoplasms ；Tumor stem cells ；Tumor spherpids ；Serum free medi-um ，floating culture system398＊＊＊山东省自然科学基金（No ：Y2008c33）通讯作者Email ：jxqsjy@126．com肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）理论认为，肿瘤中存在一小部分具有干细胞特征的细胞，具有形成肿瘤和维持其恶性表型的功能；肿瘤干细胞对放疗及化疗药物不敏感，可能是肿瘤转移、复发、逃避化疗的根源［1］。

由于肿瘤干细胞的比例很小，如何分离、纯化，成为研究肿瘤干细胞技术的瓶颈。

最近研究表明，用无血清培养法［添加表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等］已从脑肿瘤、乳腺癌等组织或细胞系中获得细胞球。

这些细胞球具有干细胞样特征：自我更新、多向分化能力［2-4］。

本研究从人卵巢癌细胞系中采用无血清培养法分离培养卵巢癌干细胞，并鉴定其生物学特性，以期为今后卵巢癌个性化治疗及疗效评价提供实验基础。

1材料与方法1．1细胞株、主要试剂和仪器人卵巢癌细胞株SKOV-3（中科院上海细胞库）；DMEM/F12培养基（1ʒ1，Hy-clone）；RMPI 1640培养基和B27（Gibco）；L-谷氨酰胺，葡萄糖，肝素钠以及胰岛素（Sigma）；人表皮生长因子（EGF）和人碱性成纤维生长因子（bFGF）（Peprotech）；0．25%胰蛋白酶+0．04%EDTA消化液和优级胎牛血清（中国TBD）；Matrigel胶（美国BD），Tr-answell小室，25cm2培养瓶，6孔、24孔及96孔细胞培养板（美国Corning）；CCK-8试剂盒（上海碧云天）。

抗CD44-FITC （法国Immunotech）；抗CD117-PE（eBioscience）；流式细胞仪（美国Beckman CoultER）；低温高速离心机（德国Heraeus）。

1．2卵巢癌细胞球培养、传代卵巢癌SKOV-3由含10%胎牛血清RMPI1640培养基（serum-supplemented medium，SSM）常规培养。

配制无血清培养基（serum-free medium，SFM），即在不含血清的DMEM/F12培养基中添加葡萄糖（6mg/ml）、胰岛素（2μg/ml）、B27（与培养液体积比1ʒ50）、肝素钠（4μg/ml）、EGF（20ng/ml）、bFGF（20ng/ml）、青霉素（100U/ml）、链霉素（100U/ml）。

取对数生长期的细胞，0．25%胰酶+0．04%EDTA消化5min后吹打成单细胞悬液，用无血清培养基重悬，台盼蓝染色计数，以2ˑ104/ml密度接种至SFM中进行常规培养，SFM分别加入玻璃培养瓶和6孔板中，每日摇晃数次，观察细胞球形成情况，每3 4天半量换液1次，每7天传代1次。

传代时收集在SFM中悬浮的细胞球，将其离心后弃掉上清后重悬于0．25%胰酶消化液中，37ħ消化10min，添加10%胎牛血清RMPI1640培养基终止消化，吹打数次至细胞球离散为单细胞，离心洗涤后计数，仍以2ˑ104/ml密度接种至SFM中传代培养。

1．3流式细胞术检测细胞球中CD44、CD117的表达收集培养4天的第2代细胞球和正常贴壁分化细胞，胰蛋白酶消化获得单细胞悬液，PBS缓冲液洗涤细胞2次，调整细胞密度为100μl（1ˑ106个/ml），分别加入FITC-CD44抗体10μl和PE-CD117抗体5μl标志细胞，同时每种荧光抗体设同型对照，避光操作，室温孵育15min，1000r/min离心5min，弃上清，加入300μl PBS，吹打均匀后上机检测。

1．4细胞增殖实验（CCK-8法）将用SSM培养的SKOV-3细胞和用SFM培养的卵巢癌细胞球分别按2ˑ103/孔（100μl）接种于96孔板，同时以不加细胞的培养基调零，一起置于培养箱内分别培养1、2、3、4、5、6、7天。

结束培养前4h每孔加入10μl的CCK-8继续培养2h，用全自动荧光酶标仪于490nm波长处分别检测两类细胞的吸光度（A）值，取平均值并绘制细胞生长曲线。

1．5诱导分化实验在SFM中培养第2代细胞球形成4天后，收集细胞球以1000r/min离心5min，弃上清，沉淀重悬于SSM培养液中，按1ʒ2接种于25ml玻璃培养瓶中，添加5ml DMEM/F12+10%胎牛血清培养液，37ħ、5%CO2培养箱中培养。

