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1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。
去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。
充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。
静置培养7天。
第8天根据生长情况，进行换液、传代。
2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。
用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。
3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。
1200rpm，离心6min，弃上清。
合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。
根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。
4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。
1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。
加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。
弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。
冻存细胞数应控制在2~5×106/ml 范围内。
利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。
人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【摘要】目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。
方法收集健康足月新生儿脐带组织，采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面抗原，将细胞冻存3个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特性。
结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高；细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达造血干细胞表型CD34、CD45等；冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。
结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞，为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。
%Objective To exploreisolating,culturing,identifying,freezing and thawing mesenchymal stem cells(MSCs)approach from Wharton j elly of human umbilical cord.Methods The MSCs were isolated from neonate umbilical cord,cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells,frozen 6 months, were thawed,then their biological characteristics were identified.Results MSCs were easily obtained from Wharton j elly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29,CD44,CD90 and CD105 positively,but negatively for CD34,CD45.The living cells of MSCs were 80%-90% after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.Conclusion MSCs can be successfully isolated from Wharton j elly of human umbilical cord by this method. The stem cells derived from Wharton j elly of humanumbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.【期刊名称】《河北医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P21-23)【关键词】脐带;间充质干细胞;胎血【作者】韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【作者单位】河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北石家庄 050082;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军第二六○医院病理科，河北石家庄 050041【正文语种】中文【中图分类】R394.2干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。
无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【摘要】目的用体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞.方法取1例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织块贴壁培养,使用无血清培养体系培养获得人脐带间充质干细胞.通过形态学观察,成脂、成骨、成软骨诱导分化能力检测及流式细胞术免疫表型检测进行鉴定.结果组织块贴壁培养6天后可见细胞从组织块边沿爬出;培养15天后,达到80％汇合,生长状况良好,细胞呈梭形,为典型的成纤维细胞形态,极性整齐排列,集落呈涡旋状,形态较均一.传代培养的第三代细胞CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,不表达CD34和CD45,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论无血清培养体系组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞法成功率高,其生物学特性稳定,并能消除由未确定的病原体引起的风险.【期刊名称】《皮肤病与性病》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】3页(P4-6)【关键词】脐带间充质干细胞;分离;贴壁培养【作者】张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【作者单位】昆明医科大学基础医学院,云南昆明650500;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101【正文语种】中文【中图分类】R392-33人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）是从人脐带组织中分离的间充质干细胞，具有增殖能力，如：神经元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞分化的能力，由于脐带体外细胞能迅速扩增，生物性能稳定，取材比较容易并且细胞来源相对广泛，在细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的前景，已经成为治疗的一种新的种子细胞来源[1、2]。
人脐带间充质干细胞操作规范一、人脐带间充质干细胞的分离和培养1.准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 XXX;2.在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精;3.将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血。
