实验十四血清胆固醇测定(胆固醇氧化酶法)

生物化学与分子生物学设计实验（胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法测定血清尿素）小组成员：班级：麻醉11-2班日期：2012年12月19胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇及二乙酰一肟法测定血清尿素实验目的1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。

2、学习用比色法测定血清尿素。

3、巩固有关胆固醇和尿素的知识。

4、进一步熟练UV2100型分光光度计的重点、难点：重点：1、氧化酶法测定总胆固醇的原理2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项难点：氧化酶法测定总胆固醇的原理一、实验原理（一）氧化酶法测定血清总胆固醇血清总胆固醇(TC)包括：游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。

本实验是胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。

第一步：血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸 (FFA) 。

第二步：胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和H2O2。

第三步：H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中TC含量成正比。

（二）二乙酰一肟法测定血清尿素二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。

因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。

二、操作步骤（一）氧化酶法测定血清总胆固醇终点法检测TC，取试管3支按下表依次加样。

酶法测定TC操作步骤混匀后，37℃保温10 min，每管加3ml水混匀，用分光光度计比色，于500 nm波长处以空白管调零，读出各管吸光度。

（二）二乙酰一肟法测定血清尿素取试管3支，按下表依次加样。

二乙酰一肟法操作步骤混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，以空白管调零，在540nm处读取各管吸光度。

三、注意事项（一）氧化酶法测定血清总胆固醇1、最后加酶试剂，各管反应时间应一致；2、比色应在30min内完成；3、试管在操作前尽量保持干燥；4、试剂中酶的质量影响测定结果；5、若需检测游离胆固醇浓度，将酶试剂成分中去掉胆固醇酯酶即可。

实验十四血清胆固醇测定（胆固醇氧化酶法）胆固醇地测定方法很多；通常可分为化学试剂比色法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法五大类.化学试剂比色法中有直接法和间接法；前者可用血清直接测定，后者是用溶剂或其它方法提取胆固醇后再作定量.酶法由于操作简便、结果准确，试剂无腐蚀性，而且因使用特异性酶，大大减少了血液中其它成分地干扰，目前已成为测定胆固醇地主要方法.【目地】．了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇地原理，能进行血清胆固醇测定地操作..掌握血清胆固醇测定地临床意义.【原理】血清中总胆固醇（）包括胆固醇酯()和游离型胆固醇(),酯型占，游离型占.胆固醇酯酶（）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（），胆固醇在胆固醇氧化酶（）地作用下氧化生成Δ胆甾烯酮和过氧化氢.后者经过氧化物酶（）催化氢与氨基安替比林（）和酚反应，生成红色地醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇地含量呈正比，在波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇地含量.反应式如下：CEH胆固醇酯胆固醇 ＋ 脂肪酸胆固醇 ＋ O2△4-胆甾烯酮 ＋ HO22POD2H2O2 ＋ 4-氨基安替比林 ＋ 酚红色醌亚胺【器材】试管、吸管、试管架、微量加样器、恒温水浴箱、分光光度计.【试剂】酶法测定胆固醇多采用市售试剂盒.. 酶应用液胆固醇酶试剂地组成为：磷酸盐缓冲液胆固醇酯酶≥胆固醇氧化酶≥过氧化物酶≥氨基安替比林苯酚此外还含有胆酸钠和，胆酸钠是胆固醇酯酶地激活剂，表面活性剂能促进脂蛋白释放胆固醇和胆固醇酯，有利于胆固醇酯地水解.．（）胆固醇标准液精确称取胆固醇溶于无水乙醇，移入容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度(也可用异丙醇等配制).【操作】取试管支，编号，按下操作.表酶法测定血清胆固醇操作步骤加入物（）测定管标准管空白管血清－－胆固醇标准液－－蒸馏水－－酶应用液混匀后，℃水浴保温分钟，在波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度.【计算】血清胆固醇 (mmol/L) ＝ 测定管吸光度标准管吸光度× 5.17【注意事项】. 黄疸血清过高地胆红素可还原—部分反应中地，降低显色反应，使结果偏低.但测定胆固醇，胆红素对酶法地干扰比化学法小.. 用胆固醇标准液引起地误差较大，故目前提倡采用胆固醇定值血清为标准.. 轻度溶血对测定结果无影响，但明显溶血可使结果增高，此时可用一个不加地空白管从结果中减去后纠正.. 其它影响因素，如维生素、谷胱甘肽、氟化物引起负偏差.【正常参考范围】～【临床意义】.血清胆固醇增高常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症、糖尿病、肾病综合征、胆管阻塞、甲状腺功能减退..血清胆固醇降低常见严重贫血、甲状腺功能亢进、长期营养不良等.【结果及分析】【思考题】．胆固醇有哪些重要地生理功能，血清胆固醇升高对机体最严重地危害是什么？．胆固醇在体内可转变为哪些物质，如何排泄？．实验中需要哪几种酶参加，各有什么作用？。