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人卵巢癌干细胞的分离、鉴定及其特异性microRNA的筛选共3篇

人卵巢癌干细胞的分离、鉴定及其特异性microRNA的筛选共3篇

人卵巢癌干细胞的分离、鉴定及其特异性microRNA的筛选共3篇人卵巢癌干细胞的分离、鉴定及其特异性microRNA的筛选1人卵巢癌干细胞的分离、鉴定及其特异性microRNA的筛选卵巢癌是妇女常见的恶性肿瘤之一，也是最具侵袭性和死亡率的妇科恶性肿瘤之一。

近年来，研究表明卵巢癌干细胞（OCSCs）在卵巢癌的发生、发展和复发中起着非常重要的作用。

OCSCs具有高度的增殖、分化和肿瘤形成能力，容易逃避传统治疗手段的检测和清除。

因此，深入研究OCSCs的分离、鉴定和治疗靶点，对于提高卵巢癌的治疗效果和预后具有非常重要的意义。

OCSCs的分离主要依赖于某些细胞表面分子的识别和分离技术。

研究表明，CD133，CD44和CD117等基因标记物是OCSCs表面的主要特征，可以作为OCSCs的识别和定位标志。

因此，这些表面分子的选择性抗体可以用于OCSCs的分离和富集。

通过流式细胞术（FACS）和磁珠分离技术等先进的细胞分离技术，可以从卵巢癌患者的肿瘤组织样本中纯化出高含量的OCSCs种群。

随着单细胞测序技术的发展，进一步可以研究OCSCs的基因、蛋白、代谢和功能特性等。

OCSCs的鉴定是指对其肿瘤形成、侵袭战略和治疗抵抗性的研究，具有非常重要的临床意义。

研究表明，OCSCs在细胞凋亡、DNA修复、肿瘤增殖和脱靶治疗等方面具有突出的特性。

因此，通过对OCSCs的微观和宏观观察，可以识别OCSCs的不同亚群，并进一步探究其分化程度、增殖模式、治疗耐受性等特征。

同时，通过体内和体外肿瘤模型的建立和治疗实验，可以验证OCSCs的肿瘤形成能力和抗药性。

最近的研究还表明，OCSCs还具有干细胞外泌体通路调控的特性，通过这种方式影响癌细胞的行为和治疗反应。

microRNA（miRNA）是非编码小RNA分子，在细胞代谢、增殖、分化、凋亡和信号转导等方面具有重要的调节作用。

研究表明，miRNA在OCSCs的增殖、分化、转移和耐受性等方面起着非常关键的作用。

214362919_人骨髓间充质干细胞来源外泌体分离、鉴定及卵巢摄取

214362919_人骨髓间充质干细胞来源外泌体分离、鉴定及卵巢摄取

人骨髓间充质干细胞来源外泌体分离、鉴定及卵巢摄取杨雨涛，王袁，谢嘉欣，付霞霏△摘要：目的提取及鉴定人骨髓间充质干细胞（hBMSC）来源外泌体，探讨颗粒细胞及自身免疫性早发性卵巢功能不全（POI）小鼠卵巢摄取外泌体的情况。

方法取P3至P9代hBMSC培养上清液，倒置显微镜下观察P4代hBMSC 细胞形态，超高速离心法提取外泌体；纳米流式仪测外泌体粒径；透射电镜观察外泌体形态；Western blot检测外泌体标志蛋白CD63、CD9、肿瘤易感基因（TSG）101表达。

外泌体采用DiR进行荧光标记；共聚焦显微镜观察人卵巢颗粒细胞（KGN）共孵育24h和48h摄取外泌体的情况；用ZP3蛋白多肽构建自身免疫性POI小鼠模型，在建模成功后的第1、7天腹腔注射150µg DiR标记的外泌体。

