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造血干细胞的采集原理、冻存及回输山东省立医院姜玉杰造血干细胞移植的原理造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)）是经过大剂量放、化疗或其他免疫抑制预处理，清除受体体内的肿瘤细胞、异常克隆细胞、阻断发病机制，然后把自体或异体造血干细胞通过静脉回输给受体，以替代原有的病理性造血干细胞，从而使患者正常的造血及免疫系统得以重建，从而达到治疗的目的的一种治疗手段。
HSCT的基本流程•Injection：供者注射动员剂（G-CSF）•Mobilization：干细胞动员•Collection：干细胞采集•Storage (Cryopreservation)：干细胞分装储存（冻存）•Conditioning：预处理•Transfusion：干细胞回输•Engraftment & recovery：植入和恢复HSCT基本流程造血干细胞的表面标志•CD34 造血细胞的一种重要标志，CD34+细胞占骨髓细胞的1%~4%•CD117 是干细胞生长因子受体，IgSF（免疫球蛋白超家族）成员，CD117+约细胞占骨髓细胞的1%~4%•50%~70%的CD117+骨髓细胞表达CD34供体造血干细胞采集标准•选择合适的方式,通过外周血或骨髓采集供体的造血干细胞。
•造血干细胞需要采集到一定的数量：•单个核细胞须达到4-6 ×108/;•CD34+细胞(造血干细胞)在HLA半相合时，应达到达到2 ～4 ×106/kg 和1 ×107/kg，全相合和自体造血干细胞移植患者可适当放宽标准；•如有HLA抗原理想的脐带血,也是儿童患者合适的干细胞来源。
血液成份分离基于它们不同的重力，在一定的离心力下分离细胞.PlasmaPacked red cells BuffycoatGranulocytes1.085*Monocytes1.065*Lymphocytes1.071*Platelets1.048**Average specific gravity of cell type shown*以上显示的为细胞的平均比重自体造血干细胞的采集•采集时机：•WBC>5 109/L BPC>50（30） 109/L CD34+细胞>1%•采集用血细胞分离机COBE Spectra Baxter CS 3000•采集细胞数（移植阈）•MNC >6~8 108/Kg•CD34+ >2 106/Kg•多发性骨髓瘤（二次移植）体外净化技术•物理学方法：微波加热（42-43℃）、光敏剂步化青（MC-540）•药物学方法：选择药物：血液学毒性小、易灭活、对肿瘤及正常造血干细胞杀伤存在较大差异。
分离人外周血造血干细胞的实验记录一、分离方法说明及图例A.Ⅰ.取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；Ⅱ.取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约1500转/分）离心5分钟，弃去上清。
沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液（本实验采用的是天津灏洋TBD实验室的分离液）之液面上（混合液：分离液=2:1）；E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；第三层；为透明分离液层。
第四层；为极少数红细胞层。
收集第二层细胞放入约为其5-10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1 5分钟。
沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。
F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。
原代造血干细胞培养
1. 细胞来源，造血干细胞可以从骨髓、外周血或者胎盘等多种来源获得，不同来源的细胞可能有不同的特性，需要根据实验目的选择合适的来源。
2. 细胞分离，从原代组织中分离出造血干细胞需要使用适当的分离方法，比如密度梯度离心、免疫磁珠分选等，以保证分离的细胞具有较高的纯度和活力。
3. 培养条件，原代造血干细胞在体外培养时需要提供适当的营养物质、生长因子和培养基，同时也需要控制适当的温度、湿度和气体环境，以提供良好的生长条件。
4. 培养监测，在培养过程中需要定期观察细胞的形态、增殖情况和表型特征，以及对细胞进行鉴定和纯度检测，确保培养的细胞符合实验要求。
5. 应用领域，原代造血干细胞培养在干细胞治疗、造血系统疾病研究、药物筛选等领域具有重要的应用前景，可以为相关疾病的治疗和研究提供重要的实验材料。
综上所述，原代造血干细胞培养是一项复杂而重要的实验技术，需要在细胞来源、分离方法、培养条件和监测等方面进行严格的操
作和控制，以确保获得高质量的细胞用于后续的研究和应用。
造血干细胞体外培养
首先，造血干细胞体外培养的过程通常涉及到从骨髓、外周血或者脐带血等来源中分离出造血干细胞。
这些干细胞随后会被置于含有适当营养物质和生长因子的培养基中进行培养。
培养基的配方需要精确控制，以提供适当的营养和环境条件来促进干细胞的增殖和分化。
其次，体外培养的过程中需要严格控制培养条件，包括温度、湿度、氧气浓度等因素。
这些条件对于干细胞的生长和分化至关重要，因此需要精确监控和调节。
此外，体外培养的过程也需要考虑到细胞的纯度和活性。
在培养过程中，需要定期检测和评估干细胞的纯度和活性，以确保其符合临床应用的要求。
在实际应用中，体外培养的造血干细胞可以用于干细胞移植，用于治疗白血病、淋巴瘤、贫血等血液系统疾病。