胆固醇氧化酶法原理胆固醇氧化酶法原理《胆固醇氧化酶法原理》一、什么是胆固醇氧化酶法胆固醇氧化酶法是一种用测定血清胆固醇的方法，也被称为“多元素检测法”，这一方法即可测定血清中胆固醇的总量，也可以测定其子物质的部分分离，即高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。

胆固醇氧化酶法是受到酶反应活化，通过酶转化成有机酸形式而测定血清胆固醇的氧化酶法，是用氨基苯肼抑制非特异性磷酸酶让胆固醇被脂解之后，利用磷酸及3,5-二聚体酶对胆固醇和胆汁酸进行氧化反应，最终形成硝基苯并测定浓度，以计算出总血清胆固醇浓度。

由于本方法的胆固醇检测结果的准确性高，经久耐用，因此，胆固醇氧化酶法成为血清胆固醇测定的标准方法。

二、胆固醇氧化酶法的基本步骤1. 胆固醇氧化酶法的基本步骤首先，将血清样本添加限速剂（具有特定阈值的抑制剂），以抑制非特异性酶，该限速剂最常见的有保护剂、扩散样品，以及羧基化限制剂。

2. 第二步，加入胆固醇特异性酶，在室温下反应，使胆固醇被氧化酶分解，胆固醇和胆汁酸氧化后形成的产物经乙酰化形成硝基苯，荧光强度与硝基苯浓度成正比。

3. 第三步，检测硝基苯浓度，用荧光仪检测出硝基苯，把荧光浓度和标准曲线比较后可得到测定结果。

三、胆固醇氧化酶法校准和报告1. 校准：确定胆固醇浓度或临床报告值均需进行校准，以确保检测结果的准确性。

其基本方法有：用高低精密度含胆固醇空白和标准品，构成曲线，计算比值，确定回归方程。

校准得到的回归方程，可以将测定值转换成临床报告值。

2. 报告：根据确定的报告值，报告结果，为实验报告人根据样本状态和健康状况提供遗传学和健康建议。

本文介绍了胆固醇氧化酶法的原理，比较详细的介绍了其基本步骤，以及校准和报告的方法。

胆固醇氧化酶法是一种受酶反应活化，有效测定血清胆固醇的氧化酶法，准确性高，广泛应用于临床分析实验中。

血清总胆固醇测定实验报告一、实验目的血清总胆固醇（Total Cholesterol，TC）测定是临床生化检验中的常见项目之一，本实验旨在掌握血清总胆固醇测定的原理、方法和操作步骤，熟悉实验过程中的注意事项，并对实验结果进行准确分析和判断。

二、实验原理目前，血清总胆固醇测定常用的方法是酶法。

其原理是胆固醇酯酶（CE）将胆固醇酯水解为游离胆固醇（FC）和脂肪酸，胆固醇氧化酶（COD）将 FC 氧化为胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶（POD）的催化下与 4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应生成红色醌亚胺。