4.将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 XXX;5.将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿);6.用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿。
7.将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min。
8.弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中;9.以0.5 ml/瓶的量将胶体构造块接种至T75培养瓶，每瓶插手4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/mlbFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀;10.第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动);11.培养14天左右，倒去上清培养液，加心理盐水(3 ml/瓶)洗濯，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及构造块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化;12.收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min;13.弃上清液，插手适当心理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除构造块，即得到P0代脐带间充质干细胞;614.细胞计数，按10/瓶接种，每瓶插手10 ml脐带无血清培养液UltraCULTURE + 2% XXX 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液。
脐带间充质干细胞制备原理一、概述脐带间充质干细胞（Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种来源于新生儿脐带的干细胞。
与其他来源的干细胞相比，WJ-MSCs具有易于获取、无伦理争议、低免疫原性和多向分化潜能等优点，因此在临床应用中具有广泛的前景。
本文将就WJ-MSCs制备原理进行详细介绍。
二、脐带间充质干细胞的来源脐带是连接胎盘和新生儿的管道，其中包含了丰富的干细胞资源。
在脐带中，除了血液造血干细胞外，还存在着一种特殊类型的干细胞——脐带间充质干细胞。
这种干细胞主要存在于脐带Wharton's jelly （WJ）中，与周围组织隔离。
三、WJ-MSCs制备方法1. 脐带获取制备WJ-MSCs首先需要获取新生儿脐带组织。
通常情况下，在新生儿出生后不久即可进行采集。
采集过程中需要注意消毒和无菌操作。
2. 分离WJ组织将采集到的脐带组织进行分离，去除血管和外层膜等部分，得到WJ组织。
WJ组织是一种透明的胶状物质，通常呈现出白色或浅黄色。
3. 制备单细胞悬液将WJ组织切成小块，并加入胶原酶等消化酶进行消化。
消化后，用PBS等缓冲液洗涤多次，最后制备成单细胞悬液。
4. 培养和扩增将制备好的单细胞悬液接种在干细胞培养基中，并放置于37℃、5% CO2的培养箱内进行培养和扩增。
在培养过程中需要定期更换培养基，并对干细胞进行观察和评估。
5. 鉴定和纯化经过一段时间的培养，可以通过流式细胞术等方法对干细胞进行鉴定和纯化。
通常情况下，WJ-MSCs表达CD73、CD90、CD105等特征性标志物，并且不表达CD34、CD45等血液细胞特征性标志物。
6. 冻存经过纯化和鉴定后，WJ-MSCs可以进行冻存。
在冻存过程中需要使用特殊的冻存液，并在低温下保存。
四、WJ-MSCs的应用前景WJ-MSCs具有广泛的应用前景。
目前已经有多项临床试验显示，WJ-MSCs可以用于治疗多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病等。
干细胞提取和分离方法总结干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型能力的细胞，因其在再生医学和疾病治疗方面的巨大潜力而备受关注。
干细胞的提取和分离是开展干细胞研究的关键步骤，本文将总结几种常用的干细胞提取和分离方法。
1. 胚胎干细胞提取和分离胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)具有广泛的分化潜能，可以分化为体内所有的细胞类型。
目前，主要有两种方法用于胚胎干细胞的提取和分离：体外受精和体细胞核移植。
- 体外受精方法：该方法从捐赠人体内获取受精卵，通过体外培养获得兔囊胚，并将兔囊胚的内质体提取出来，形成胚胎干细胞系。
这种方法可以大规模获取胚胎干细胞，但受到伦理等因素的限制。
- 体细胞核移植方法：该方法通过将一个成体细胞的细胞核移植到一个空卵子中，得到克隆胚胎。
然后从克隆胚胎中提取胚胎干细胞。
这种方法可以避免使用受精卵，但技术难度较大且效率较低。
2. 间充质干细胞提取和分离间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)存在于骨髓、脐带血、脂肪组织等多种组织中，具有自我更新和多向分化能力。
提取和分离间充质干细胞的方法主要有以下几种：- 骨髓采集法：该方法通过穿刺骨髓髓腔，用针收集骨髓组织，然后经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。
这种方法具有高效、简便的优点，但操作有一定难度。
- 脐带血提取法：该方法通过脐带血采集脐带中的干细胞，经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。
相较于骨髓采集法，脐带血提取法更为简单和无创，但提取的间充质干细胞数量和质量较低。
3. 诱导多能干细胞提取和分离诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是通过使用转录因子或化学物质将成熟的体细胞重新编程为干细胞的一种方法。
主要有两种方法用于诱导多能干细胞的提取和分离：细胞外基质和转录因子。
- 细胞外基质法：该方法在细胞培养基内添加适当的细胞外基质，提供合适的生长环境，帮助细胞重新获得干细胞特性。
脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养陈 镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王 玲3,陆 华3,吴智远2,芦 奕2(1.天津医科大学,天津,300070; 2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019;3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006)摘 要:目的 研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(M S Cs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。
方法 无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esen cult T M 作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测M SCs 表面抗原。
结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达M SCs 相关的抗原(CD 29、CD 44、CD 166),但不表达造血细胞抗原(CD 34、CD 45),这与源于骨髓的M SCs 一致。
结论 脐带血来源的M SCs 能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。