此外，体外培养的造血干细胞也被用于研究干细胞生物学以及药物筛选等领域。
总的来说，造血干细胞体外培养是一项复杂而重要的技术，它
为干细胞移植和血液系统疾病治疗提供了重要的支持，同时也推动了干细胞生物学和临床应用的发展。
随着技术的不断进步，相信体外培养技术将在未来发挥更加重要的作用。
造血干细胞培养造血干细胞是一类具有自我更新和分化能力的细胞，能够持续产生各种成熟的血细胞。
在人体造血系统中，造血干细胞起着至关重要的作用，它们能够不断地分裂和分化，以满足机体对血细胞的需求。
然而，由于某些疾病或外界因素的干扰，造血干细胞的功能可能受到损害，这就需要进行造血干细胞的培养。
造血干细胞培养是指在体外人工培养条件下，利用特定的培养基和因子，使原始的造血干细胞能够持续增殖和分化，以获得大量的干细胞。
这种培养技术的发展，为临床治疗提供了重要的资源和方法。
造血干细胞培养的关键是提供适宜的培养环境和因子。
首先，培养基的选择非常重要。
培养基中应包含适当的营养物质和生长因子，以支持干细胞的生长和分化。
同时，培养基还应具备维持细胞健康和增殖的功能。
现在，已经开发出多种不同的培养基，如StemPro® HSC Expansion Medium和X-VIVO 10等，可以满足不同类型的干细胞的需求。
培养过程中的因子也是至关重要的。
这些因子能够促进干细胞的增殖和分化。
常用的因子包括血小板衍生生长因子（PDGF）、骨髓基质细胞衍生生长因子（SCF）、造血细胞因子（HSC）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。
这些因子可以通过添加到培养基中，提供给细胞，以促进其增殖和分化。
在培养过程中，还需要注意对细胞的处理和培养条件的控制。
首先，需要从合适的来源中获取到造血干细胞，如骨髓或外周血。
然后，通过特定的方法分离和富集干细胞，以获取纯度较高的种群。
接下来，将干细胞种植到预先准备好的培养基中，进行培养。
在培养过程中，需要控制培养皿的温度、湿度和氧气浓度等条件，以提供适宜的环境。
在培养过程中，可以通过不同的方法监测细胞的增殖和分化情况。
常用的方法有流式细胞术、定量PCR和免疫组织化学等。
这些方法可以帮助研究人员了解细胞的状态，并进行进一步的调控。
造血干细胞培养的应用非常广泛。
首先，它可以用于临床治疗。
对于一些血液系统的疾病，如白血病、再生障碍性贫血等，造血干细胞移植是一种常用的治疗方法。
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法主要可以分为以下几类：
1. 最常见的方法为机械分离法，利用组织或细胞的物理性质进行分离。
例如在骨髓中分离造血干细胞时，可以利用胶体或其他分离物质将骨髓细胞进行分层，然后将不同层次的细胞进行分离。
2. 免疫选择法，利用单克隆抗体的特异性结合，将目标细胞从混合细胞中分离出来。
例如在胎盘组织中分离胚胎干细胞时，可以利用特异性的单克隆抗体识别胚胎干细胞表面的记号分子，然后利用磁性微珠等手段将这些细胞分离出来。
3. 化学处理法，利用化学或药物物质的特性，直接或间接地影响目标细胞的生长与分裂。
例如在胚胎干细胞的培养中，可以利用衍生自自然化合物的小分子化合物，来调控细胞的生长与分裂。
4. 细胞团块培养法，利用干细胞的自我复制和自我更新的特点，在培养基中形成球状细胞团，然后分离出内部细胞团中的干细胞。
例如在胚胎干细胞的分离中，可以将早期发育阶段胚胎的内细胞团分离出来进行培养。
以上是几种干细胞分离与培养方法的分类和简要介绍。
人骨髓造血干细胞的分离培养是一个复杂而重要的过程，涉及到细胞生物学、分子生物学和生物工程等多个领域。
以下是对该过程的详细描述，共计800字。
一、分离骨髓造血干细胞首先，我们需要从捐献者的骨髓中分离出造血干细胞。
通常，捐献者需要接受全身麻醉，然后在医生的监督下抽取一定量的骨髓。
抽取的骨髓样本经过处理后，会分离出造血干细胞和其他类型的细胞。
这一过程通常需要使用到离心技术，如密度梯度离心法。
二、培养造血干细胞分离出的造血干细胞需要在一个适合它们生长和分化的环境中进行培养。
实验室环境通常需要具备以下几个条件：1. 合适的营养物质：造血干细胞需要特定的营养物质来维持它们的生长和分化。
这些营养物质包括氨基酸、葡萄糖、维生素、矿物质和生长因子等。
2. 适合的pH值和渗透压：造血干细胞对环境的pH值和渗透压非常敏感。
过高的pH值或渗透压可能导致细胞死亡或停止生长。
3. 适合的温度：温度是影响细胞生长和分化的重要因素。
适宜的温度可以使造血干细胞保持最佳的分裂状态。
在培养过程中，造血干细胞会逐渐分裂并形成更多的细胞，同时也会分化为不同类型的血细胞，如红细胞、白细胞和血小板等。
为了确保造血干细胞的生长和分化，通常会使用一些细胞因子，如集落刺激因子（CSF）和红细胞生成素（EPO）等。
这些细胞因子可以刺激造血干细胞增殖并抑制其分化为非造血细胞。
三、观察和记录在培养过程中，我们需要密切关注细胞的生长状况，并定期进行观察和记录。
可以通过显微镜观察细胞的形态变化，测量细胞生长的速度和数量，以及检查细胞分化的程度。
通过这些观察结果，我们可以了解细胞的生长状态，及时调整培养条件，以确保造血干细胞的最佳生长。
四、提取和分析干细胞克隆当造血干细胞在适当的条件下生长和分化时，可能会形成独立的细胞克隆。
这些克隆可以用于进一步的研究和药物开发。
可以通过克隆培养、基因敲除、基因表达分析等方法对干细胞克隆进行深入研究。
这些研究可以帮助我们更好地了解造血干细胞的生理特性，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
一造血干细胞分离