在一定波长下，通过比色法测定吸光度，从而计算出血清总胆固醇的含量。

三、实验材料与设备1、材料血清样本：新鲜无溶血、无脂浊的血清。

试剂盒：包含胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、酚等试剂。

2、设备分光光度计移液器恒温水浴箱离心机四、实验步骤1、样本处理空腹采集静脉血，置于干燥无抗凝剂的试管中，室温下静置 30 分钟使其凝固。

以 3000 转/分钟离心 10 分钟，分离血清，备用。

2、试剂准备按照试剂盒说明书的要求，将试剂 R1 和试剂 R2 分别配制好，并放置于恒温水浴箱中预热至规定温度。

3、测定操作取两支干净的比色管，分别标记为空白管和测定管。

空白管中加入蒸馏水20μL 和试剂R1 1000μL，混匀，置于 37℃恒温水浴箱中保温 5 分钟。

测定管中加入血清样本20μL 和试剂R1 1000μL，混匀，置于 37℃恒温水浴箱中保温 5 分钟。

然后，向空白管和测定管中分别加入试剂R2 500μL，混匀，置于37℃恒温水浴箱中保温 10 分钟。

4、比色测定以空白管调零，在分光光度计 500nm 波长处读取测定管的吸光度值（A）。

五、实验结果计算血清总胆固醇（mmol/L）＝（测定管吸光度空白管吸光度）×校准品浓度÷校准管吸光度六、实验结果本次实验测定的血清总胆固醇结果为_____mmol/L。

第1篇一、实验目的本次实验旨在通过血液检测，了解受试者的血胆固醇水平，分析其胆固醇组成，并探讨血胆固醇水平与个体健康状况之间的关系。

二、实验原理胆固醇是人体内一种重要的脂质，分为高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）两种。

HDL-C被称作“好胆固醇”，对心血管有保护作用；而LDL-C被称作“坏胆固醇”，长期偏高会增加心血管疾病的风险。

本次实验采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定受试者的血胆固醇水平。

三、实验材料1. 试剂：胆固醇测定试剂盒（ELISA法）、标准品、酶联反应板、洗涤液、底物、终止液、显色剂等。

2. 仪器：酶标仪、移液器、微量加样器、振荡器等。

3. 样品：受试者空腹静脉血。

四、实验方法1. 样品处理：将受试者空腹静脉血采集后，按照试剂盒说明书要求，分离血清。

2. 标准曲线绘制：将标准品按照试剂盒说明书要求，依次加入酶联反应板孔中，加入底物，避光反应一定时间后，加入终止液，在酶标仪上测定吸光度（OD值），以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品测定：将受试者血清按照试剂盒说明书要求，依次加入酶联反应板孔中，加入底物，避光反应一定时间后，加入终止液，在酶标仪上测定OD值。

4. 结果计算：根据标准曲线，计算受试者的血胆固醇水平。

五、实验结果1. 标准曲线：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：Y=0.065X-0.013，相关系数R²=0.998。

2. 受试者血胆固醇水平：受试者A的血胆固醇水平为5.2mmol/L，其中HDL-C为1.5mmol/L，LDL-C为3.7mmol/L；受试者B的血胆固醇水平为6.8mmol/L，其中HDL-C为1.8mmol/L，LDL-C为5.0mmol/L。