关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养中图分类号:R 329 2 文献标识码:A 文章编号:1672 2353(2004)01 0012 03THE ISOLATION PURIFICATION ANDCULTURE OF HUCA MSCsCHEN Lei,HUI Guo zen,RUAN Wen zong,MIAO Zong ning,WANG Ling,LU HUA,W U Zhi yuan,LU Li(1.T ianj in M edical Univer sity ,T ianj in,300070;2.Cell Dep ar tment,T hir d H osp ital of W ux i ,W ux i ,Jiangsu ,2140001;3.Dep ar tment of Neurosur gery ,First A f f iliated H osp ital of Suz houUniversity ,Suz hou,Jiangsu ,215006)ABSTRAC T Objective:To investig ate the isolation,purification and culture of hum an umbilical cord blood(HUCB)mesenchymal stem cells(M SCs)in vitro,and to observe the feasibility of using M SCs as seed cells in experiment and clinic.Methods:HUCB w ere collected from full term deliveries scheduled for cesarean section,all specimens w as obtained sterilely w ith preservative free heparin,the cord blood mononuclear cell w as isolated by lymphocyte separation medium,and puri fied and culture with M esencult T M medium and acidic environment to produce adherent layer,the surface antig en ex pression of MSCs was detected by flow cytometry.Results:The UCB derived mononuclear cells,when set in culture,gave rise to adherent cells,w hich ex hibited either an osteo clast or mesenchym al like phenoty pe,cells w ith the M SCs displayed a fibroblast like morpholog y and ex pressed several MSCs related antigens (CD 29,CD 44,CD 166),but did not ex press haematopoi etic cells antigens(CD 34,CD 45),which w as identical to human bone marrow derived M SCs.C on clusion:M SCs in H UCB can culture and expand in vitro,which could be regarded as an alternative source of MSCs for experimental and clinical needs.KEY WORDS umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;culture in v itro脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchy mal stem收稿日期:2003-12-16基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271325)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2001170)作者简介:陈镭(1965-),男,天津市人,在读博士研究生。
12实用临床医药杂志Journal of Clinical M edicine in Practice2004年第8卷第1期cells,M SCs)。
脐血间充质干细胞作为一种具有全能干细胞特点的细胞,为中胚层发育的早期细胞,具有多向分化潜能,其形态和生物学特点与骨髓源性M SCs相似。
国内外已有大量的实验证实骨髓间充质干细胞不仅能分化为造血实质,支持造血,还可向中胚层和外胚层来源的组织分化,在一定的实验条件控制下可分化为肌细胞[1]、成骨细胞[2,3]、脂肪细胞[4]、神经细胞[5]、肝细胞[6]、心肌细胞[7]等。
由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能,且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势,故寻找一种能替代骨髓MSCs,并可弥补其缺陷的间充质干细胞,已成为各国学者研究的热点。
目前研究证实脐血中存在的间充质干细胞在一定条件下进行体外培养和诱导分化后也能成为神经细胞[8,9](神经元和神经胶质细胞)、心肌细胞[10]等,可作为细胞治疗的新的种子细胞和基因治疗的新的载体细胞。
与骨髓相比,脐血有更充足的来源,脐血的免疫原性较弱,能耐受更大程度上的H LA配型不符,其M SCs更为原始,扩增能力更强,故脐血干细胞的作用越来越突出,可作为一种新的替代细胞来源用于各系统疾病的细胞移植及基因治疗。
1 材料与方法1 1 脐血的收集和单个核细胞的分离无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血40 ~60ml,肝素浓度为20U/m l抗凝。
所有样本均于采集后12h内分离。
用Hank s平衡盐溶液1 1稀释、混匀,叠加于Ficoll H ypaque上,相对密度为1 077g/L,稀释血与Ficoll Hypaque液的柱高比为2 1,以2000r/m in离心20m in,取界面层的单个核细胞,加H ank s平衡盐溶液离心、洗涤2次,加入培养基中,调整细胞浓度106/ml左右。
1 2 细胞的培养、纯化及扩增培养基采用Mesencult T M培养液(Stem Cell 公司),并调整其pH值偏酸性,加入1%Pen strep(Gibco,Grand Island,NY),将细胞分装于25T培养瓶中,置于37 、饱和湿度、体积分数为5%CO2的培养箱培养48~72h后,更换培养液,弃去未贴壁的细胞,根据细胞生长情况,每3~5d 半量换液1次。
待细胞达到80%~90%融合时,用1 1的2 5g/L胰蛋白酶和0 2g/L EDTA混合液消化,然后按2 1的比例进行传代接种培养,并记为P1代。
传代培养过程中每3d半量换液,直至贴壁细胞彼此融合、铺满瓶底,再重复上述操作,传代培养记为P2代,余类推。
1 3 流式细胞仪检测取P3代脐血MSCs,去掉培养液,PBS洗2遍,用1 1的2 5g/L胰蛋白酶和0 2g/L EDTA 混合液消化,用含2%BSA的PBS洗涤后制成浓度为106/ml的单细胞悬液,与抗CD29、CD44、CD166、CD34、CD45抗体(Phar Mingen)室温反应30min。
PBS洗涤2次后与FITC标记的二抗避光反应15min。
细胞洗涤后悬浮于PBS中,流式细胞仪检测。
2 结 果2 1 脐血M SCs的分离与体外培养该研究中建立了M SCs分离及体外纯化、扩增的方法。
即以Ficoll H ypaque液梯度离心,从脐血中分离单个核细胞,将之接种于偏酸性的间充质干细胞培养基(Mesencult T M)中,48~72h 后出现贴壁的间充质样细胞,并有集落形成,同时有大量的破骨样细胞混杂(图1)。
破骨样细胞胞体较大,多个核,圆形。
M SCs为成纤维样的长梭形细胞,单个核,有较长的突起,折光性强。
随着在条件培养基的环境下培养,4~5周后细胞生长达80%~90%融合。
传至P3代后,大部分细胞(包括破骨样细胞)逐渐被去除,剩下形态较为单一的成纤维样细胞,即为脐血源性的MSCs(图2),形态上类似于骨髓MSCs,将这些细胞再次传代培养,1~2周左右可达到融合,并表现出较强的传代扩增能力。
2 2 MSCs表面抗原特性流式细胞仪检测结果显示:脐血MSCs均稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD166,但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45,这与源于骨髓的MSCs的表面抗原标记相一致。
3 讨 论目前,对于脐血M SCs的存在及能否传代扩增,仍有较大争议[11]。
而其在体外培养过程中,由于破骨样细胞的存在,能否得到较为均一的MSCs,也成为制约脐血M SCs应用的障碍。
本实验旨在为脐血MSCs体外分离、纯化、扩增,探索一条更为有效、可行的途径。
所选用的13第1期陈 镭等:脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养图1 细胞接种24h后相差显微镜所见40图2 细胞接种2周后相差显微镜所见 40M esencult TM培养基提供了M SCs最佳的生长条件,能促进脐血M SCs增殖,保持其未分化状态,抑制其它贴壁细胞生长。