（一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备
1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法
抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。
4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。
2 percoll液密度梯度离心法
①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。
4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。
取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。
②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。
吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。
3 Ficoll分离法
方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。
方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。
（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。
取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。
在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。
（二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。
去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。
收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。
（三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化
流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。
以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。
磁性标记CD34+细胞：在细胞悬液中加入100μL Fc - R阻滞剂, 再加入100μLCD34 磁珠标记细胞, 于4℃冰箱中充分混合孵育30 min。
用PBS 缓冲液洗涤细胞，离心10 min , 去上清液后再以500μL PBS缓冲液重新悬浮细胞。
MiniMACS磁性分离、纯化CD34+细胞：将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500μL PBS缓冲液漂洗。
以孔径30μm的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块, 细胞通过分离柱, 以500μL PBS 缓冲液冲洗3次。
将分离柱从分离器中移出并放置在合适的试管中, 于分离柱顶端滴注P BS 缓冲液 1 m L, 用分离柱配备的活塞加压将保留的细胞冲出。
重复磁性分离步骤，将洗脱的细胞移至一个新的漂洗过的MS分离柱洗涤，用500μL PBS 缓冲液洗脱保留的细胞。
二造血干细胞培养
1 粒-巨噬细胞集落生成单位(GFU-GM)培养（CD34+细胞的培养）
采用甲基纤维半固体培养基体系进行集落培养。
培养体系中含有50μg / L重组干细胞生长因子( rhSCF)、10μg / Lrh GM-CSF、10μg / L重组白细胞介素( rhIL) -3。
在1 mL培养体系中加入1×105个有细胞。
5 %CO2 , 37℃条件下培养14 d , 倒置显微镜下计数CFU-GM 集落数。
2 MNCs与HSCs的体外培养
（1）MNCs体外培养：用含10 %小牛血清的高糖DMEM培养基培养, MNCs以5×104个/ mL接种于24孔板中，每孔1 mL；(2)HSCs体外培养：用无血清高糖DMEM培养基，HSCs 以1×104个/ mL 接种于24孔板中。
细胞均置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。
3 由MNC制备基质细胞层
取新鲜分离的单个核细胞1×106培养于1ml含10%胎牛血清的IMDM中,置于24孔培养板中,于5%CO2,37℃饱和湿度的CO2孵育箱中,每7天半量换液1次,3周后培养孔底
铺满了基质细胞,去除悬浮细胞,用PBS洗2遍后,用含有EDTA的胰蛋白酶消化,1500RD
照射后将1x104/ml基质细胞移种于24孔板中,每孔1ml,继续培养2天备用。
4 由CD34+细胞制备基质细胞层
取新鲜分离的脐血CD34+细胞1x105培养于1ml无血清培养液(SCGM)中，加入细胞因子
FL+TPo+GM-IL-1+IL-6，细胞因子浓度为FL50ng/ml，TPO50ng/ml，GM一CSF、IL-1
和IL-6分别为10ng/ml，置于24孔培养板中，于5%CO2，37℃饱和湿度的CO2孵育箱中, 每7天半量换液1次，3周后培养孔底铺满了基质细胞，去除悬浮细胞，用PBS洗2遍后, 用含有EDTA的胰蛋白酶消化，1500拉德照射后将1xl了/ml基质细胞移种于24孔板中，每孔1ml，继续培养2天备用。