六、分析与讨论1. 实验结果显示，受试者A的血胆固醇水平为5.2mmol/L，属于正常范围；受试者B的血胆固醇水平为6.8mmol/L，属于偏高范围。

实验二 血清胆固醇含量的测定的实验报告实验目的：学会利用氧化酶法测定血清胆固醇含量的原理和方法。

实验原理：血清胆固醇由游离胆固醇（30%）和胆固醇酯（70%）组成。

血清胆固醇经酯化酶水解后，生成游离胆固醇和脂肪酸；在胆固醇氧化酶的作用下，游离胆固醇产生的H 2O 2与4-氨基安替比林和DHBS 反应生成微红色的醌亚胺。

醌亚胺在520nm 有特异吸收，反应产生的颜色与胆固醇含量成正比。

胆固醇酯+ H 2O−−−→−胆固醇酯酶胆固醇+脂肪酸 胆固醇+O 2−−−−→−胆固醇氧化酶△4胆甾烯酮+ H 2O 2 H 2O 2+4-氨基安替比林+DHBS−−−→−过氧化物酶醌亚胺+ H 2O 实验步骤：1、取2支试管分别加入0.2mL 的血清和标准胆固醇溶液，并分别标注为“H ”和“SH ”试管。

往每支试管加入0.2mL 的沉淀剂，在室温下静置15min ，用2000rad/min 的离心机分离10min 。

2、准备5支试管分别标注为“T ”（总胆固醇）、“H ”（高密度脂蛋白胆固醇）、“ST ”（标准总胆固醇）、“SH ”（标准高密度脂蛋白胆固醇）、“B ”（空白实验）。

按照下表准备各支试管：（标准胆固醇浓度为50mg/dL ）3、准备好以上试管后，充分混合并在37。

的温度下放置20min ，用波长520nm 的分光光度计测量各支试管的吸光度值。

实验结果： 计算公式：总胆固醇=ST T 吸光度值吸光度值×02.01.0×50高密度脂蛋白胆固醇=SHH吸光度值吸光度值×50代入数据得：总胆固醇=252.0167.0×02.01.0×50=165.7（mg/dL ）高密度脂蛋白胆固醇=430.0605.0×50=70.3（mg/dL ）。

血清总胆固醇的测定实验报告胆固醇是人体内一种重要的脂质物质，它在维持细胞膜的完整性、合成激素和胆汁酸等方面发挥着重要作用。

然而，过高的血清总胆固醇水平会增加心脑血管疾病的风险。

因此，及时测定血清总胆固醇水平对于预防和治疗心脑血管疾病具有重要意义。

本实验旨在通过测定血清中总胆固醇的含量，掌握其测定方法，并了解不同因素对血清总胆固醇含量的影响，为临床诊断和研究提供参考。

1. 实验原理。

本实验采用酶法测定血清总胆固醇含量。

首先，将血清样本与试剂中的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶发生反应，将胆固醇酯水解成游离的胆固醇和脂肪酸，然后游离的胆固醇与试剂中的胆固醇氧化酶再次发生反应，生成过氧化物酶，最终生成带有颜色的化合物。

通过测定产生的有色产物的光密度，即可计算出血清中总胆固醇的含量。

2. 实验步骤。

（1）取适量血清样本，离心沉淀，取上清液备用。

（2）将标准品和上清液分别加入反应管中，加入试剂A和试剂B，混匀后放置37℃恒温水浴中反应一定时间。

（3）加入硫酸后，混匀放置10min，再加入试剂C混匀后放置2min。

（4）测定吸光度值，并根据标准曲线计算出血清总胆固醇的含量。

3. 实验结果。

通过实验测定，得出不同血清样本中总胆固醇的含量分别为X mg/dL、Ymg/dL和Z mg/dL。

根据实验结果，我们可以得出……（根据实验结果进行分析和讨论）。

4. 实验结论。

本实验通过酶法测定了血清中总胆固醇的含量，结果表明……（根据实验结果进行结论）。

5. 实验注意事项。

（1）在实验过程中，要注意血清样本的保存和处理，避免样本受到污染或变质。

（2）在试剂配制和使用过程中，要按照相关操作规程，严格控制试剂的质量和使用量。

（3）实验操作过程中，要注意实验室安全，避免发生意外。

6. 实验意义和应用。

本实验方法可以准确测定血清中总胆固醇的含量，为临床诊断和研究提供了重要的参考数据。

同时，也为进一步研究血清总胆固醇与心脑血管疾病的关系提供了实验基础。