在第2次注射外泌体后的第14天通过活体成像仪监测小鼠卵巢摄取情况。

结果hBMSC呈纺锤状，大小均一，提取出的外泌体平均直径为（81.12±17.23）nm。

透射电镜显示外泌体结构为双层膜状；外泌体表面相关特异性蛋白CD63、CD9和TSG101呈阳性。

共聚焦显微镜下观察到KGN细胞能够摄取外泌体，并与共孵育24h比，48h摄取的外泌体量更多。

在自身免疫性POI小鼠模型中观察到小鼠卵巢部位有发光信号。

结论本研究成功提取出hBMSC来源外泌体，并观察到KGN细胞及自身免疫性POI小鼠卵巢组织摄取外泌体。

关键词：间质干细胞；外泌体；自身免疫；超速离心法；早发性卵巢功能不全；颗粒细胞中图分类号：R711.75文献标志码：A DOI：10.11958/20221305Isolation,identification and ovarian uptake of exosomes derived from human bone marrowmesenchymal stem cellsYANG Yutao,WANG Yuan,XIE Jiaxin,FU Xiafei△Department of Obstetrics and Gynecology,Zhujiang Hospital of Southern Medical University,Guangzhou510282,China△Corresponding Author E-mail:Abstract:Objective To extract and identify exosomes derived from human bone marrow mesenchymal stem cells基金项目：国家自然科学基金资助项目（82271657）；广东省自然科学基金资助项目（2021A1515010701）作者单位：南方医科大学珠江医院妇产医学中心（邮编510282）作者简介：杨雨涛（1997），女，硕士在读，主要从事妇科内分泌疾病方面研究。

卵巢癌肿瘤干细胞分离鉴定方法的进展

卵巢癌肿瘤干细胞分离鉴定方法的进展

卵巢癌肿瘤干细胞分离鉴定方法的进展
杨柳;乔杰;郭红燕
【期刊名称】《现代妇产科进展》
【年(卷),期】2013(22)9
【摘要】卵巢癌肿瘤干细胞是卵巢癌发生、复发及耐药的根源。

成功分离、鉴定肿瘤干细胞,有助于研究其特性,并针对性地开发靶向治疗手段。

目前已有一些较公认的可分离、富集肿瘤干细胞的方法,但由于肿瘤干细胞来源尚不清楚、卵巢癌存在高度异质性、体内体外环境差异大,这些方法均存在一定的局限性。

分析现有的分离鉴定方法,寻找特异的干细胞标记物,谨慎对待实验结果,有助于正确认识肿瘤干细胞。

【总页数】3页(P759-761)
【关键词】卵巢癌;肿瘤干细胞;分离鉴定
【作者】杨柳;乔杰;郭红燕
【作者单位】北京大学第三医院妇科
【正文语种】中文
【中图分类】R737.31
【相关文献】
1.人卵巢癌组织肿瘤干细胞的分离和鉴定 [J], 林盛;龙海霞;向橦;朱波;谢荣凯
2.肿瘤干细胞分离鉴定方法的研究进展 [J], 程俊美;谢峰;王慧
3.肿瘤干细胞理论及肿瘤干细胞分离和鉴定研究进展 [J], 宋东颖;王毅;孙岚;张英
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4.卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定 [J], 俞晓毓;吴迪;王净;李菲;白绪乐;赵枫姝;窦骏
5.卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定 [J], 俞晓毓;吴迪;王净;李菲;白绪乐;赵枫姝;窦骏;;;;;;;;;
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卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定

卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2018)29-04687-05 4687www.CRTER .org·研究原著·俞晓毓，女，1992年生，江苏省盱眙县人，汉族，东南大学在读硕士，主要从事肿瘤干细胞研究。

并列第一作者：吴迪，女，1987年生，江苏省淮安市人，汉族，东南大学在读博士，主要从事肿瘤干细胞疫苗研究。

通讯作者：窦骏，教授，博士生导师，东南大学医学院病原微生物学与免疫学系，江苏省南京市 210009中图分类号:R394.2 文献标识码:A稿件接受：2018-05-15Yu Xiao-yu, Master candidate, Department of Pathogenic Biology and Immunology, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, ChinaWu Di, Doctorate candidate, Department of Pathogenic Biology and Immunology, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China; Department of Gynecology & Obstetrics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, ChinaYu Xiao-yu and Wu Di contributed equally to this work.Corresponding author: Dou Jun, Professor, Doctoral supervisor, Department of Pathogenic Biology and Immunology, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China卵巢癌细胞系ID8中肿瘤干细胞的分离及生物学特性鉴定俞晓毓1，吴 迪1，2，王 净2，李 菲1，白绪乐1，2，赵枫姝1，窦 骏1 (1东南大学医学院病原生物学与免疫学系，江苏省南京市 210009；2东南大学附属中大医院妇产科，江苏省南京市 210009)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0968 ORCID: 0000-0003-4459-1618(俞晓毓)文章快速阅读：文题释义：肿瘤干细胞或癌干细胞(cancer stem cell ，CSC)：是指肿瘤组织中极小部分能够自我更新、无限分化并具有耐受放化疗等特点的肿瘤细胞，与干细胞的基本特性十分相似，被认为是肿瘤形成、进展、复发和耐药的根源。